Nabootsen van de Functie van de signaaleiwitten: Toward Kunstmatige Signaaltransductie Therapy
29 september 2016
We presenteren richtlijnen voor het ontwikkelen van synthetische 'chemische transducers' die communicatie kunnen induceren tussen van nature niet-verwante eiwitten. Daarnaast worden gedetailleerde protocollen gepresenteerd voor het synthetiseren en testen van een specifieke 'transducer' die een groeifactor in staat stelt om een ontgiftingsenzym te activeren en bijgevolg de splitsing van een antikanker prodrug te reguleren.
Het algemene doel van dit experiment is om de onnatuurlijke communicatie tussen twee eiwitten, geïnduceerd door een synthetische chemische transducer, spectroscopisch te volgen. Dit zal de mogelijkheid aantonen om synthetische analogen van signaaleiwitten te ontwikkelen die signaaltransductieroutes kunnen uitvoeren die niet in de natuur voorkomen. De mogelijkheid om onnatuurlijke eiwit-tot-eiwitcommunicatie te volgen door een gewone spectrofotometer, zou kunnen helpen bij het ontwikkelen en verbeteren van de functie van kunstmatige chemische transducers en ons dichter bij het bereiken van kunstmatige signaaltransductietherapie brengen.
De chemische transducer bestaat uit een trombocyten-afgeleid groeifactor, of PDGF-aptamere. Een bivalent ethacrynine amide GST-remmer, een fluorofoor en een quencher. De synthese van de chemische transducer zal niet in deze video worden gedemonstreerd.
Maar wordt beschreven in het tekstprotocol. De werkingsprincipes van de chemische transducer worden hier geïllustreerd. De chemische transducer remt de enzymatische activiteit van GST, wanneer de twee EA-groepen zich aan de actieve plaatsen van het enzym binden.
Toevoeging van PDGF leidt tot de vorming van het PDGF-chemische transducercomplex. Dit verstoort de transducer-GST-interactie, waardoor de enzymatische activiteit van GST wordt hersteld. De volgende toevoeging van een ongewijzigde PDGF-aptamere zet de chemische transducer vrij en laat het toe om het enzym opnieuw te remmen.
Voordat u begint met de experimenten voor het onderzoeken van de controle van GST-activiteit door PDGF, stelt u een experimentele procedure in de plate reader in voor kinetische meting. Maak een nieuw experiment als standaardprotocol. Selecteer Procedure om het venster Procedure-instellingen te openen.
In de pop-uplijst aan de bovenkant van het venster, kiest u het 384 Plate Type volgens de plaatfabrikant. Selecteer Lees in het linkerdeelvenster. Kies Absorbance voor de detectiemethode.
En Eindpunt voor het leestype. Typ in het golflengtevenster 340 nanometer. Selecteer Volledige plaat en kies de cellen die gemeten moeten worden.
Klik vervolgens op OK om het leesvenster te sluiten. Kies in het linkerdeelvenster Start kinetisch. Stel de uitvoeringstijd in op 10 minuten.
Selecteer de optie Minimale intervallen. Klik vervolgens op OK om het kinetisch venster te sluiten. Sleep de leeslijn in de kinetische meting.
Selecteer de knop Valideren, gevolgd door de OK-knop. Sla het experiment op. Selecteer de knop Afspelen.
Er verschijnt een dialoogvenster, maar selecteer de OK-knop pas wanneer u klaar bent om de kinetische meting te starten. Nadat de plate reader is ingesteld, is de volgende stap het voorbereiden van de monsters voor het meten van GST-activiteit in aanwezigheid van de chemische transducer en PDGF. Om vier concentraties PDGF in drievoudig te testen, bereid vier monsters voor waarvan elk 3,25 microliter van de chemische transducer en 3,25 microliter GST M-1 bevat.
Voeg aan elk monster nul, 1,2, 2,4 of 4,9 microliter PDGF toe. Voeg vervolgens het juiste volume van de assaybuffer toe aan elk monster om het totale volume op 130 microliter te brengen. Incubeer de monsters gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
Na 10 minuten, breng 40 microliter van elk monster over naar de cellen van een 384 transparante welpplaat. Breng elk van de vier monsters over naar de oneven of even cellen in dezelfde rij. Dit om het gebruik van een multipipet voor substraattoevoeging mogelijk te maken.
Gebruik vervolgens een 12-kanaals multipipet om snel aan elk monster 10 microliter van elk substraat toe te voegen, dat eerder in een 96 welpplaat is voorbereid. Meng snel, maar voorzichtig, om bellen te voorkomen. Plaats de plaat onmiddellijk in de plate reader en start de kinetische meting door de OK-knop in het dialoogvenster te selecteren.
Om GST-activeringsremmingscycli gemedieerd door de chemische transducer te onderzoeken, bereid vijf monsters voor, elk met 84,5 microliter assaybuffer. 3,25 microliter chemische transducer en 3,25 microliter GST M1-1. Incubeer gedurende drie minuten op kamertemperatuur.
Voeg 3,65 microliter assaybuffer toe aan monster één, en 3,65 microliter PDGF aan monsters twee, drie, vier en vijf. Incubeer gedurende drie minuten op kamertemperatuur. Voeg 3,12 microliter assaybuffer toe aan monsters één en twee, en 3,12 microliter PDGF-aptamere aan monsters drie, vier en vijf.
Incubeer gedurende drie minuten op kamertemperatuur. Voeg 24,4 microliter assaybuffer toe aan monsters één, twee en drie. En 24,4 microliter PDGF aan monsters vier en vijf.
Incubeer gedurende drie minuten op kamertemperatuur. Voeg 7,8 microliter assaybuffer toe aan monsters één tot vier, en 7,8 microliter PDGF-aptamere aan monster vijf. Incubeer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.
Breng de monsters over naar een 384 transparante welpplaat. Om het experiment in drievoudig uit te voeren en snel het substraat aan de monsters toe te voegen. Plaats de plaat in de lezer en start de kinetische meting.
Om dit assay te beginnen, stelt u een experimentele procedure in de plate reader in voor kinetische meting zoals beschreven in de protocoltekst. Bereid twee monsters voor in twee cellen van een 384 transparante welpplaat. Meng voor elke cel één microliter GST M1-1 en één microliter van de chemische transducer in 38 microliter assaybuffer.
Laat een lege cel tussen de twee cellen. Gebruik een 12-kanaals multipipet om snel 10 microliter substraat aan elke cel toe te voegen. Meng voorzichtig en snel om bellen te voorkomen.
Plaats de plaat onmiddellijk in de lezer en start de kinetische meting. Wanneer de plate reader na 3,5 minuten opent, voeg snel 1,125 microliter PDGF toe aan een van de cellen, meng voorzichtig en laat de plaat terug in de lezer gaan voor de resterende kinetische metingen. Voordat u de monsters voor dit experiment voorbereidt, stelt u een experimentele procedure in de plate reader in voor kinetische meting zoals beschreven in de protocoltekst.
Een nitriet/nitraat kleurenkit
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert richtlijnen voor de ontwikkeling van synthetische 'chemische transducereen' die communicatie tussen niet-verwante eiwitten faciliteren. Er wordt gedetailleerd over protocollen voor het synthetiseren en testen van een specifieke transducer die een ontgiftingsenzym activeert via een groeifactor.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Protein engineering
- Signaaltransductie
Achtergrond
- Onnatuurlijke communicatie tussen eiwitten kan worden geïnduceerd door synthetische transduceren.
- De ontwikkeling van synthetische analogen van signalerende eiwitten is cruciaal voor nieuwe therapeutische strategieën.
- Signaaltransductiepaden die niet in de natuur voorkomen, kunnen via deze benadering worden onderzocht.
- Veelgebruikte spectrofotometers kunnen worden ingezet om deze interacties te volgen.
Doel van de studie
- Om de haalbaarheid van synthetische chemische transducatoren in eiwitcommunicatie aan te tonen.
- Om de functie van kunstmatige chemische transducatoren te verbeteren.
- Om kunstmatige signaaltransductietherapie verder te ontwikkelen.
Gebruikte methoden
- Synthese van een chemische transducer bestaande uit een PDGF-aptameer.
- Gebruik van een bivalente ethacrynamide GST-remmer.
- Inbouw van een fluorofoor en een quencher voor spectroscopische analyse.
- Experimentele opstelling om eiwitinteracties spectroscopisch te volgen.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle demonstratie van onnatuurlijke eiwitcommunicatie.
- Potentieel voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën met behulp van synthetische transducenten.
- Inzichten in de mechanismen van signaaltransductiepaden.
- Vaststelling van protocollen voor toekomstig onderzoek op dit gebied.
Conclusies
- Synthetische chemische transducerelementen kunnen eiwitinteracties effectief mediëren.
- Dit onderzoek baant de weg voor innovatieve benaderingen in signaaltransductietherapie.
- Verdere studies zijn nodig om deze synthetische systemen te optimaliseren.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Dit werk legt een basis voor kunstmatige signaaltransductietherapie door aan te tonen hoe synthetische chemische transducatoren onnatuurlijke proteïne-proteïnecommunicatie kunnen mediëren. Deze benadering maakt mechanische risicoreductie bij doelwitvalidatie mogelijk door orthogonale signaleringspaden te creëren die inheemse regulatiemechanismen omzeilen. Dergelijke systemen bieden voorspellende waarde in preklinische modellen door een nauwkeurige temporele controle over enzymactiviteit mogelijk te maken, wat kan worden ingezet voor prodrug-activatiestrategieën in de oncologie en andere ziektegebieden.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken via induceerbare, reversibele eiwitcommunicatie tussen niet-natuurlijke partners.
- Operationele waarde: Biedt een instelbaar systeem om target-engagement en pathway-modulatie te beoordelen zonder genetische manipulatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door de dosisafhankelijke herstel van enzymactiviteit als reactie op therapeutische liganden te kwantificeren.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve real-time read-outs van eiwitinteractiedynamiek met behulp van standaard spectrophotometrische detectie.
- Operationele waarde: Vestigt een reproduceerbaar assay-formaat dat compatibel is met plate readers met hoge dichtheid voor kinetische analyse.
- Schaalbaarheid: Faciliteert gemultiplexte conditietests via gedefinieerde reagenttitratie- en sequentiële additieprotocollen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Demonstreert directe toepasbaarheid op de activering van prodrugs, waarbij transducer-gemedieerde GST-activiteit de afgifte van de cytotoxische payload reguleert.
- Mechanische risicoreductie: Valideert dat de signaaloutput afhankelijk is van zowel de transducer als het cognate ligand, waardoor de risico's op fout-positieve activering worden verminderd.
- Relevantie voor preklinische modellen: Ondersteunt de evaluatie van kunstmatige signaleringscircuits in ziekterelevante systemen voorafgaand aan in vivo validatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door een chemisch induceerbare switch te bieden die targetbinding verbindt met functionele read-outs, waardoor de overgang van hit-validatie naar lead-optimalisatie wordt gefaciliteerd.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door externe controle van enzymactiviteit mogelijk te maken via ligand-geïnduceerde conformationele veranderingen van de transducer.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door gestandaardiseerde kinetische metingen die real-time eiwitcommunicatie-gebeurtenissen weerspiegelen.
- Analytics: Genereert tijdopgeloste activiteitsgegevens die vergelijking van signaleringsdynamiek over verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Koppelt target-engagement aan functionele uitkomsten via prodrug-activatie, wat go/no-go-beslissingen op basis van signaalfideliteit ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een platform-agnostisch raamwerk voor transducerdesign dat toepasbaar is op diverse eiwitparen buiten PDGF-GST.
Operationele en bedrijfskundige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetvalidatie door signalering te ontkoppelen van de ruis van endogene pathways.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde reagensverhoudingen, incubatietijden en detectieparameters.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door een vroege beoordeling van de mechanistische haalbaarheid mogelijk te maken voordat er wordt geïnvesteerd in complexe therapeutische formaten.
- Impact op portfolio: Informeert risico-gecorrigeerde voortgang door de specificiteit en reversibiliteit van geïnduceerde signaleringsgebeurtenissen te kwantificeren.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in eiwitengineering, aptameer-ontwerp en enzymkinetiek om de transducercomponenten te optimaliseren.
- Afhankelijk van toegang tot plaatlezers die in staat zijn tot kinetische absorbentiemetingen bij 340 nm en 550 nm.
- Noodzaak van standaardisatie tussen teams van de bereiding van reagentia en incubatieprotocollen om de vergelijkbaarheid van gegevens te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van het transducer-ontwerp op nieuwe eiwitparen met verschillende bindingskinetiek of sterische beperkingen.
- Omvat praktische beperkingen zoals de stabiliteit van de transducer, potentiële off-target interacties en de noodzaak van zorgvuldige titratie om signaalverzadiging te voorkomen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Synthesis and Operating Principles of the 'Chemical Transducer'
1:51
Setting Up the Plate Reader for Kinetic Measurement
3:26
Measuring GST Activity in the Presence of the 'Chemical Transducer' and PDGF
4:59
Evaluating GST Activation/Inhibition Cycles Mediated by the 'Chemical Transducer'
6:37
Evaluating the Real-time Effect of PDGF Addition
7:42
Measuring JS-K Prodrug Activation by GST in the Presence of the 'Chemical Transducer' and PDGF
10:16
Results: 'Chemical Transducer' Induces Artificial Communication Between PDFG and GST
11:53
Conclusion
