Name: Nabootsen van de Functie van de signaaleiwitten: Toward Kunstmatige Signaaltransductie Therapy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Ontdek hoe synthetische chemische transducers communicatie tussen eiwitten mogelijk maken voor kunstmatige signaaltransductietherapie. Deze methode gebruikt een PDGF-aptamer en spectroscopische analyse om GST-activiteit te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door de Minerva Foundation, de HFSP Organisatie, en een European Research Council Grant (Starting Grant 338.265).

1. Synthese van de &#39;Chemical Transducer&#39; <ol><li> voorlopige Voorbereidingen <ol><li> Bereid 2 M triethylammoniumacetaat (TEAA) buffer door het mengen van 278 ml triethylamine met 114 ml azijnzuur en 400 ml ultrazuiver water. Breng de pH op 7 en voeg water tot een eindvolume van 1 L. Hou het in een donkere fles. Opmerking: Deze oplossing is jarenlang. </li><li> Bereid een 5 mM ascorbinezuur oplossing door het oplossen van 18 mg ascorbinezuur in 20 ml ultrazuiver water. Gebruik een verse oplossing; de oplossing is een dag. </li><li> Bereid een (II) tris (benzyltriazolylmethyl) amineoplossing 10 mM Cu / (TBTA) door het oplossen van 25 mg koper (II) sulfaat pentahydraat in 10 ml ultrazuiver water en 58 mg TBTA in 11 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Meng de twee oplossingen. Hou het bij kamertemperatuur en het te beschermen tegen licht. </li></ol></li><li> vervoeging Procedure <ol><li> Oplossen 100 nmol van het gemodificeerde oligonucleotide (ODN-1) in 80 glvers ultrapuur water. Voeg 20 ul van 2 M TEAA, pH = 7. Voeg 80 ul van een vers bereide oplossing van ascorbinezuur (5 mM in water). </li><li> Dissolve 1,5 umol (574,5 g) van-azido gemodificeerd ethacrynzuur in 180 ul DMSO toevoegen aan de oplossing. Ontgas de oplossing met argon gedurende 60 seconden en snel toevoegen 40 ui van het Cu (II) / TBTA oplossing (10 mM in 55% (v / v) DMSO / water). </li><li> Spoel opnieuw met Argon, dicht strak, en roer &#39;s nachts. </li><li> De voortgang van de reactie en zuiver het conjugaat door RP-HPLC (mobiele fase: A) 5% acetonitril, 5% TEAA, 90% ultrazuiver water; B) 65% Acetonitril, 5% TEAA, 30% ultrapuur water). 24 </li></ol></li></ol> 2. Controlling GST activiteit van PDGF <ol><li> voorlopige Voorbereidingen <ol><li> Bereid 50 ml van de Assay buffer door het mengen van 33,9 ml van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBSx1) met 16,1 ml ultrapuur water om een ​​8 mm uiteindelijke fosfaat concentratie en ad bereikend 23,8 mg MgCl 2 een 5 mM eindconcentratie te bereiken. </li><li> Bereid een voorraadoplossing van GST M1-1 door oplossen van het eiwit in een buffer die 50 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol (DTT) en 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) tot een eindconcentratie van 30 uM. Verdeel deze oplossing in kleine porties en bewaar bij -80 ° C. Verdunnen vers, overeenkomstig punt 2.1.5.1, in de Assay buffer en blijf op ijs. Opmerking: De oplossing is voor ongeveer 5 uur, of totdat er een vermindering van de enzymactiviteit. </li><li> Bereid de substraat volgens de volgende instructies: <ol><li> Los 10 mg van gereduceerd glutathion (GSH) in 325 gl ultrazuiver water tot een eindconcentratie van 100 mM voorraadoplossing. Verdun 21 pi van deze voorraadoplossing in 979 gl Assay buffer voor een eindconcentratie van 2,1 mM werkoplossing. </li><li> Los 10 mg van 2,4-dinitrochloorbenzeen (CDNB) in 492 pl ethanol tot een eindconcentratie van 100 mM voorraadoplossing. Verdun 43,2 pl van voorraadoplossing in 956,8 gl Assay buffer tot een eindconcentratie van 4,32 mM werkoplossing. </li></ol></li><li> In een 96-well plaat, zet elke substraat in een aparte lijn (12 wells). Plaats ten minste 60 ul in elk putje om snel en gemakkelijk de intrekking van de oplossing mogelijk te maken. Bedek de plaat met een aluminium plaat voor lichte bescherming. </li><li> Bereid de volgende voorraad oplossingen in de Assay buffer: <ol><li> Verdun GST M1-1 per 50 tot een eindconcentratie van 0,6 uM van het dimeer. </li><li> Verdun de &#39;chemische transducer&#39; om een ​​30 uM voorraad oplossing. </li><li> Verdun PDGF tot een uiteindelijke concentratie van 40 uM. </li><li> Verdun PDGF aptameer tot een uiteindelijke concentratie van 250 uM. </li></ol></li></ol></li><li> Meet de GST activiteit in de aanwezigheid van de &#39;chemische transducer&#39; en PDGF. <ol><li> Het opzetten van een experimentele procedure in de plaat lezer voor kinetische meting. <ol><li> Maak een nieuw experiment als een &#39;standaard protocol&#39;. </li><li> Druk op &#39;procedure&#39; om de openstelling van het raam procedure instellingen. </li><li> In de pop-up lijst aan de bovenkant van het venster, kies het type &#39;384 plaat&#39; volgens de fabrikant plaat. </li><li> Druk op &#39;lezen&#39; op het linker menu. </li><li> Ten aanzien van de detectiemethode kies &#39;Absorptie&#39;. </li><li> Ten aanzien van de lees soort kiezen voor &#39;eindpunt&#39;. </li><li> Voeg 340 nm van de golflengte venster. </li><li> Druk op de &#39;volledige plaat&#39; bottom op de rechterbovenhoek en kies het goed te meten. </li><li> Druk op &#39;ok&#39; het venster te sluiten &#39;lezen&#39;. </li><li> Kies &#39;start kinetische&#39; op het linker menu. </li><li> Maak de looptijd 10 min. </li><li> Selecteer de optie minimum intervallen. </li><li> Druk op &#39;OK&#39; om de kinetische venster te sluiten. </li><li> Sleep de &#39;Read&#39; lijn into de kinetische meting. </li><li> Druk op de &#39;valideren&#39; knop en vervolgens op de knop &#39;OK&#39;. </li><li> Sla het experiment. </li><li> Druk op de knop &#39;play&#39;. Een dialoogvenster verschijnt - drukt alleen de &#39;ok&#39; knop wanneer de meting moet worden gestart. </li></ol></li><li> Om het experiment triplo uitgevoerd Bereid vier monsters elk 3,25 pi van het &quot;chemische transducer en 3,25 pi GST M1-1. Naar elk monster 0, 1,2, 2,4 of 4,9 pl PDGF en 123,5, 122,3, 121,1 of 118,6 pl van de test buffer, respectievelijk. </li><li> Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> In een 384-putjes doorzichtige Plaats 40 gl monster toe aan elk putje. Plaats de monsters alleen in de oneven putten of alleen de even putten in dezelfde lijn voor het gebruik van een multi-pipet voor substraattoevoeging mogelijk. </li><li> Met behulp van een 12-kanaals multi-pipet snel voeg 10 ul van elk van tHij substraten die werden vooraf bereid in de 96-well plaat (sectie 2.1.4). Meng voorzichtig en snel naar luchtbellen te vermijden. Plaats de plaat in de lezer en start de kinetische meting. Aangezien GST kinetiek is vrij snel, proberen om de tijd tussen substraat toevoeging en het begin van de kinetische metingen te minimaliseren. </li></ol></li><li> GST Activering / Remming Cycles gemedieerd door de &#39;chemische transducer&#39;. <ol><li> Om het experiment triplo uitgevoerd, bereid 5 monsters met elk 84,5 gl Assay buffer, 3,25 pl &quot;chemische transducer en 3,25 pi GST M1-1. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. </li><li> Voeg 3,65 gl testbuffer monsters 1 en 3,65 pl PDGF monsters 2-5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. </li><li> Voeg 3,12 gl testbuffer monsters 1-2 en 3,12 pl PDGF aptameer monsters 3-5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. </li><li> Voeg 24,4 ul assaybuffer monsters1-3 en 24,4 pl PDGF monsters 4-5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. </li><li> Voeg 7,8 gl testbuffer monsters 1-4 en 7,8 pl PDGF aptameer monsters 5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. </li><li> In een 384-transparante well plaat, steekt 40 ul van het monster in elk putje. Insert monsters alleen in de oneven of slechts in de putjes zelfs in dezelfde lijn. </li><li> Met behulp van een 12-kanaals multi-pipet snel toevoegen 10 ui van elk substraat (vooraf bereid in de 96-well plaat). Meng voorzichtig en snel naar luchtbellen te vermijden. Plaats de plaat in de lezer en start de kinetische meting. </li><li> Bereken de V 0 [mOD / min] onder elke conditie door aftrekking van de OD gemeten bij 340 nm bij t = 0,5 min van de OD gemeten bij 340 nm bij t = 1,5 min de activatie / inhibitie recyclebaarheid beoordelen. 25 </li></ol></li><li> Evalueer de Real-time Reactie van de &#39;chemische transducer om veranderingen in de omgeving. <ol> &lt;li&gt; Real-time effect van PDGF aanvulling <ol><li> Opzetten van een experimentele procedure in de plaat lezer voor kinetische meting. </li><li> Herhaal stap 2.2.1.1-2.2.1.10. </li><li> Maak de looptijd 3,5 min. </li><li> Selecteer de optie minimum intervallen. </li><li> Druk op &#39;OK&#39; om de kinetische venster te sluiten. </li><li> Sleep de &#39;Read&#39; lijn in de kinetische meting. </li><li> Kies Plate Out / In in het linker menu. </li><li> Kies de optie &#39;plaat uit (geen venster)&#39;. </li><li> Kies de optie &#39;Delay&#39; op het linker menu en voer 30 sec. </li><li> Kies Plate Out / In in het linker menu. </li><li> Kies de optie &#39;plaat (geen dialoogvenster)&#39;. </li><li> Maak een tweede kinetische meting door herhalen van de stappen 2.2.1.4 - 2.2.1.14 maar in paragraaf 2.2.1.11 zet de bewegingsenergie om 25 min in plaats van 10 min. </li><li> Druk op de &#39;valideren&#39; knop en vervolgens op de knop &#39;OK&#39;. </li><li> Sla het experiment. </li><li> Druk op de &#39;play &#39;knop. Een dialoogvenster verschijnt - drukt alleen de &#39;ok&#39; knop wanneer de meting moet worden gestart. </li><li> Bereid twee monsters door het mengen van 1 pi GST M1-1 en 1 pl van het &quot;chemische transducer in 38 pl testbuffer. Plaats de monsters in twee putjes van een 384-transparante well plaat, waardoor er een lege goed tussen deze twee putten. </li><li> Met behulp van een 12-kanaals multi-pipet snel 10 ui toe van elk substraat, meng voorzichtig en snel naar luchtbellen te vermijden, plaatst u de plaat in de lezer en start de kinetische meting. </li><li> Wanneer de plaat opent (na 3,5 min) snel 1,125 pl PDGF aan één van de putjes, meng voorzichtig en laat de plaat te sluiten voor de resterende kinetische metingen. </li></ol></li><li> Real-time effect van het toevoegen van de PDGF aptameer <ol><li> Herhaal stap 2.4.1.1-2.4.1.15. </li><li> Bereid twee monsters door het mengen van 1 pl GST M1-1, 1 ui van het &quot;chemische transducer en 1,125 pl PDGF in 36,9 gl assaybuffer. Plaats de monsters in twee putjes van een 384-transparante well plaat, waardoor er een lege goed tussen deze twee putten. </li><li> Met behulp van een 12-kanaals multi-pipet snel 10 ui toe van elk substraat, meng voorzichtig en snel naar luchtbellen te vermijden, plaatst u de plaat in de lezer, en start de kinetische meting. </li><li> Wanneer de plaat opent (na 1,5 min) snel 1,2 pl PDGF aptameer aan één van de putjes, meng voorzichtig en laat de plaat te sluiten voor de resterende kinetische metingen. </li></ol></li></ol></li><li> Meet JS-K Prodrug Activering door GST in de tegenwoordigheid van de &#39;chemische transducer&#39; en PDGF. <ol><li> Opzetten van een experimentele procedure in de plaat lezer voor kinetische meting. <ol><li> Maak een nieuw experiment als een &#39;standaard protocol&#39;. </li><li> Druk op &#39;procedure&#39; om de openstelling van het raam procedure instellingen.</li><li> In de pop-up lijst aan de bovenkant van het venster kies type &#39;384 plaat&#39; volgens de fabrikant plaat. </li><li> Druk op &#39;lezen&#39; op het linker menu. </li><li> Wat de detectiewerkwijze gekozen &quot;Absorptie&quot;. </li><li> Ten aanzien van de lees soort kiezen voor &#39;eindpunt&#39;. </li><li> Voeg 305 nm van de golflengte venster. </li><li> Druk op de &#39;volledige plaat&#39; knop op de rechterbovenhoek en kies het goed te meten. </li><li> Druk op &#39;ok&#39; het venster te sluiten &#39;lezen&#39;. </li><li> Kies &#39;start kinetische&#39; op het linker menu. </li><li> Maak de looptijd 10 min. </li><li> Selecteer de optie minimum intervallen. </li><li> Druk op &#39;OK&#39; om de kinetische venster te sluiten. </li><li> Sleep de &#39;Read&#39; lijn in de kinetische meting. </li><li> Druk op de &#39;valideren&#39; knop en vervolgens op de knop &#39;OK&#39;. </li><li> Sla het experiment. </li><li> Druk op de knop &#39;play&#39;. Een dialoog box verschijnt - drukt alleen de &#39;ok&#39; knop wanneer de meting moet worden gestart. </li></ol></li><li> Voor NO productie metingen gebruiken een nitriet / nitraat calorimetrische kit. In een 96-well plaat voegen 50 pl assaybuffer in een rij, 70 ui Griess reagens I in een tweede rij en 70 gl II Griess reagens in een derde rij. </li><li> Om het experiment triplo uitgevoerd Bereid vier monsters die elk 4,8 ui van de &quot;chemische transducer. Om te proeven 1, voeg 155,2 ul van Assay buffer; te proeven 2, voeg 3,2 ul van GST-M1-1 en 152 ul van Assay buffer; monsters 3, voeg 9,6 pl PDGF en 145,6 ul assaybuffer; en monster 4, voeg 3,2 gl GST-M1-1, 9,6 pl PDGF en 142,4 pl testbuffer. </li><li> Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> In een 384-transparante well plaat, steekt 50 ui van het monster in elk putje. Insert monsters alleen in de oneven of slechts inzelfs putten in dezelfde lijn voor het gebruik van een multi-pipet voor substraattoevoeging mogelijk. </li><li> Voeg 0,54 pl JS-K (5 mM in DMSO) aan elke well. </li><li> Met behulp van een 12-kanaals multi-pipet snel voeg 10 ul van het GSH oplossing (vooraf bereid in de 96-well plaat), meng voorzichtig en snel om luchtbellen te vermijden. Plaats de plaat in de lezer en start de kinetische meting. </li><li> Onmiddellijk na de kinetische meting met behulp van een 12-kanaals multi-pipet, neem 50 gl van elk monster in de testbuffer rij in de voorbereide 96-well plaat en snel toe te voegen 50 pi Griess I reagens en 50 pi Griess reagens II. Incubeer en beschermt tegen licht gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en meet de absorptie bij 550 nm. Opmerking: De assay buffer en reagentia volumes afhankelijk protocol van de kit. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling%E2%80%942000+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling—2000 and Beyond.</a> Cell. 100, 113-127 (2000).</li>
<li>Levitzki, A., Klein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Signal transduction therapy of cancer.</a> Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).</li>
<li>Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+signal+transduction+therapy%3A+a+futuristic+approach+to+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment.</a> Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).</li>
<li>Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Communication+and+Enzyme+Activation+Mediated+by+a+Synthetic+Chemical+Transducer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer.</a> J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).</li>
<li>Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Applications+of+Bifunctional+Small+Molecules%3A+Why+Two+Heads+Are+Better+Than+One%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One.</a> ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).</li>
<li>Rutkowska, A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Tango%3A+The+Toolbox+to+Capture+Interacting+Partners%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).</li>
<li>Meyer, C., Köhn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+T%C3%AAte-%C3%A0-T%C3%AAte+Arranged+by+a+Designed+Adaptor+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).</li>
<li>Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+as+a+Regulatory+Mechanism+in+Signal+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction.</a> Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).</li>
<li>DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+signaling+at+will%3A+chemically-inducible+dimerization+%28CID%29+techniques+resolve+problems+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology.</a> Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).</li>
<li>Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+control+over+protein-protein+interactions%3A+beyond+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors.</a> Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).</li>
<li>Diezmann, F., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-guided+display+of+proteins+and+protein+ligands+for+the+interrogation+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).</li>
<li>Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Controlled+Reversible+Switching+of+Peptide+Conformation+and+Bioactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).</li>
<li>Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA-Controlled+Switching+of+Protein+Kinase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity.</a> ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).</li>
<li>Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Small+Molecule+Chimera+with+Responsive+Protein-Binding+Ability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).</li>
<li>Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Binding+Molecular+Switches+via+Host-Guest+Stabilized+DNA+Hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).</li>
<li>Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assembly+for+high-performance+bivalent+nucleic+acid+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Logical+Molecular+Circuit+for+Programmable+and+Autonomous+Regulation+of+Protein+Activity+Using+DNA+Aptamer-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).</li>
<li>Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Protein+Surface+Sensors+as+a+Tool+for+Analyzing+Small+Populations+of+Proteins+in+Biological+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).</li>
<li>Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular%2C+DNA-Based+Beacon+for+Single-Step+Fluorescence+Detection+of+Antibodies+and+Other+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).</li>
<li>Franzini, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Structure-Activity+Relationships+from+Screening+a+Structurally+Compact+DNA-Encoded+Chemical+Library%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).</li>
<li>Unger-Angel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+recognition+by+bivalent%2C+%27turn-on%27+fluorescent+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes.</a> Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).</li>
<li>Nissinkorn, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+Protein+Surfaces+with+Targeted+Fluorescent+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors.</a> Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).</li>
<li>Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Liquid+Chromatography+of+Oligonucleotides+on+Nonporous+Alkylated+Styrene-Divinylbenzene+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers.</a> Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).</li>
<li>Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+bivalent+glutathione+S-transferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors.</a> Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. , 1-16 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We presenteerden een methode voor het ontwerpen en testen van een 'chemische transducer' die kunstmatige communicatie kan induceren tussen twee van nature niet-gerelateerde eiwitten, GST en PDGF, zonder de oorspronkelijke eiwitten te wijzigen. De onnatuurlijke GST-PDGF communicatie kon in realtime worden gedetecteerd door enzymatische tests te gebruiken die de veranderingen in de activiteit van GST volgen in aanwezigheid van de 'chemische transducer' en door de concentraties van PDGF te verhogen. Naast het detecteren van...

Signaaltransductiewegen spelen een belangrijke rol in vrijwel elk celprocessen en de cel reageert snel te reageren op signalen uit de omgeving. 1 Deze trajecten worden vaak veroorzaakt door de binding van een signalerende molecule aan een extracellulaire receptor, hetgeen resulteert in activatie van intracellulaire enzymen. Amplificatie en vermeerdering van dit signaal in de cel wordt gemedieerd door de werking van signaaleiwitten die een netwerk van eiwit-eiwit interacties waarbij enzymen reversibel zijn geactiveerd met hoge specificiteit te vormen. Vanwege ontregeling van deze netwerken vaak leidt tot de ontwikkeling van kanker, is er veel belangstelling voor oprichting van &#39;signaaltransductie behandeling van kanker&#39;, 2 waarbij drugs zijn ontworpen om kwaadaardige signaalwegen verstoren geweest. We hebben onlangs voorgesteld een alternatieve benadering van transductie therapie die berust op het vermogen van geneesmiddelen om onnatuurlijke signaaltransductiewegen genereren signaal. <sup&gt; 3 Met name zijn wij van mening dat door het ontwerpen van synthetische middelen die de functie van signaaleiwitten nabootsen, zou het mogelijk zijn om de functie van de cel indirect te moduleren. Bijvoorbeeld kunnen deze kunstmatige netwerken eiwitbiomarkers staat te splitsen enzymen die progeneesmiddelen activeren. Als alternatief kunnen deze signalering proteïne mimetica kunnen onnatuurlijke cel signaalwegen te activeren, wat resulteert in therapeutische effecten. Om de uitvoerbaarheid van deze benadering tonen, hebben wij onlangs een synthetisch &quot;chemisch transducer 4 dat bloedplaatjes afkomstige groeifactor (PDGF) maakt de splitsing van een kanker prodrug activeren door het activeren van glutathion-s-transferase (GST), wat niet zijn natuurlijke bindende partner. De structuur van deze &#39;transducer bestaat uit een anti-PDGF DNA aptameer dat is gemodificeerd met een tweewaardige remmer voor GST. Vandaar dit synthetische stof behoort tot een familie van moleculen met bindingsplaatsenverschillende eiwitten, 5-7 zoals chemische inductoren van dimerisatie (CID) 8-10 alsmede de zogenaamde eiwit-bindmiddel op basis van synthetische oligonucleotide-molecuul conjugaten. 11-21 De algemene beginselen van het ontwerpen van dergelijke systemen wordt hierin beschreven en gedetailleerde protocollen voor het synthetiseren en testen van de functie van dit &#39;transducer met gebruikelijke enzymatische assays worden voorzien. Dit werk ter vergemakkelijking ontwikkelen van aanvullende &#39;transducers&#39; van deze klasse, die kunnen worden gebruikt om intracellulair eiwit-eiwit mediëren communicatie en dus aan kunstmatige cel signaalwegen induceren. Figuur 1 beschrijft schematisch de werkingsprincipes van synthetische &quot;chemische transducers &#39;dat onnatuurlijke eiwit-eiwit communicatie kan mediëren. In deze illustratie, een &quot;chemische transducer, die synthetische bindmiddelen voor prot integreerteins I en II (bindmiddelen I en II), zodat het eiwit II katalytische activiteit van proteïne I, die niet de natuurlijke bindingspartner veroorzaken. Aangezien eiwit II, de omzetter verbindt de katalytische plaats van het enzym (eiwit I) en remt zijn activiteit (figuur 1, staat ii). De binding van de &quot;transducer eiwit II echter bevorderen van de wisselwerkingen tussen bindmiddel I en het oppervlak van eiwitten II (figuur 1, staat iii) die zijn affiniteit richting eiwit I. de effectieve concentratie van minder Hierdoor de &#39; vrije &#39;transducer in de oplossing wordt gereduceerd, hetgeen leidt tot dissociatie van het transducer-eiwit I complex en reactivering van eiwit I (figuur 1, staat iv). Tezamen bieden deze stappen te markeren drie fundamentele uitgangspunten van het ontwerp van een efficiënte &#39;transducers&#39;: (1) een &#39;transducer&#39; moet een specifieke binder hebben voor elk van de eiwit targets, (2) de interactie between bindmiddel II en eiwit II moet sterker dan de wisselwerking tussen bindmiddel I en I eiwit, en (3) binder I moet kunnen aangaan met het oppervlak van eiwitten II zijn. Dit laatste beginsel niet noodzakelijkerwijs dat bindmiddel ik alleen zou een hoge affiniteit en selectiviteit in de richting van eiwitten II hebben. In plaats daarvan is het gebaseerd op onze recente studies waaruit bleek dat het brengen van een synthetisch molecuul in de nabijheid van een eiwit waarschijnlijk interactie tussen deze moleculen en het oppervlak van het proteïne bevorderen. 19,22,23 <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" /> Figuur 1:. Werkingsprincipes van &quot;chemische transducers &#39;Wanneer de&quot; chemische transductor &quot;toegevoegd actief eiwit I (toestand i), het bindt aan de actieve site via bindmiddel I en remt zijn activiteit (state ii). In de aanwezigheid van eiwit II echter de ongebonden &#39;chemische transducer &quot;interageert met eiwit II tot bindmiddel II, die interacties tussen bindmiddel I en het oppervlak van eiwitten II bevordert. Dit veroorzaakte bindmiddel I-eiwit II interactie vermindert de effectieve concentratie van bindmiddel I, wat leidt tot dissociatie van het &#39;transducer&#39;-eiwit I complex en eiwit I reactivering (state iv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .</a>

<table><tbody><tr><td>1-chloro-2,4-dinitrobenzeen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Bio Lab</td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Koper(II)sulfaat pentahydraat</td><td>Merck-Millipore</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Merck-Millipore</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>Ethacrynzuur</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. Ltd</td><td>E0526</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione-s-transferase M1-1</td><td>Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israël)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JS-K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr><td>L-glutathione gereduceerd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>nitrate/nitriet colorimetrische assaykit</td><td>Cayman Chemical</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotiden</td><td>W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University</td><td></td><td>op bestelling</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israël)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Ontzoutingskolom</td><td>GE Healthcare</td><td>illustra MicroSpin G-25 Kolom</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters&nbsp;</td><td>2695-scheidingsmodule</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-kolom</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18-kolom (2,5 &mu;M, 4,6 mm &times; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-kolom</td><td>Waters</td><td>XBridgeTM OST C18-kolom (2,5&nbsp;&mu;M, 10 mm &times; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Plateau-lezer</td><td>BioTek</td><td>synergy H4 hybride</td><td></td></tr></tbody></table>

nabootsen van de functie van de signaaleiwitten: toward kunstmatige signaaltransductie therapy

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Signaaloverdrachtsroutes, die de respons van cellen op verschillende omgevingssignalen regelen, worden gemedieerd door de functie van signaalgevingsproteïnen die met elkaar interageren en elkaar activeren met hoge specificiteit. Synthetische agentia die de functie van deze proteïnen nabootsen, kunnen daarom worden gebruikt om onnatuurlijke signaaloverdrachtsstappen te genereren en bijgevolg de functie van de cel te veranderen. We presenteren richtlijnen voor het ontwerpen van 'chemische transducers' die kunstmatige communicatie tussen inheemse proteïnen kunnen induceren. Bovendien presenteren we gedetailleerde protocollen voor het synthetiseren en testen van een specifieke 'transducer', die communicatie tussen twee niet-gerelateerde proteïnen kan induceren: platelet-derived growth-factor (PDGF) en glutathione-S-transferase (GST). De manier waarop deze onnatuurlijke PDGF-GST-communicatie kan worden gebruikt om de splitsing van een antikanker prodrug te controleren, wordt ook gepresenteerd, wat wijst op het potentieel voor het gebruik van dergelijke systemen in 'kunstmatige signaaloverdrachtstherapie'. Dit werk is bedoeld om de ontwikkeling van aanvullende 'transducers' van deze klasse te vergemakkelijken, die kunnen worden gebruikt om intracellulaire proteïne-proteïne communicatie te mediëren en bijgevolg kunstmatige celsignaleringsroutes te induceren.

Het ontwerp, de synthese en het werkingsmechanisme van een &quot;chemische transducer dat kunstmatige communicatie tussen PDGF en GST kunnen induceren zijn weergegeven in figuur 2. De structuur van de&quot; transducer integreert een PDGF DNA aptameer en een bis-ethacrynic amide (BEA ), die reeds bekend GST remmer (figuur 2a). 19 Deze bindmiddelen programmaonderdeel &quot;transducer zowel PDGF en GST met verschillende affiniteiten, namelijk bin...

We presenteren richtlijnen voor het ontwikkelen van synthetische 'chemische transducers' die communicatie kunnen induceren tussen van nature niet-verwante eiwitten. Daarnaast worden gedetailleerde protocollen gepresenteerd voor het synthetiseren en testen van een specifieke 'transducer' die een groeifactor in staat stelt om een ontgiftingsenzym te activeren en bijgevolg de splitsing van een antikanker prodrug te reguleren.

Nabootsen van de Functie van de signaaleiwitten: Toward Kunstmatige Signaaltransductie Therapy

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Het algemene doel van dit experiment is om de onnatuurlijke communicatie tussen twee eiwitten, geïnduceerd door een synthetische chemische transducer, spectroscopisch te volgen. Dit zal de mogelijkheid aantonen om synthetische analogen van signalerings-eiwitten te ontwikkelen die in staat zijn om signaaltransductiepaden uit te voeren die niet in de natuur voorkomen. De mogelijkheid om onnatuurlijke eiwit-eiwitcommunicatie te volgen met een gangbare spectrofotometer zou kunnen helpen bij het ontwikkelen en verbeteren van de functie van kunstmatige chemische transducers en ons dichter bij het realiseren van kunstmatige signaaltransductietherapie brengen.De chemische transducer is samengesteld uit een aptameer tegen platelet-derived growth factor (PDGF), een bivalent ethacrynic amide GST-remmer, een fluorofoor en een quencher. De synthese van de chemische transducer wordt in deze video niet gedemonstreerd.Maar dit wordt beschreven in het tekstprotocol. De werkingsprincipes van de chemische transducer worden hier geïllustreerd. De chemische transducer remt de enzymatische activiteit van GST wanneer de twee EA-groepen binden aan de actieve centra van de enzymen.Toevoeging van PDGF leidt tot de vorming van het PDGF-chemische transducercomplex, wat de interactie tussen de transducer en GST verstoort en daarmee de enzymatische activiteit van GST herstelt. De daaropvolgende toevoeging van een ongemodificeerd PDGF-aptameer laat de chemische transducer vrij, waardoor deze het enzym opnieuw kan remmen.Voordat u begint met de experimenten om de regulatie van de GST-activiteit door PDGF te onderzoeken, stelt u in de plaatlezer een experimentele procedure in voor kinetische metingen. Maak een nieuw experiment aan als standaardprotocol. Selecteer Procedure om het venster Procedure-instellingen te openen.Kies in de pop-up lijst aan de bovenzijde van het venster het 384-plaattype op basis van de plaatfabrikant. Selecteer Lezen in het linkermenu. Kies Absorbantie als detectiemethode.En het Eindpunt voor het Leestype. Typ in het venster Golflengte 340 nanometers. Selecteer Volledige plaat en kies de wells die gemeten moeten worden.Klik vervolgens op OK om het leesvenster te sluiten. Kies in het menu links voor Start Kinetic. Stel de Run Time in op 10 minuten.Selecteer de optie Minimum Intervals. Klik vervolgens op OK om het Kinetic-venster te sluiten. Sleep de Read Line naar de Kinetic Measurement.Selecteer de knop Valideren, gevolgd door de knop OK. Sla het experiment op. Selecteer de knop Afspelen.Er verschijnt een dialoogvenster, maar selecteer de OK-knop pas wanneer u klaar bent om de kinetische meting te starten. Zodra de platenlezer is ingesteld, is de volgende stap het voorbereiden van de monsters voor het meten van de GST-activiteit in aanwezigheid van de chemische transducer en PDGF. Om vier concentraties PDGF in triplikaat te testen, bereidt u vier monsters waarbij elk 3,25 µL van de chemische transducer en 3,25 µL GST M-1 bevat.Voeg aan elk monster respectievelijk 0, 1,2, 2,4 of 4,9 µL PDGF toe. Voeg vervolgens het juiste volume assaybuffer toe aan elk monster om het totale volume op 130 µL te brengen. Incubeer de monsters 10 minuten bij kamertemperatuur.Breng na 10 minuten 40 µL van elke sample over naar de wells van een transparante 384-well plaat. Breng elk van de vier samples over naar uitsluitend de oneven of de even wells in dezelfde rij. Dit is om het gebruik van een multichannelpipet voor de toevoeging van het substraat mogelijk te maken.Gebruik vervolgens een 12-kanaals multichannelpipet om aan elk monster snel 10 µL van elk substraat toe te voegen dat eerder in een 96-wells plaat is voorbereid. Meng snel, maar voorzichtig, om luchtbellen te voorkomen. Plaats de plaat onmiddellijk in de plaatlezer en start de kinetische meting door op de OK-knop in het dialoogvenster te klikken.Om de door de chemische transducer gemedieerde remmingscycli van de GST-activatie te onderzoeken, bereidt u vijf monsters, die elk 84,5 µL assaybuffer, 3,25 µL chemische transducer en 3,25 µL GST M1-1 bevatten. Incubeer dit gedurende drie minuten bij kamertemperatuur.Voeg 3,65 µL assaybuffer toe aan monster één, en 3,65 µL PDGF aan monsters twee, drie, vier en vijf. Incubeer gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Voeg 3,12 µL assaybuffer toe aan monsters één en twee, en 3,12 µL PDGF-aptameer aan monsters drie, vier en vijf.Incubeer gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Voeg 24.4 µL assaybuffer toe aan monsters één, twee en drie. En 24.4 µL PDGF aan monsters vier en vijf.Incubeer drie minuten bij kamertemperatuur. Voeg 7,8 µL assaybuffer toe aan monsters één tot en met vier, en 7,8 µL PDGF-aptameer aan monster vijf. Incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur.Breng de monsters over naar een transparante 384-wells plaat. Voer het experiment in drievoud uit en voeg het substraat snel toe aan de monsters. Plaats de plaat in de reader en start de kinetische meting.Om deze assay te starten, stelt u een experimentele procedure in de platenlezer in voor kinetische meting, zoals beschreven in de protocoltekst. Bereid twee monsters voor in twee wells van een transparante 384-wellsplaat. Meng voor elke well één µL GST M1-1 en één µL van de chemische transducer in 38 µL assaybuffer.Laat een lege well tussen de twee wells. Voeg met een 12-kanaals multichannelpipet snel 10 µL substraat toe aan elke well. Meng voorzichtig en snel om bellen te voorkomen.Plaats de plaat onmiddellijk in de reader en start de kinetische meting. Wanneer de plate reader na 3,5 minuten opent, voeg dan snel 1,125 µL PDGF toe aan een van de wells, meng voorzichtig en laat de plaat opnieuw in de reader gaan voor de resterende kinetische metingen. Stel vóór het voorbereiden van de monsters voor dit experiment een experimentele procedure in de plate reader in voor kinetische meting, zoals beschreven in de protocoltekst.Een colorimetrische nitriet/nitraat-kit zal worden gebruikt voor het meten van de productie van stikstofoxide. Verdeel in een 96-wellsplaat 50 µL assaybuffer per well in de eerste rij en 70 µL Griess One-reagens per well in de tweede rij.En 70 µL Griess Two Reagent per putje in de derde rij. Bereid vier monsters voor, elk met 4,8 µL van de chemische transducer. Voeg aan monster één 155,2 µL assaybuffer toe.Voeg aan monster twee 3,2 µL GST M1-1 en 152 µL assaybuffer toe. Voeg aan monster drie 9,6 µL PDGF en 145,6 µL assaybuffer toe. En voeg aan monster vier 3,2 µL GST M1-1, 9,6 µL PDGF en 142,4 µL assaybuffer toe.Incubeer de monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verdeel 50 µL monster per well in een transparante 384-wells plaat om het experiment in triplo uit te voeren. Verdeel de monsters alleen in de oneven of even wells in dezelfde lijn om het gebruik van een multichannelpipet voor de toevoeging van het substraat mogelijk te maken.Voeg 0,54 µL JS-K prodrug toe aan elk monster. Voeg snel 10 µL glutathionoplossing toe aan elk monster en meng voorzichtig en snel om belletjes te voorkomen. Plaats de plaat in de reader en start de kinetische meting.Breng direct na de kinetische meting 50 microliters van elk monster over naar elke well van de eerste rij van de 96-wells plaat met assaybuffer. Breng vervolgens 50 microliters uit elke well van de tweede rij van de plaat over naar de wells van de eerste rij van de plaat. Doe hetzelfde met 50 microliters per well van de derde rij van de plaat naar de wells van de eerste rij van de plaat.Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur terwijl het monster tegen licht wordt beschermd. Meet vervolgens de absorptie bij 550 nanometer. De meting van de GST-activiteit zonder de chemische transducer en met de chemische transducer toonde aan dat de chemische transducer de GST-activiteit remt.GST wordt gereactiveerd door de toevoeging van toenemende concentraties PDGF aan het GST-chemische transducercomplex. Sequentiële toevoegingen van PDGF en een ongemodificeerd PDGF-aptameer aan het GST-chemische transducercomplex onthulden dat de communicatie tussen PDGF en GST reversibel was. De toevoeging van PDGF aan het GST-transducercomplex resulteerde in een snelle toename van de GST-activiteit, 3,5 minuten na toevoeging van de substraten.Terwijl de toevoeging van een PDGF-aptameer aan een mengsel van GST, PDGF en de chemische transducer resulteerde in een afname van de GST-activiteit. Deze resultaten geven aan dat het systeem in real-time reageert op veranderingen in zijn omgeving. Vervolgens werd het vermogen van dit systeem om de activering van een prodrug te beheersen onderzocht met behulp van JS-K, een antikanker-prodrug die door GST wordt geactiveerd om toxisch stikstofmonoxide vrij te geven.Metingen van de hoeveelheden stikstofmonoxide die vrijkwamen na toevoeging van JS-K aan de chemische transducer en verschillende combinaties van GST en PDGF bevestigden dat alleen de aanwezigheid van zowel GST als PDGF JS-K activeert. Dit alles laat zien hoe een synthetisch middel een groeifactor in staat kan stellen om de katalytische activiteit van Glutathion S-Transferase te triggeren, wat niet zijn natuurlijke enzympartner is. Toekomstige biomimetica van deze klasse kunnen daarom worden gebruikt om de respons van cellen op omgevingssignalen te wijzigen of om ze te voorzien van nieuwe eigenschappen.

mimicking-function-signaling-proteins-toward-artificial-signal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Aanhoudende activering van remmende G-eiwit gekoppelde receptoren leidt tot een sensibilisering van adenylylcyclase signalering. Om de essentiële moleculaire pathways identificeren nonbiased stappen noodzakelijk zijn, maar deze strategie vereist de ontwikkeling van een schaalbare celgebaseerde cAMP overgevoeligheid assay. Hierin beschrijven we een overgevoeligheid test voor kleine moleculen en siRNA screening.

Drug-geïnduceerde Overgevoeligheid van adenylylcyclase: Assay stroomlijning en miniaturisatie voor Small Molecule en siRNA screening Toepassingen

De hier beschreven methode wordt gebruikt om de apoptotische signaleringskaskade te induceren in gedefinieerde stappen om de activiteit van een anti-apoptotisch bacterieel effector-eiwit te onderzoeken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor inductieve expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten, of voor het onderzoeken van interferentie met andere signaalwegen.

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

Dit protocol beschrijft een optogenetische strategie voor het moduleren van mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) activiteit tijdens celdifferentiatie en Xenopus embryonale ontwikkeling. Deze methode maakt het mogelijk om de omkeerbare activering van de MAPK signalering weg in zoogdiercelcultuur en in multicellulaire levende organismen, zoals Xenopus embryo's, met een hoge ruimtelijke en temporale resolutie.

Lichtgemedieerde Terugkeerbare Modulatie van de Mitogeen-Geactiveerde Proteïne Kinase Pathway tijdens Cell Differentiatie en<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Ontwikkeling

Hier presenteren we een protocol voor antilichaam arrays om te identificeren van de wijzigingen in de signaalroutes in verschillende cellulaire modellen. Deze veranderingen, veroorzaakt door drugs/hypoxie/ultra-violet licht/straling, of overexpressie/Downregulatie/uitsparingen, zijn belangrijk voor verschillende modellen van de ziekte en kunnen aangeven of een therapie effect sorteren zullen of mechanismen van drugs kan identificeren weerstand.

Beoordeling van weerstand tegen Tyrosine Kinase remmers door een ondervraging van signaaltransductie trajecten door antilichaam Arrays

Hier beschreven is een protocol voor het karakteriseren van modules van biologisch synergetische miRNAs en hun assemblage in korte transgenen, waardoor gelijktijdige overexpressie voor gentherapie toepassingen mogelijk is.

Karakterisatie van functioneel geassocieerde Mirna's in glioblastoma en hun engineering in kunstmatige clusters voor gentherapie

Optogenetische manipulatie van signaalroutes kan een krachtige strategie zijn om te onderzoeken hoe signalering wordt gedecodeerd bij ontwikkeling, regeneratie, homeostase en ziekte. Dit protocol biedt praktische richtlijnen voor het gebruik van licht-zuurstof-spanningsgevoelige domeingebaseerde Nodale en botmorfogene proteïne (BMP) signaleringsactivatoren in het vroege zebravisembryo.

Optogenetische signaleringsactivering in zebravisembryo's

Guanosine trifosfaat (GTP) binding is een van de vroegste gebeurtenissen bij G-proteïne-koppelde receptor (GPCR) activatie. Dit protocol beschrijft hoe u specifieke GPCR-ligandinteracties farmacologisch kunt karakteriseren door de binding van het radioactief gemerkte GTP-analoog, [35S] guanosine-5'-O- (3-thio) trifosfaat ([35S] GTPγS) te monitoren in Reactie op een ligand van interesse.

Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding

Een gemodificeerde dichtheidscentrifugatiegradient gebaseerde methodologie werd gebruikt om epitheelcellen van Rhipicephalus microplus gutweefsel te isoleren. Oppervlakte gebonden eiwitten werden biotinyleerd en gezuiverd door streptavidine magnetische kralen voor gebruik in downstream toepassingen.

Zuivering van Biotinylated Cell Surface Proteins uit<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitheliale darmcellen

De eiwitsamenstelling van de menselijke mitrale klep is nog steeds gedeeltelijk onbekend, omdat de analyse ervan gecompliceerd is door lage cellulariteit en derhalve door biosynthese met een lage eiwit. Dit werk biedt een protocol om eiwit efficiënt te extraheren voor de analyse van het mitrale klep proteome.

Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve

Deze methode beschrijft de klonen, expressie en zuivering van recombinante Nsa1 voor structurele bepaling door middel van röntgendiffractie en small-angle X-ray scattering (SAXS), en is van toepassing voor de hybride structurele analyse van andere eiwitten die beide bevatten besteld en ontregelde domeinen.

Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae

Ontdek hoe synthetische chemische transducers communicatie tussen eiwitten mogelijk maken voor kunstmatige signaaltransductietherapie. Deze methode gebruikt een PDGF-aptamer en spectroscopische analyse om GST-activiteit te bestuderen.

Nabootsen van de Functie van de signaaleiwitten: Toward Kunstmatige Signaaltransductie Therapy

Meer video's verkennen