Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

Het algemene doel van dit experiment is om de efficiëntie van de generatie van mutant vaccinia-virus te verbeteren door gebruik te maken van CRISPR-Cas9-technologie. Deze methode kan helpen om nieuwe vaccinia-virusvectoren te creëren voor biologisch onderzoek en medisch onderzoek, in het bijzonder voor gentherapie en vaccinatie. Virale demonstratie met deze methode is cruciaal, omdat het identificeren en oppikken van positieve plaques moeilijk uit te voeren is.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de efficiëntie in het maken van onze mutant vaccinia-virus aanzienlijk verbetert. Begin met geoogste CV-1-cellen, pas hun concentratie aan tot 100.000 cellen per milliliter. Zaai vervolgens twee milliliter van de suspensie in elk putje van een zes-putjesplaat voor transfectie.

De volgende dag, transfecteer de cellen met 0,5 nanogram gRNA-N2 plasmide en 0,5 nanogram pSTCas9 plasmide. Bewaar ze vervolgens gedurende 24 uur. 24 uur later, vervang het medium.

Bereid vervolgens het VVL15-virus voor. Verdun het backbone VVL15-virus met DMEM tot 200.000 PFU per milliliter. Voeg vervolgens 100 microliter van het verdunde virus toe aan elk putje van de getransfecteerde CV-1-cellen.

Twee uur later, transfecteer de cellen met één microgram van de shuttle donorvector voor expressie van HR, en bewaar de cellen gedurende 24 uur. De volgende dag, verwijder de getransfecteerde CV-1-cellen met een celschraper. Verzamel vervolgens de celsuspensie in een cryovial en bewaar deze bij min 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik.

Om de eerste ronde van het zuiveren van de gemodificeerde VV te beginnen, zaai 15 zes-putjesplaten met 300.000 ongemodificeerde CV-1-cellen per putje. De volgende dag, ontdooi de bevroren suspensie van getransfecteerde CV-1-cellen bij 37 graden Celsius gedurende drie minuten, en vortex de suspensie vervolgens krachtig gedurende 30 seconden om de cellen te lyseren. Verdun vervolgens één microliter van het lysaat met drie milliliter DMEM.

Voeg een halve milliliter van deze verdunning toe aan elk putje van ongemodificeerde CV-1-cellen. Plaats vervolgens de platen gedurende twee dagen terug in de incubator. Twee dagen later, identificeer RFP-positieve plaques met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Ze kunnen worden opgemerkt met een 10X objectief. Zodra ze zijn geïdentificeerd, label de plaques nauwkeurig onder de plaat met een stift. Bereid nu een cryovial voor die 200 microliter serumvrij DMEM bevat voor elke positieve plaque die moet worden geoogst.

Vervolgens is het belangrijk om al het medium uit de putjes met gelabelde plaques te aspireren. Gebruik vervolgens een 200 microliter pipettenset om 30 microliter te aspireren, laad deze gedeeltelijk met 10 microliter van het medium uit de cryovial, en schraap vervolgens de plaque en zuig de cellen op met de resterende aspiratie. Spuit dit in de cryovial en herhaal deze procedure nog twee keer, met als doel dezelfde RFP-positieve plaque te treffen om zoveel mogelijk cellen te verzamelen.

Bewaar de verzamelingen bij min 80 graden Celsius of, als de tweede ronde van zuivering onmiddellijk moet worden uitgevoerd, bevries de cryovials gedurende 10 minuten op droog ijs. De tweede ronde van het zuiveren van de gemodificeerde VV wordt op dezelfde manier uitgevoerd als de eerste met behulp van de bevroren cellen uit de eerste ronde. Er kunnen echter meer dan zes RFP-positieve plaques worden geselecteerd voor elke RFP-positieve lijn.

Herhaal het selectieproces totdat alle plaques die zijn gevormd uit één positieve plaque RFP-positief zijn, wat aangeeft dat de plaque puur is, wat extra drie tot vijf rondes kan duren. Een dag van tevoren, bereid een zes-wandplaat voor met een half miljoen CV-1-cellen per putje. De volgende dag, ontdooi de bevroren gezuiverde plaque bij 37 graden Celsius gedurende drie minuten.

Vortex vervolgens de plaque krachtig gedurende 30 seconden om een lysaat te maken. Voeg alle lysaat, inclusief de celresten, toe aan een putje van CV-1-cellen, en bewaar de plaat gedurende drie dagen. Gebruik de andere vijf putjes niet.

Inspecteer de cellen dagelijks onder een microscoop. Wanneer meer dan de helft van de cellen cytopathisch lijkt, oogst de geïnfecteerde cellen. Idealiter zouden alle cellen cytopathisch moeten zijn.

Gebruik een celschraper om de cellen in een 15-milliliter buis met kweekmedium te verzamelen. Pel de cellen vervolgens bij 300g gedurende drie minuten. Gooi het supernatant weg en ga verder met PCR om de modificatie van de mutante VV te verifiëren, of bewaar het cellenpellet bij min 80 graden Celsius om dit later te doen.

De beschreven methode verbetert de recombinatiefrekwensiever meer dan 100 keer vergeleken met conventionele protocollen. Bijvoorbeeld, de VV N1LG werd gericht voor modificatie. Zoals beschreven, werden plasma's die Cas9 expresseerden, en een N1L-specifiek gRNA, geco-transfecteerd in de CV-1-cellen om hun efficiëntie voor homologe recombinatie te verbeteren.

Een dag na transfectie werd RFP geëxpresseerd in de CV-1-cellen. Vervolgens werden CV-1-cellen geïnfecteerd met de volledige lysate uit de homologe recombinatie. Zowel RFP-positieve als negatieve plaques werden waargenomen in de CV-1-cellen.

Volgens het zuiveringsprotocol werd een zuivere recombinant verkregen. Alle plaques na infectie met de cellysaat afgeleid van een zuivere plaque met het mutante vaccinia-virus vertoonden een RFP-signaal. PCR werd gebruikt om de deletie van het gerichte gen te verifiëren.

Het gemodificeerde virus toonde een positief signaal voor RFP, en geen signaal voor N1L, in tegenstelling tot de intacte N1L-controle. Alle waren positief voor het niet-gerichte gen A52R. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u snel een nieuw vaccinia-virusvector kunt maken.

Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 10 dagen worden uitgevoerd als deze go