Een efficiënte methode om gededifferentieerde Fat cellen te verkrijgen

Het algemene doel van deze nieuwe celkweekmethode is het genereren van gededifferentieerde vetcellen met grotere efficiëntie. Onze methode kan onderzoekers die werken op het gebied van regeneratieve geneeskunde helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over de verschillende processen die betrokken zijn bij het produceren van adipogene, osteogene en chondrogene cellen. Aangezien het belangrijkste voordeel van ons celkweekprotocol is dat het de kwaliteit van DEFAT-cellen verbetert, kan het in de nabije toekomst worden toegepast om huidige toepassingen in celtherapie en weefselengineering te verbeteren.

Na het brengen van het subcutane vetmonster van de patiënt van de operatiekamer naar het lab, weegt u het weefsel en plaatst u een monster van een tot twee gram vetweefsel in een buis van 15 milliliter. Was vervolgens het monster met vijf milliliter PBS en breng het monster over naar een plastic schaal van 10 centimeter. Verwijder de PBS.

Voeg vervolgens 10 milliliter steriele 0,1% gewicht per volume collageenase toe aan de schaal met het monster. Gebruik vervolgens chirurgische scharen om het weefsel fijn te snijden tot het een gepureerd consistentie bereikt. Breng het fijngesneden weefsel en de collageenase-oplossing over naar een centrifugeerbuis van 15 milliliter en verteer bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten, met schudden bij 60 RPM.

Na de vertering, filtert u het verteerde monster door een filter van 100 micron in een verse buis van 15 milliliter. Breng vervolgens 10 milliliter DEFAT-kweekmedium aangevuld met 2%FBS door het filter. Om de vetcellen van de celsuspensie te isoleren, centrifugeer eerst de gefilterde cellen bij 100 keer g gedurende één minuut bij kamertemperatuur.

Tijdens de centrifugatie, bereidt u vijf milliliter DCM aangevuld met 2%FBS in een buis van 15 milliliter voor. Gebruik vervolgens een pipette van 1000 microliter om de drijvende vetcellen uit de gecentrifugeerde buis op te zuigen en voeg de cellen toe aan een buis van 15 milliliter met medium. Schud de buis voorzichtig om het DCM-medium met de cellen te mengen.

Centrifugeer vervolgens de buis bij 100 keer g gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Gebruik na het centrifugeren een naald van 18 gauge en een spuit van 20 milliliter om het medium aan de onderkant van de buis te verwijderen. Voeg vervolgens 10 milliliter DCM aangevuld met 2%FBS toe aan de cellen en meng door de buis voorzichtig te schudden.

Centrifugeer de cellen opnieuw bij 100 keer g gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Om te beginnen met plateren, voegt u 41 milliliter DCM of DMEM aangevuld met 20%FBS toe aan een flacon van 12,5 centimeter. Gebruik vervolgens een pipette van 200 microliter om 40 microliter vetcellen op te zuigen en voeg ze toe aan de flacon.

Vul vervolgens de flacon met DCM of DMEM aangevuld met 20%FBS. Het is van cruciaal belang dat de cellen over het medium worden verspreid. Plaats de flacon op het deksel van een ronde Petri-schaal om het vlak te houden.

Plaats tenslotte de flacon in een incubator ingesteld op 5%koolstofdioxide en 37 graden Celsius en laat deze zeven dagen ongestoord staan. Na een week incubatie, draait u de flacon om en controleert u op gededifferentieerde vetcellen. Zuig vervolgens het medium af en voeg dan vijf milliliter DCM of DMEM aangevuld met 20%FBS toe aan de flacon.

Laat de DEFAT-cellen nog een week groeien na het verversen van het medium. Na een week, gebruikt u een celteller om het aantal DEFAT-cellen te tellen dat is gegenereerd onder verschillende celkweekcondities. Deze afbeelding toont DEFAT-celkolonies na 14 dagen kweek in DMEM.

Hier worden de DEFAT-cellen getoond na 14 dagen kweek in DCM. In elk geval vertegenwoordigt de schaalbalk 200 micron. DEFAT-celproliferatie werd gekwantificeerd met behulp van een celteller, en de efficiëntie van DCM en DMEM in het genereren van DEFAT-cellen werd vergeleken.

Zoals hier te zien is, wordt verbeterde celproliferatie waargenomen met het gebruik van DCM. Hier werden humane DEFAT-cellen, gegenereerd met DCM, gedurende drie weken in het geschikte inductiemedium gekweekt om de redifferentiatie- en differentiatiecapaciteiten van DEFAT-cellen te evalueren. De cellen waren positief voor osteogene capaciteit door alkalische fosfatasevlek en door kleuring met Alizarine Rood S. Ten slotte werd adipogene capaciteit getoond met een Oil Red O-kleuring.

Het is heel belangrijk om ervoor te zorgen dat collageenase met rudiment en vetcelisolatie beide met de grootste zorg worden uitgevoerd om met succes hoogwaardige DEFAT-cellen te genereren. Door deze inspanningen streeft onze gevalideerde celkweekmethode ernaar om zowel huidig als toekomstig onderzoek op het gebied van ontwikkelingsbiologie en regeneratieve geneeskunde te vergemakkelijken.