Name: Een efficiënte methode om gededifferentieerde Fat cellen te verkrijgen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Leer een efficiënte celkweekmethode voor het genereren van gedifferentieerde vetcellen (DFAT) met verbeterde groeimedium. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar regeneratieve geneeskunde en weefselengineering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het Programma voor het Creëren van Start-ups uit Geavanceerd Onderzoek en Technologie (START-programma) van de Japan Society for the Promotion of Science (ST261006IP, TM) en door het Programma voor Strategisch Onderzoeksfonds aan Particuliere Universiteiten (2014-2019) (S1411018, TM) van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie.

Monsters van menselijk onderhuids vet werden verkregen van patiënten die een chirurgische ingreep in de afdelingen plastische chirurgie, urologie, Pediatrische Chirurgie en Orthopedie van Nihon University Itabashi Hospital (Tokyo, Japan). De patiënten gaven schriftelijk informed consent, en de ethische commissie van Nihon University School of Medicine ingestemd met de studie. 1. Tissue Voorbereiding <ol><li> Breng het weefselmonster van de operatiekamer naar het laboratorium. </li><li> Wassen 1-2 g vetweefsel met 5 ml PBS (-) bij kamertemperatuur (KT) eenmaal in een 50 ml buisje en plaats het monster in een 10 cm plastic schaaltje. </li></ol> 2. Collagenase Spijsvertering <ol><li> Verwijder het monster uit de PBS (-) toegevoegd, waarna 10 ml steriel 0,1% (w / v) oplossing collagenase (collagenase type II) het schaaltje met het weefselmonster. </li><li> Gehakt het weefsel met chirurgische schaar ongeveer 15 minuten, totdat een gepureerd bestaan ​​bereiktrantie. </li><li> Vervolgens verteren gehakt weefsel in 0,1% (w / v) collagenase oplossing bij 37 ° C gedurende 30 min (60 rpm) in een 50 ml buis met zacht schudden op een schudder. </li><li> Filtreer het gedigereerde monster door een 100 urn filter in een 50 ml buis. Daarna worden 10 ml DCM (zie tabel of Materials) aangevuld met 2% FBS door het filter. </li></ol> 3. Cel Isolatie <ol><li> Centrifugeer de gefilterde cellen bij 100 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur. </li><li> Op dit moment bereiden 5 ml DCM aangevuld met 2% FBS in een 50 ml buis. </li><li> Vervolgens stellen de drijvende vetcellen met behulp van een 1000 ui pipet en voeg de cellen om een ​​50 ml buis met medium. </li><li> Vervolgens schud de 50 ml buis zachtjes aan de DCM medium met de cellen te mengen. </li><li> Vervolgens centrifugeer de buis bij 100 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur. </li><li> Gooi het medium bij de bodem van de buis met een 18 G naald en een 20 ml spuit. </li><li> Voeg vervolgens 10 ml DCM supplemented met 2% FBS aan de cellen verzameld. </li><li> Meng de DCM met de cellen door schudden van de 50 ml buis voorzichtig. </li><li> Centrifugeer de buis bij 100 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur. </li></ol> 4. Plating Cellen <ol><li> Voeg 41 ml DCM of DMEM aangevuld met 20% FBS tot een 12,5 cm kolf. </li><li> Dan worden op een 200 ul pipet voeg 40 ul van vetcellen aan de kolf. </li><li> Vervolgens vul de kolf met DCM of DMEM aangevuld met 20% FBS. Kritische stap: Op dit punt, ervoor te zorgen dat de cellen liggen verspreid over het medium. Controleer visueel de vrijstaande cellen en daarna houden de kolf op het deksel van een ronde petrischaal om het plat te houden. </li><li> Tenslotte zet de kolf in de couveuse en laat het ongestoord in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 7 dagen. </li><li> Na een week van incubatie, draai de fles en controleer DFAT cellen. Vervolgens beoordeelt DFAT cel generatie vaardigheid zoals beschreven 10 omdat op dit punt fibroblast-achtige cellen (DFAT cellen) bevinden zich in de regio&#39;s verschillend van vetcellen. </li><li> Voeg 5 ml DCM of DMEM aangevuld met 20% FBS aan de fles na verwijdering van de vorige celkweekmedium. Laat de DFAT cellen om te groeien voor nog een week na het wijzigen van het medium. </li><li> Met behulp van een cel teller, tel het aantal DFAT cellen die onder verschillende celcultuur condities (DCM vs. DMEM). </li></ol>

<ol><li>Lanzoni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+clinical+programs+of+stem+cell+therapies+for+liver+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas.</a> Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).</li>
<li>de Girolamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%3A+a+new+%22cells+as+drugs%22+paradigm.+Efficacy+and+critical+aspects+in+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy.</a> Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).</li>
<li>Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+adipose+stem+cells+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">The potential of adipose stem cells in regenerative medicine.</a> Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).</li>
<li>Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+a+treatment+for+peripheral+arterial+disease%3A+current+status+and+potential+impact+of+type+II+diabetes+on+their+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy.</a> Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).</li>
<li>Ringden, O., Keating, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+as+treatment+for+chronic+GVHD%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD.</a> Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).</li>
<li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+cells+exhibit+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential.</a> J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+adipose+stem+cells+through+dedifferentiation+of+mature+adipocytes+in+ceiling+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures.</a> J. Vis. Exp. (97), (2015).</li>
<li>Lessard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dedifferentiating+human+mature+adipocytes+from+the+visceral+and+subcutaneous+fat+compartments%3A+fibroblast-activation+protein+alpha+and+dipeptidyl+peptidase+4+as+major+components+of+matrix+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling.</a> PLoS One. 10 (3), 0122065(2015).</li>
<li>Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeng%2C+X+%22Biomed.+Res.+Int%22">Biomed. Res. Int</a>. 2015, 673651(2015).</li>
<li>Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+properties+of+feline+dedifferentiated+fat+cells+and+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells.</a> Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).</li>
<li>Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+the+new+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: the new patient.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Volwassen adipocyten dat ondergaan in vitro dedifferentiatie, een proces dat bekend staat als het plafond cultuur, kan terugkeren naar een meer primitieve fenotype en krijgen proliferatieve capaciteiten. Deze cellen worden aangeduid als gededifferentieerde vet (DFAT) cellen. De multilineage differentiatiepotentiaal van DFAT cellen werd geëvalueerd. Flow cytometrie analyse en genexpressie analyse bleek dat DFAT cellen zeer homogeen vergeleken met ASC 6. In feite, de cel-oppervlakte-antigeen profiel va...

Celtherapie en tissue engineering zijn hot topics op het gebied van regeneratieve geneeskunde 1-5. Hoewel deze therapeutische modaliteiten zijn veelbelovend, een aantal technische kwesties die momenteel belemmeren hun klinisch gebruik. In dit opzicht, zoals bij het genereren van iPS cellen, alle weefselmanipulatie therapieën moeten cellen aan externe gen transductie produceren om patiëntveiligheid handhaven. Daarom waren we de eerste groep met succes de productie van menselijke cellen DFAT 6. Verscheidene andere onderzoeksgroepen hebben sindsdien aangenomen onze methode om DFAT cellen van zoogdieren oorsprong 7-9 te genereren, verder aandacht voor de bruikbaarheid van ons model. Gedurende verscheidene studies hebben we gevonden dat de kwaliteit van de celkweek omgeving kan worden gewijzigd door instellen van de inhoud van het celmedium. Deze bevinding heeft geleid tot een verhoging van de slaagkans van DFAT celproductie en cellen kwaliteit verbeterd; zowel kritische factoren inefficiënt genereren van cellen voor toekomstige klinische trials. In dit opzicht een verbeterde DFAT kweekmedium (DCM, een medium vergelijkbaar met mesenchymale stamcel medium dat recombinant humaan insuline, serum albumine, L-glutaminezuur, verscheidene vetzuren bevat, en cholesterol) en een werkwijze voor DFAT celgeneratie en proliferatie werd ontwikkeld (meer informatie over de inhoud van DCM is beschikbaar op aanvraag). Deze methode hoogwaardige DFAT cellen werden gegenereerd met de mogelijkheid om te differentiëren in verschillende celtypes waaronder adipogenic, osteogene, chondrogene en cellen. Al met al, deze gevalideerd celkweek protocol verhoogt de kwaliteit van DFAT cellen en kunnen zeer bruikbaar voor het verbeteren van klinische toepassingen van celtherapie en tissue engineering.

<table><tbody><tr><td>CSTI303-MSC medium&nbsp;</td><td>CSTI</td><td>87-671</td><td>Dit medium wordt in de tekst gedefinieerd als DCM</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td>Het bevat geen Mg2+ en Ca2+</td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Sigma</td><td>C-6885</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Takasago Medical Industry Co., Ltd</td><td>TKZ-F2194-1</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>TAITEC</td><td>Bioshaker V.BR-36</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 100 &mu;m Geel</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&nbsp;</td><td>DL 352360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12,5 cm&sup2; Rechthoekige Canted Neck Celcultuurfles met Blauwe Ventielschroefdop</td><td>CORNING LIFE SCIENCES&nbsp;</td><td>353107</td><td></td></tr><tr><td>18 G naald</td><td>NIPRO</td><td>02-002</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Spuit&nbsp;</td><td>NIPRO</td><td>08-753</td><td></td></tr><tr><td>Z Series Coulter Teller</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>383550</td><td></td></tr></tbody></table>

een efficiënte methode om gededifferentieerde fat cellen te verkrijgen

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering en celtherapie veelbelovend klinisch. In dit verband kan multipotente cellen, zoals mesenchymale stamcellen (MSCs), therapeutisch worden toegepast, in de nabije toekomst de functie herstellen beschadigde organen. Toch een aantal technische kwesties, waaronder de zeer invasieve procedure voor het isoleren van MSC&#39;s en de inefficiëntie rond hun versterking, momenteel belemmeren de potentiële klinische gebruik van deze therapeutische modaliteiten. Hierin introduceren we een zeer efficiënte werkwijze voor de productie van gededifferentieerde vetcellen (DFAT), MSC-achtige cellen. Interessant is DFAT cellen worden gedifferentieerd in verschillende celtypen waaronder adipogenic, osteogene, chondrogene en cellen. Hoewel andere groepen die eerder verschillende methoden hebben ingediend voor het genereren van DFAT cellen uit volwassen vetweefsel, onze methode laat ons toe om DFAT cellen efficiënter te produceren. Hierbij tonen we dat DFAT kweekmedium (DCM), aangevuld met 20% FBS,effectiever in het genereren DFAT cellen dan DMEM, aangevuld met 20% FBS. Bovendien kan de DFAT cellen die door onze celkweek methode redifferentiated in verschillende weefseltypen. Als zodanig is een zeer interessant en nuttig model voor de studie van weefsel dedifferentiatie gepresenteerd.

<html> In deze studie, de werkwijze en toolkit voor DFAT celgeneratie verbeterd (figuur 1). Onze methode kunnen we DFAT cellen te genereren met zowel DCM en DMEM medium met 20% FBS (figuur 2A). Daarom, hebben we de doelmatigheid van DCM en in DMEM genereren DFAT cellen. In dit verband DCM DFAT verhoogde celproliferatie driemaal vergelijking met DMEM, ongeacht het aantal adipocyten (figuur 2A en B). Gebruik 20% FBS verbete...

We hebben de omstandigheden voor de DFAT-celgeneratie aangepast en geven hierbij informatie over het gebruik van een verbeterd groeimedium voor de productie van deze cellen.

Een efficiënte methode om gededifferentieerde Fat cellen te verkrijgen

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Het algemene doel van deze nieuwe celkweekmethode is om met een hogere efficiëntie gededifferentieerde vetcellen te genereren. Onze methode kan onderzoekers in het veld van de regeneratieve geneeskunde helpen om cruciale vragen te beantwoorden over de verschillende processen die betrokken zijn bij de productie van adipogene, osteogene en chondrogene cellen. Aangezien het primaire voordeel van ons celkweekprotocol is dat het de kwaliteit van DEFAT-cellen verbetert, kan het in de nabije toekomst worden toegepast om huidige toepassingen in celtherapie en tissue engineering te verbeteren.Nadat het subcutane vetmonster van de patiënt vanuit de operatiekamer naar het laboratorium is gebracht, weegt u het weefsel en plaatst u een monster van één tot twee gram vetweefsel in een buis van 15 milliliter. Was het monster vervolgens met vijf milliliter PBS en breng het monster daarna over naar een plastic schaal van 10 centimeter. Verwijder de PBS.Voeg vervolgens 10 milliliter steriele 0,1% w/v collagenase toe aan de schaal met het monster. Gebruik daarna een chirurgische schaar om het weefsel fijn te knippen tot het een puree-achtige consistentie heeft. Overbreng het fijngeknipte weefsel en de

an-efficient-method-to-obtain-dedifferentiated-fat-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Volwassen adipocyten kunnen een overvloedige bron van stamcellen vertegenwoordigen door dedifferentiatie, wat leidt tot een homogene populatie van fibroblast-achtige cellen. Collagenase-digestie wordt gebruikt om volwassen adipocyten uit menselijk vet te isoleren. Het doel van ons protocol is om multipotente, dedifferentieerde vetcellen te verkrijgen uit menselijke volwassen adipocyten.

Generatie van de Mens Adipose stamcellen via dedifferentieëren Mature Adipocyten in Plafond Culturen

We presenteren de technieken die nodig zijn om de stromale vasculaire fractie (SVF) te isoleren uit de inguinale (subcutane) en perigonale (viscerale) vetweefsel depots van muizen om hun genexpressie en collagenolytische activiteit te beoordelen. Deze methode omvat de verrijking van Sca1high vet-afgeleide stamcellen (ASCs) met behulp van immunomagnetische celscheiding.

Immunomagnetische Scheiding van Fat Depot-specifieke SCA1<sup&gt; hoog</sup&gt;-Vetcellen afgeleide stamcellen (ASC)

De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.

Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

Witte vetweefsel (WAT) heeft kritieke tekortkomingen in de huidige primaire cultuur modellen, belemmeren farmacologische ontwikkeling en metabole studies. Hier presenteren we een protocol voor de productie van een systeem van de obesitas microphysiological door klemmen WAT tussen bladen van stromale cellen. Deze constructie biedt een stabiele en flexibele platform voor primaire WAT cultuur.

Een Microphysiologic Platform voor menselijk vet: ingeklemd wit vetweefsel

We presenteren een eenvoudige methode om zeer levensvatbare adipose voorlopercellen te isoleren van epididymale vetkussens van muizen met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering.

Voorbereiding van adipose voorlopercellen van muis epididymale vetweefsels

Het protocol maakt het mogelijk om een zuivere adipocytenpopulatie te genereren uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Retinoïnezuur wordt gebruikt om iPSC's te differentiëren in mesenchymale stamcellen (MSC's) die worden gebruikt voor de productie van adipocyten. Vervolgens wordt een sorteerbenadering op basis van Nijlrode kleuring gebruikt om zuivere adipocyten te verkrijgen.

Robuuste differentiatie van menselijke iPSC's in een zuivere populatie van adipocyten om adipocyten-geassocieerde aandoeningen te bestuderen

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Dit protocol schetst de isolatie van fibro-adipogene voorlopercellen (FAP's) van skelet- en hartspierfibromen (Acomys) via enzymatische dissociatie en fluorescentie-geactiveerde celsortering. De FAP's die uit dit protocol worden verkregen, kunnen effectief worden uitgebreid en gedifferentieerd tot myofibroblasten en adipocyten.

Isolatie, uitbreiding en differentiatie van fibro-adipogene voorlopers van het stekelige muismodel

Hier presenteren we een protocol dat autoloog vetweefsel kan transformeren in verschillende vetbestanddelen met verschillende fysisch-chemische eigenschappen en functies.

Innovatieve fractionering van vetweefsel voor het omzetten van vet in gespecialiseerde componenten

Hier presenteren we een standaardmethode om effectief stamcellen en adipocyten van vetweefsel te isoleren, gekenmerkt door &gt;90% vermindering van verwerkingstijd, hoge cellevensvatbaarheid en brede compatibiliteit.

Efficiënte isolatie van vetweefselstamcellen en adipocyten uit varkensvet vetweefsel

Leer een efficiënte celkweekmethode voor het genereren van gedifferentieerde vetcellen (DFAT) met verbeterde groeimedium. Deze techniek ondersteunt onderzoek naar regeneratieve geneeskunde en weefselengineering.

Een efficiënte methode om gededifferentieerde Fat cellen te verkrijgen

Meer video's verkennen