Name: Isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor niet-coderende RNA kwantificering Klein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Leer de isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor kwantificering van kleine niet-coderende RNA's. Deze methode helpt onderzoekers bij het analyseren van zuivere lipoproteïnen voor ziektebiomerkers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute aan K.C.V. HL128996, HL113039 en HL116263. Dit werk werd ook ondersteund door subsidies van de American Heart Association aan K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 en R.M.A. POST25710170.

1. Zuivering HDL (~ 5,5 dagen) <ol><li> Density-Gradient Ultracentrifugatie (DGUC, ~ 5 dagen) <ol><li> Voeg 90 ul van 100x anti-oxidanten 9 ml plasma geïsoleerd uit vers veneus bloed. </li><li> Pas plasmadichtheid met KBr van 1,006 g / ml tot 1,025 g / ml door toevoeging van 0,251 g KBr aan 9 ml plasma uit stap 1.1.1 (0,0278 g / ml plasma KBr). Schommel de plasma totdat al het zout is opgelost bij kamertemperatuur en overbrengen buizen ultracentrifuge en zorgen alle bellen stijgen naar de top. </li><li> Buig de tip van een 18-G naald tot 90 ° 1 cm van de punt, schuine zijde naar boven. Met behulp van een injectiespuit en de 18-gauge naald, plaats voorzichtig 3 ml overlay oplossing # 1 via plasma (tabel 1). LET OP: De verbogen naald zorgt ervoor dat alle de VLDL / IDL, LDL en HDL worden verwijderd zonder het te mengen met de overlay. </li><li> Verwijder de meerderheid van de bellen bij de bovenkant, waardoor 2-3 mm afstand van meniscus de top van de buis en carefully plaatst de tubes in SW-40Ti emmers. </li><li> Weeg elke emmer (met de doppen) op de balans, en precies in evenwicht te brengen met de andere emmer (bucket + cap): # 1 naar # 4, # 2 tot # 5, en # 3 tot # 6. LET OP: Deze emmers moeten evenwichtig en afgestemd te allen tijde. </li><li> Plaats de rotor in de ultracentrifuge (Lijst van Materials). Centrifugeer bij 274.400 xg gedurende 24 uur bij 4 ° C met een # 4 tussenproduct remmen. </li><li> verwijderen emmers uit rotor en de buizen voorzichtig uit emmers. </li><li> Trek 2 ml van de bovenste laag van de overlay met een injectiespuit en verbogen naald. Dit zal de VLDL / IDL fractie die ten 4 kunnen worden opgeslagen zijn ° C of -80 ° C. </li><li> Na het verwijderen van de VLDL / IDL fractie, het verzamelen van de resterende 7 ml monster (plasma) en plaats deze in een 15 ml conische buis. Breng het volume van het monster tot 9 ml met overlay oplossing # 2 (Tabel 1). </li><li> Pas de steekproef dichtheid van 1,025 g / ml tot 1,080 g / ml met behulp van KBrongeveer 0,746 g KBr in de 9 ml monster of 0,0828 g / mL KBr monster. Schud het monster totdat alle KBr wordt opgelost (ongeveer 20 min) en over te dragen aan de buis ultracentrifuge tegelijkertijd bellen stijgen naar de top. </li><li> Met spuit en naald, zorgvuldig plaatst 3 ml overlay oplossing # 3 over het monster (tabel 1). Laat 2-3 mm afstand van meniscus de top van de buis. </li><li> Verwijder het meeste resterende luchtbellen aan de top van de buis en plaats voorzichtig de gevulde ultracentrifuge buizen SW-40Ti emmers. </li><li> Weeg elke emmer (met de doppen) op de balans, en precies in evenwicht te brengen met de andere emmer + cap, zoals in 1.1.5. </li><li> Plaats de rotor in de ultracentrifuge (zie lijst van materialen). Centrifugeer bij 274.400 xg gedurende 24 uur bij 4 ° C met een # 4 tussenproduct remmen. </li><li> verwijderen emmers uit rotor en de buizen voorzichtig uit emmers. </li><li> Verwijder voorzichtig 2 ml van de bovenste laag van de bekleding met een injectiespuit en zijnnt naald. Dit zal de LDL fractie die ten 4 kunnen worden opgeslagen zijn ° C of -80 ° C. </li><li> Na het verwijderen van de LDL-fractie, het verzamelen van de resterende bij benadering 7 ml monster (plasma) en plaats deze in een nieuwe 15 ml conische buis. Breng het volume van het monster (plasma) tot 9 ml met 1,080 g / mL oplossing # 4 (Tabel 1). </li><li> Pas de steekproef dichtheid van 1,080 g / ml tot 1,30 g / mL met KBr behulp van 3,33 g KBr in de 9 ml monster (plasma) of 0,37 g KBr voor elke mL van het monster. Rock of licht schudden van het monster tot alle KBr (zout) is opgelost en over te dragen aan de buis ultracentrifuge. </li><li> Met spuit en naald, zorgvuldig plaatst 3 ml overlay-oplossing # 5 over het monster (tabel 1). </li><li> Verwijder het meeste resterende luchtbellen aan de top van de buis, waardoor 2- 3 mm afstand van meniscus de top van de buis en plaats voorzichtig de gevulde ultracentrifuge buizen SW-40Ti emmers. </li><li> Weeg elke emmer (met de doppen) op de balans, en precies in evenwicht te brengen met de andere emmer + cap, zoals in 1.1.5. </li><li> Plaats de rotor in de ultracentrifuge (zie lijst van materialen). Centrifugeer bij 274.400 xg gedurende 48 uur bij 4 ° C met een # 4 rem. </li><li> verwijderen emmers uit rotor en de buizen voorzichtig uit emmers. </li><li> Haal ongeveer 2 ml van de bovenste laag van de overlay met een injectiespuit en verbogen naald. Dit is de HDL-fractie, die bij 4 ° C of -80 ° C worden opgeslagen. LET OP: Na DGUC HDL kan worden gedialyseerd aan de high-zoutoplossingen te verwijderen. </li><li> Om te dialyseren, plaatst de verzamelde HDL-fractie in een afgesloten dialyse huls (10.000 MW cut-off) en dialyze overnachting in 1 L 1x PBS. Change dialyse buffer (1x PBS) 3 keer meer dan 24 uur. Gentle verstoring van de PBS met een magnetische roer-bar zal dialyse te verbeteren. </li><li> Bepaal de eiwitconcentratie van de DGUC-HDL met een BCA methode 8. </li></ol></li><li> Fast-Protein Liquid Chromatography (FPLC) of Size-Exclusion Chromatography (~ 6 uur) <ol><li> Filter 1.2 mg DGUC-HDL (totaal eiwit) in 500 ul door middel van een 0,22 pm micro-centrifugaal filter (zie lijst van materialen), onmiddellijk voorafgaand aan de injectie. Opmerking: Een extra filtering van het DGUC-HDL monster door een 0,45 urn micro-centrifugaal filter vóór de 0,22 urn filter kan nodig zijn voor enkele voorbeelden. </li><li> Verzamel de gefilterde DGUC-HDL monster, laadt de FPLC (fill) injectiespuit, en ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de spuit voor het injecteren in de FPLC. </li><li> Stel de FPLC debiet tot 0,3 ml / min met een limiet druk op 2,6 MPa. Equilibreren kolommen met 0,2 kolomvolumes (ongeveer 15 ml) buffer alvorens te worden geïnjecteerd monster. Injecteren van het monster met 3 ml buffer in de FPLC (injectieblok) instrument en start de run. Verzamel fracties van 1,5 ml voor een totaal van 72 fracties. </li></ol></li></ol> 2. High-throughput Small RNASequencing (sRNAseq, ~ 9 dagen) <ol><li> RNA isolatie (~ 1 dag) <ol><li> Identificeer de FPLC fracties overeenkomend met DGUC-HDL door bepaling van totaal cholesterol met een colorimetrische kit volgens instructies van de fabrikant. Met behulp van deze FPLC set-up, verwachten te vinden 6 - 7 FPLC fracties die DGUC-HDL. </li><li> Verzamel alle (ongeveer 8 -1 0 ml pool van 1,45 ml fractievolumes) vanaf DGUC-HDL FPLC fracties en concentreer gebruik 10 kDa cut-off centrifugale filtereenheden bij 4000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C of tot HDL concentraat ongeveer 100 uL. </li><li> Verzamel de HDL concentraat en kwantificeren HDL totale eiwitconcentratie met behulp van de BCA methode 8. </li><li> Bepaal de hoogste concentratie van HDL totaal eiwit tot 1 mg, die kan worden porties van elk monster in de set. Bijvoorbeeld, RNA te isoleren uit dezelfde hoeveelheid HDL totaal eiwit voor elk monster. </li><li> Voeren RNA isolatie gebruikteen gemodificeerd protocol (zie lijst van materialen). <ol><li> Voeg 10x volume fenol lysis reagens (zie lijst van materialen) monster en vortex gedurende 1 minuut. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. </li><li> chloroform (20% fenol lysis reagens volume gebruikt in stap 2.1.5.1) toe te voegen en schud krachtig gedurende 15 s. </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten. </li><li> Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 xg bij 4 ° C in een gekoelde centrifuge. </li><li> Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe buis, het vermijden van de interfase. </li><li> Voeg 1,5x volume 100% ethanol aan de waterige fase en vortex gedurende 1 minuut. </li><li> Opslag monsters gedurende ten minste 1 uur of overnacht bij -80 ° C. </li><li> Ga door met de RNA-isolatie protocol met behulp van de meegeleverde mini columns. </li><li> Elueer met 30 gl RNase-vrij H2O Eerst voeg 15 ul H2O direct naar frit, centrifugeren op lage snelheid (2000 x g) gedurende 2 min, enVervolgens draait heel snel (max) gedurende 1 min. Herhaal deze stap met een extra 15 ui H2O </li></ol></li><li> Onmiddellijk naar sRNA bibliotheek generatie of op te slaan bij -80 ° C. </li></ol></li><li> Bibliotheek Generation (~ 6 h) <ol><li> Bereid sRNA cDNA bibliotheken die sRNA de bibliotheek generatie kit protocol, volgens instructies van de fabrikant met een wijziging van de PCR-amplificatie zoals hieronder beschreven. <ol><li> Bereid de PCR mastermix op ijs bevattende 0,5 gl DNase / RNase-vrij H2O, 15 pl PCR Mix (PML) en 1 pi RNA PCR Primer (RP1) per monster (voorzien van een extra 10% te pipetteren fout). </li><li> Voeg 16,5 ul van de PCR-mix aan elke (cDNA) monster. </li><li> Wijs een index / barcode nummer aan elk monster voor het multiplexen en voeg 1 pl PCR Primer Index (om het bijbehorende nummer) naar het monster. </li><li> Voer een snelle draai met behulp van de microcentrifuge. LET OP: Het totale volume moetnu 30 ul per monster. </li><li> Voer de cycling condities voor PCR-amplificatie zoals beschreven in de tabellen 2 en 3. </li></ol></li></ol></li><li> Grootte Selecteer sRNA Library te verwijderen Adapter: Adapters (~ 1,5 uur) <ol><li> Voer bibliotheek size-selectie met behulp van automatische DNA grootte selector volgens de instructies van de fabrikant met de volgende afmetingen parameters: Doel: 156 bp, Start: 135 bp, End: 177 bp, Range Vlag: Breed. </li></ol></li><li> DNA Clean Up (~ 0,5 uur) <ol><li> Opruimen op grootte geselecteerde cDNA sRNA volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Elueer schoon en sRNA cDNA geconcentreerd met 2 x 7 ul DNase / RNase-free H 2 O. </li></ol></li><li> Kwantificeren en beoordelen sRNA cDNA Library opbrengst en kwaliteit (~ 1 uur) <ol><li> Assess sRNA cDNA- bibliotheek kwaliteit en grootte met behulp van een uiterst gevoelige DNA-chip op een bioanalyzer (Lijst van Materials) als per Manufactinstructies urer&#39;s. </li><li> Kwantificeren sRNA individuele cDNA-bibliotheek door gebruikmaking van een uiterst gevoelige DNA assay (List of Materials), volgens instructies van de fabrikant. LET OP: Het is aanbevolen om alle monsters met verschillende indices worden uitgevoerd op dezelfde rijstrook van de stroom cel, indien mogelijk hebben. Als er meer dan één rijstrook nodig is, meng case en controlemonsters gepast. </li></ol></li><li> High-throughput sRNA Sequencing (~ 7 dagen) <ol><li> Pool individuele geïndexeerd sRNA bibliotheken op basis van equimolaire concentraties. </li><li> Screen samengevoegd sRNA bibliotheken voor de kwaliteit van het gebruik van hoge gevoeligheid DNA-chip op de bioanalyzer en bepaal bibliotheek DNA-concentratie als in 2.5.1 - 2.5.2. </li><li> Voer kwantitatieve PCR (qPCR) van de adapter content naar de juiste sequencing diepte zorgen voor het gebruik van de sequencing bibliotheek qPCR kwantificering kit volgens de instructies van de fabrikant (Lijst van Materials). </li><li> Voer sequencing met behulp van een enkel read, 50 b25 M leest / monster, volgens de instructies van de producent - p protocol bij een diepte van ongeveer 20 bereikt. </li></ol></li></ol> 3. Data Analysis (~ 1 dag) <ol><li> Gebruik bcl2fastq2, volgens handleiding instructies voor te verwerken rauwe fastq dossiers van gedemultiplexte monsters (Lijst van Materials). </li><li> Gebruik Cutadapt om adapters 9 trimmen en verwijderen leest &lt;16 nucleotiden (NTS) in de lengte, als per handleiding instructies (Lijst van Materials). </li><li> Verwijder verontreinigingen sequenties die aanwezig zijn in de sRNA bibliotheken, waaronder stop oplossing sequentie (STP: CCACGTTCCCGTGG) en adapter carry-over (CTACAGTCCGACGATC) met behulp van removeSequenceInFastq functie in NGSPERL kader, volgens handleiding instructies (Lijst van Materials). </li><li> Voer kwaliteitscontrole metrics door FastQC behulp Center for Quantitative Wetenschappen (CQS) gereedschappen, zoals per handleiding instructies (Lijst van Materials). </li><li> Genereer niet-redundante lijst van &quot;identiek&quot; leest (collapse redundant gelezen) en opnemen kopie-aantallen met behulp van CQSTools, volgens handleiding instructies (Lijst van Materials). </li><li> Align leest het menselijk genoom met behulp van Bowtie1.1.2 waardoor 1 mismatch (opties: -a -m 100 --best --strata -v 1), per handleiding instructies (Lijst van Materials). </li><li> Voer lezen uitlijning, tellen, en het resultaat samenvatten taken met NGSPERL, volgens handleiding instructies. </li><li> Omzetten geëxporteerd telling tafel om een ​​spreadsheet bestand. </li><li> Normaliseren leest van een specifieke categorie (bijv miRNAs) tot het totale aantal leest voor die klasse (bv, het totale aantal miRNAs gelezen) en het verslag signalen Leest Per Toegewezen miRNA (RPMM). (Bv RPMM = (miR-X / Totaal van miRNA gelezen) * 1.000.000). </li><li> Input genormaliseerd telling tafel als generieke enkele kleur technologie in software voor low-level en high-level differentiële analyses per handleiding instructies (Lijst van Materials). LET OP: Op dit moment zijn er geen goed gekarakteriseerd housekeeping genen / SRNVoor HDL-sRNA. Een piek in gebruik kan worden gemaakt, maar kan problematisch zijn. Normaliseren naar HDL totaal eiwit ingang of het volume wordt geadviseerd. Belangrijker nog, is het raadzaam om sequencing resultaten te valideren door een van de verschillende strategieën om miRNAs en sRNAs met behulp van real-time PCR of kwantitatieve PCR kwantificeren. </li></ol>

<ol><li>Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+diverse+small+RNA+species+in+the+deep+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome.</a> Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)"> MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li>
<li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tRNA-derived+small+RNAs+in+the+global+regulation+of+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing.</a> RNA. 16, 673-695 (2010).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+terminal+and+asymmetric+processing+of+small+RNAs+from+rRNAs%2C+snoRNAs%2C+snRNAs%2C+and+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).</li>
<li>Maute, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-derived+microRNA+modulates+proliferation+and+the+DNA+damage+response+and+is+down-regulated+in+B+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).</li>
<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+pre-processing+Illumina+next-generation+sequencing+short+read+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences.</a> Source Code Biol Med. 9, 8(2014).</li>
<li>Vickers, K. C., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-based+carriers+of+microRNAs+and+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication.</a> Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).</li>
<li>Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+exosome+isolation+and+characterization%3A+evaluation+of+ultracentrifugation%2C+density-gradient+separation%2C+and+immunoaffinity+capture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods.</a> Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).</li>
<li>Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+cell+movement+through+tissues+is+controlled+by+exosome+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion.</a> Nat Commun. 6, 7164(2015).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
<li>Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+RT-PCR+inhibition+observed+in+heparinized+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens.</a> Biotechniques. 23, (1997).</li>
<li>Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparinase+treatment+of+RNA+before+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR.</a> Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).</li>
<li>Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulants+interfere+with+PCR+used+to+diagnose+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis.</a> J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).</li>
<li>Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heparin+on+polymerase+chain+reaction+for+blood+white+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells.</a> J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).</li>
<li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+value+of+quantitative+PCR-based+viral+burden+analysis+for+eight+human+herpesviruses+in+pediatric+solid+organ+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients.</a> J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).</li>
<li>McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+the+effects+of+EDTA+and+citrate+anticoagulants+on+platelet+count+and+mean+platelet+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume.</a> Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).</li>
<li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circ Res. 107, 677-684 (2010).</li>
<li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling%3A+approaches+and+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).</li>
<li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6, e24145(2011).</li>
<li>Kannan, M., Atreya, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+profiling+of+human+red+blood+cells+during+storage+for+52+selected+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs.</a> Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).</li>
<li>Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+erythrocyte+microRNA+expression+in+sickle+cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases.</a> PLoS One. 3, e2360(2008).</li>
<li>Balzano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+Stability+in+Frozen+Plasma+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">miRNA Stability in Frozen Plasma Samples.</a> Molecules. 20, 19030-19040 (2015).</li>
<li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li>
<li>Cheung, M. C., Wolf, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+ultracentrifugation+on+apolipoprotein+A-I-containing+lipoprotein+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations.</a> J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).</li>
<li>Kunitake, S. T., Kane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+integrity+of+high+density+lipoproteins+in+the+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge.</a> J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol is ontworpen om miRNAs en andere sRNAs kwantificeren high-throughput sequencing of real-time PCR op zeer zuiver HDL. Zoals bij elke andere aanpak dient speciale overwegingen worden om elke stap in het proces van het zuiveren HDL en RNA en kwantificeren sRNAs. Dit protocol is bedoeld voor projecten ab ≥ 2 ml plasma. Toch kan een hoge kwaliteit RNA analyses gevolg zijn afgerond met HDL gezuiverd uit slechts 80 ul humaan of muizen plasma middels affiniteitschromatografie; echter, grotere uitgangspunt plasma vo...

Extracellulaire niet-coderende kleine RNAs (sRNAs) vertegenwoordigen een nieuwe klasse van ziekten biomerkers en potentiële therapeutische doelwitten en waarschijnlijk cel-cel 1 te vergemakkelijken. De meest bestudeerde soort sRNA zijn microRNAs (miRNA) die ongeveer 22 gen in lengte en van langere voorloper vormen en primaire transcripts 2 worden verwerkt. miRNAs is aangetoond post-transcriptioneel genexpressie door middel van onderdrukking van eiwittranslatie en inductie van mRNA degradatie 2. Toch miRNAs zijn slechts een van de vele soorten sRNAs; zoals sRNAs kan worden afgesplitst van ouder tRNA (-tRNA afgeleid sRNAs, TDR), kleine nucleaire RNA&#39;s (sRNA-afgeleide sRNAs, sndRNA), kleine nucleolair RNA&#39;s (snoRNA-afgeleide sRNAs, snRNA), ribosomaal RNA (rRNA-afgeleide sRNAs, RDR ), Y RNAs (YDR), en andere diverse RNAs 1. Enkele voorbeelden van deze nieuwe sRNAs gemeld Soortgelijke miRNAs functioneren; De biologische functions van veel van deze sRNAs nog worden bepaald, hoewel rollen in genregulatie waarschijnlijk 3-6. Het meest interessante miRNAs en andere sRNAs zijn stabiel aanwezig in extracellulaire vloeistoffen zoals speeksel, plasma, urine en gal. Extracellulaire sRNAs zijn waarschijnlijk beschermd RNases via hun associatie met extracellulaire blaasjes (EV), lipoproteïnen en / of extracellulaire ribonucleoproteïne complexen. Eerder hebben we gemeld dat lipoproteïnen, namelijk high-density lipoproteïnen (HDL), transport miRNAs in plasma 7. In deze studie werden HDL geïsoleerd met behulp van een sequentiële werkwijze dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie (DGUC), fast-proteïne vloeistofchromatografie (grootte-uitsluitingschromatografie gelfiltratie FPLC) en affiniteitschromatografie (anti-apolipoproteïne AI (apoA-I) immunoprecipitatie ) 7. Waarbij zowel real-time PCR-gebaseerde lage-dichtheid arrays en individuele miRNA assays werden miRNA niveaus gekwantificeerd HDL geïsoleerd uit heelthy en hypercholesterolemic onderwerpen 7. Met behulp van deze aanpak, waren we in staat om miRNAs profileren en te kwantificeren specifieke miRNAs in zeer zuivere HDL preparaten. Sinds 2011 hebben we vastgesteld dat hoewel affiniteitschromatografie verhoogt HDL zuiverheid antilichaam verzadiging sterk beperkt rendement en kunnen kosten prohibitief zijn. Momenteel, ons protocol beveelt een tweestaps opeenvolgende tandemmethode van DGUC gevolgd door FPLC, die ook produceert HDL monsters van hoge kwaliteit voor downstream RNA isolatie en kwantificering sRNA. Als gevolg van de recente vooruitgang in high-throughput sequencing van sRNAs (sRNAseq), bijvoorbeeld, miRNAs, en het toegenomen bewustzijn van andere niet-miRNA sRNA klassen, sRNAseq is de huidige state-of-the-art in miRNA en sRNA profilering. Als zodanig, ons protocol raadt het kwantificeren van miRNAs en andere sRNAs op HDL monsters met behulp van sRNAseq. Niettemin totaal RNA geïsoleerd uit HDL kan ook worden gebruikt om individuele miRNAs en andere sRNAs kwantificeren of valideren sRNAseq resultaten middels real-time PCR eenpproaches. Hier beschrijven we in detail een protocol voor het verzamelen, zuivering, de kwantificering, data-analyse, en validatie van zeer zuiver HDL-sRNAs. Het algemene doel van dit artikel is om de haalbaarheid en het proces van sRNA kwantificering demonstreren in zeer zuiver HDL geïsoleerd uit menselijk plasma.

<table><tbody><tr><td>Ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td>Optima XPN-80</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>SW-41Ti</td></tr><tr><td>AKTA Pure FPLC System</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>10/300 gl</td></tr><tr><td>SynergyMx</td><td>BioTek Instruments</td><td>7191000</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004525</td><td>Sorvall ST40R</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22629867</td><td>5417R (aangeschaft via USA Scientific)</td></tr><tr><td>Microfuge&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>2631-0006</td><td></td></tr><tr><td>PippenPrep</td><td>Sage Science</td><td>PIP0001</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Assay</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Library qPCR Quantification Kit</td><td>Illumina</td><td>SY-930-1010</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12k Flex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471134</td><td></td></tr><tr><td>EpMotion Robot</td><td>Eppendorf</td><td>960000111</td><td>5070</td></tr><tr><td>Ultra-clear centrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Bromide</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P205-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conische buis</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Micro-centrifugaalfilters 0.45 &micro;m</td><td>Millipore</td><td>UFC30HV00</td><td></td></tr><tr><td>Micro-centrifugaalfilters 0.22 &micro;m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>miRNAEasy Total RNA Isolation Kits</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Total Cholesterol colormetrische kit</td><td>Cliniqa (Raichem)</td><td>R80035</td><td></td></tr><tr><td>10.000 m.w. cut-off centrifugatiefilter</td><td>Amicon</td><td>UFC801024</td><td>aangeschaft via Millipore</td></tr><tr><td>PCR stripbuizen</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td>aangeschaft via Fisher</td></tr><tr><td>microRNA RT kit</td><td>Life Technologies</td><td>4366597</td><td>Voor 1000 reacties</td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>Life Technologies</td><td>4440041</td><td>50 mL fles</td></tr><tr><td>Pierce BCA kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Clean and Concentrator Kit</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Dialysebuizen</td><td>Spectrum Labs</td><td>132118</td><td>aangeschaft via Fisher</td></tr><tr><td>bcl2fastq2</td><td>Illumina</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>NGSPERL</td><td>github.com/shengqh/ngsperl</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>CQSTools</td><td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Bowtie 1.1.2&nbsp;</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>GeneSpringGX13.1.1</td><td>Agilent</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr></tbody></table>

isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor niet-coderende rna kwantificering klein

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

De diversiteit van kleine niet-coderende RNA&#39;s (sRNA) breidt zich snel uit en hun rol in biologische processen, met inbegrip van genregulatie, zijn in opkomst. Meest interessant zijn sRNAs ook gevonden buiten de cellen en zijn stabiel in alle biologische vloeistoffen. Als zodanig extracellulaire sRNAs vertegenwoordigen een nieuwe klasse van ziekten biomerkers en zijn waarschijnlijk betrokken bij cel signalering en intercellulaire communicatie netwerken. Hun potentieel als biomarkers beoordelen, kan sRNAs worden gekwantificeerd in plasma, urine en andere vloeistoffen. Niettemin volledig begrijpen van de invloed van extracellulaire sRNAs endocriene signalen, is het belangrijk om te bepalen welke dragers transporteren en te beschermen in biologische vloeistoffen (bijvoorbeeld plasma), die cellen en weefsels bijdragen aan extracellulaire sRNA zwembaden, en cellen en weefsels in staat van het accepteren en het gebruik van extracellulaire sRNA. Om deze doelen te bereiken, is het essentieel om zeer zuivere populaties van extracellulaire dragers isolerenvoor sRNA profilering en kwantificering. We hebben eerder aangetoond dat lipoproteïnen, in het bijzonder high-density lipoproteïnen (HDL), functionele microRNA&#39;s (miRNA) tussen cellen en HDL-miRNAs is significant veranderd bij ziekte vervoeren. Hier hebben we detail een nieuw protocol dat tandem HDL isolatie gebruikt met een dichtheid-gradiënt ultracentrifugatie (DGUC) en fast-eiwit-vloeistofchromatografie (FPLC) tot zeer pure HDL krijgen voor downstream profilering en kwantificering van alle sRNAs, met inbegrip van miRNAs, met behulp van zowel een hoge -throughput sequencing en real-time PCR benaderingen. Dit protocol zal een waardevolle bron voor het onderzoek naar sRNAs op HDL zijn.

Dit protocol is een reeks gevestigde werkwijzen met elkaar verbonden te houden met de kwantificatie van sRNAs op zeer zuiver HDL door high-throughput sequencing of real-time PCR (figuur 1). Om de haalbaarheid en de impact van dit protocol te demonstreren, werd HDL gezuiverd uit menselijk plasma door de tandem DGUC en FPLC methode. Verzamelde FPLC fracties overeenkomende met HDL (door cholesterolverdeling) werden geconcentreerd en totaal RNA werd geïsoleerd uit 1 mg van H...

Dit protocol beschrijft de isolatie en kwantificering van kleine RNA's met hoge dichtheidslipoproteïnen.

Isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor niet-coderende RNA kwantificering Klein

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Het algemene doel van dit protocol is het kwantificeren van kleine niet-coderende RNA's op gezuiverde lipoproteïnen. Dit protocol kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de lipoproteïnen, zoals het definiëren van kleine RNA-signaturen van lipoproteïnen bij gezondheid en ziekte, evenals het verder ontwikkelen van kleine RNA's van lipoproteïnen als ziektebiomarkers of cel-naar-cel-berichten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat men zeer zuivere lipoproteïnen kan analyseren op veranderingen in kleine RNA's bij ziekte of experimentele condities.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van cardiometabole ziekten, aangezien extracellulaire RNA's een nieuwe klasse ziektebiomarkers vormen en lipoproteïne small RNA een boeiend potentieel bieden als drug-targets in toekomstige studies. Hoewel deze methode is ontworpen voor HDL small RNA's, kan deze ook worden aangepast voor very low density en low density lipoprotein small RNA's. Over het algemeen kunnen personen die onbekend zijn met deze methode problemen ondervinden door een gebrek aan passende apparatuur en expertise bij het voorbereiden van monsters voor dichtheidsgradi

isolation-high-density-lipoproteins-for-non-coding-small-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Deze paper toont voor de isolering, zuivering en detectie van exosomes, evenals technieken voor de analyse van hun moleculaire inhoud. Deze methoden zijn aanpasbaar voor exosome isolatie van zowel de media voor celkweek en biologische vloeistoffen, en kan daarna analyse van moleculaire content ook nuttig zijn in functionele studies.

Isolatie en karakterisatie van RNA-bevattende Exosomes

Een stap voor stap-protocol om het isoleren en identificeren van RNA bijbehorende complexen door middel van RIP-Chip.

Werkwijze voor het isoleren en identificeren van mRNAs, microRNA en eiwitcomponenten van ribonucleoproteïne complexen uit celextracten met RIP-Chip

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het extraheren van kleine RNA uit menselijk serum. We hebben deze methode om microRNA kanker serum te isoleren voor gebruik in DNA arrays en ook singleplex kwantitatieve PCR. Het protocol maakt gebruik van fenol en guanidiniumthiocyanaat reagentia met modificaties van hoge kwaliteit RNA opleveren.

Isolatie van Kleine Noncoding RNA&#39;s uit humaan serum

MicroRNA's (miRNA's) zijn een wijdverspreid geconserveerde klasse van regulerende moleculen. Hier beschrijven we een miRNA-kloonmethode die afhankelijk is van twee krachtige ligatiefasen gevolgd door high-throughput sequencing. Onze methode maakt nauwkeurige genoom-wide kwantificering van miRNA's mogelijk.

Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing

Genexpressie analyse van een subset van cellen in een specifiek weefsel vormt een grote uitdaging. In dit artikel wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit totaal RNA van een specifieke cel populatie te isoleren door het combineren van een snelle immunolabeling methode met lasermicrodissectie.

RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

MicroRNAs spelen een belangrijke regulerende rol en zijn in opkomst als nieuwe therapeutische doelen voor verschillende ziekten bij de mens. Het is aangetoond dat miRNAs worden vervoerd in high density lipoproteïnen. Wij hebben een eenvoudige methode om gezuiverd HDL geschikt voor miRNA analyse uit menselijk plasma snel isoleren ontwikkeld.

Snelle en vereenvoudigde methode voor High Through-put Isolatie van miRNA uit Highly Purified high density lipoproteïne

Epigenetische factoren kunnen communiceren met genetische programma's voor het moduleren van genexpressie en de regulering van de B-cel functie. Door stimulatie van de in vitro B-cel, qRT-PCR, en high-throughput microRNA-sequence en mRNA-sequence benaderingen te combineren, kunnen we analyseren de epigenetische modulatie van miRNA en gen-expressie in B-cellen.

Genoom-brede analyse van HDAC-Inhibitor-gemedieerde modulatie van microRNAs en mRNAs in B cellen geïnduceerde Undergo klasse-switch DNA recombinatie en Plasma celdifferentiatie

Vetdruppels belangrijke organellen voor de replicatie van verschillende pathogenen, waaronder het hepatitis C virus (HCV). We beschrijven een methode om lipidedruppeltjes voor de kwantitatieve massaspectrometrie van geassocieerde eiwitten te isoleren; kan worden gebruikt onder verschillende omstandigheden, zoals virusinfectie, omgevingsstress of geneesmiddelbehandeling.

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Hier, wordt een kwantitatief real-time op de kettingreactie-gebaseerd protocol van de polymerase voorgesteld voor de bepaling van de inheemse micro-RNA inhoud (absoluut/verwant) van lipoprotein deeltjes. Bovendien is een methode voor het verhogen van het micro-RNA-niveau, evenals een methode voor het bepalen van de cellulaire opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes, aangetoond.

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

Dit protocol biedt een efficiënte collagenase-verteringsmethode voor isolatie van levensvatbare adipocyten en stromale vasculaire fractie-SVF-cellen uit menselijk visceraal vet in één enkel proces, inclusief methodologie om hoogwaardig RNA uit adipocyten te verkrijgen en fenotypificatie van SVF-macrofagen door kleuring van meerdere membraangebonden markers voor analyse door middel van flowcytometrie.

Isolatie van levensvatbare vetcellen en stromale vasculaire fractie uit menselijk visceraal vetweefsel geschikt voor RNA-analyse en macrofaagfenotypering

Leer de isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor kwantificering van kleine niet-coderende RNA's. Deze methode helpt onderzoekers bij het analyseren van zuivere lipoproteïnen voor ziektebiomerkers.

Isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor niet-coderende RNA kwantificering Klein

Meer video's verkennen