Isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor niet-coderende RNA kwantificering Klein

Het algemene doel van dit protocol is om kleine niet-coderende RNA's op gezuiverde lipoproteïnen te kwantificeren. Dit protocol kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het lipoproteïneveld, zoals het definiëren van kleine RNA-handtekeningen van lipoproteïnen bij gezondheid en ziekte, evenals het bevorderen van kleine RNA's van lipoproteïnen als ziektemarkers of berichten tussen cellen. Het grote voordeel van deze techniek is dat men zeer zuivere lipoproteïnen kan analyseren op veranderingen in kleine RNA's bij ziekte of experimentele omstandigheden.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit voor de therapie van cardiometabole ziekten, omdat extracellulaire RNA's een nieuwe klasse van ziektemarkers zijn en kleine RNA's van lipoproteïnen opwindend potentieel hebben als doelwitten voor geneesmiddelen in toekomstige studies. Hoewel deze methode is ontworpen voor kleine HDL-RNA's, kan deze ook worden aangepast voor kleine RNA's van zeer laag dichtheid en laag dichtheid lipoproteïnen. Over het algemeen kunnen mensen die nieuw zijn in deze methode worstelen vanwege gebrek aan geschikte apparatuur en expertise in het voorbereiden van monsters voor dichtheidsgradiënt ultracentrifugering.

Dit protocol bestaat uit gevestigde methoden die samenwerken voor de kwantificering van kleine RNA's op zeer zuivere HDL, met behulp van high-throughput sequencing of real-time PCR. Deze video gaat over de zuivering van de HDL. Dit protocol zal worden gedemonstreerd door mijn assistent, Evan Shadari.

Voeg om te beginnen 90 microliter 100x antioxidanten toe aan negen milliliter plasma. Pas vervolgens de dichtheid van het plasma aan 1,025 gram per milliliter aan door 0,251 gram kaliumbromide toe te voegen aan elke negen milliliter plasma. Wieg het plasma op kamertemperatuur totdat al het zout is opgelost.

Breng vervolgens het plasma over naar ultracentrifugebuizen en zorg ervoor dat er een laag bubbels bovenop zit. Er mag geen lucht onder het plasma vastzitten. Bereid vervolgens een 18-gauge naald voor door een 90-graden bocht een centimeter van de punt toe te voegen, met de afgeschuinde kant naar boven.

Gebruik vervolgens een spuit en de gebogen naald om voorzichtig drie milliliter overlagloosing nummer één op het plasma te plaatsen. Verwijder het grootste deel van de bubbels op het oppervlak en laat twee tot drie millimeter tussen het meniscus en de rand van de buis. Plaats vervolgens de buizen voorzichtig in SW 40 Ti-emmers.

Weeg elke emmer met de doppen en balanceer de emmers die tegenover elkaar in de centrifuge zullen staan exact. Plaats vervolgens de rotor in de ultracentrifuge en laat deze 24 uur lang draaien bij 274.400 keer G op vier graden Celsius, met de pauze gemiddeld ingesteld op vier. Verwijder de volgende dag voorzichtig de emmers uit de rotor en til de buizen uit de emmers.

Verwijder vervolgens langzaam twee milliliter uit de bovenste laag van de overlaag, met behulp van een spuit en een gebogen naald. Dit is de VLDL IDL-fractie. Verzamel vervolgens de resterende zeven milliliter plasma en breng het over naar een 15 milliliter conische buis.

Breng het volume van het plasma op tot negen milliliter door overlagloosing nummer twee toe te voegen. Pas vervolgens de dichtheid aan 1,080 gram per milliliter door 0,746 gram kaliumbromide toe te voegen. Wieg vervolgens het monster voorzichtig om het zout op te lossen, wat ongeveer 20 minuten zal duren.

Breng vervolgens het monster over naar een ultracentrifugebuis zonder lucht vast te houden. Zorg ervoor dat er een laag bubbels bovenop wordt gemaakt. Gebruik de gebogen naald om voorzichtig drie milliliter overlagloosing nummer drie te overleggen.

Verwijder vervolgens het grootste deel van de bubbels en laad de buizen voorzichtig in de SW 40 Ti-emmer. Balanceer ze en draai ze, zoals eerder beschreven, gedurende 24 uur. Verwijder de volgende dag voorzichtig twee milliliter uit de bovenste laag van de overlaag met behulp van de gebogen naald.

Dit is de LDL-fractie. Breng vervolgens het resterende monster over naar een nieuwe 15 milliliter conische buis en breng het volume op tot negen milliliter met oplossing nummer vier. Pas nu de dichtheid aan 1,30 gram per milliliter door ongeveer 3,33 gram kaliumbromide toe te voegen en wieg het monster voorzichtig totdat het zout is opgelost.

Breng vervolgens het monster over naar een ultracentrifugebuis en overleg voorzichtig drie milliliter oplossing nummer vijf. Ultracentrifugeer vervolgens het monster zoals eerder, maar gedurende 48 uur. Twee dagen later verzamelt u de bovenste twee milliliter van de overlaag met behulp van een spuit en een gebogen naald.

Dit vormt de HDL-fractie. Om de oplossingen met hoge zoutconcentratie te verwijderen, brengt u de HDL-fractie over naar een natte dialysehuls met een molecuulgewicht van 10.000. Dialyseer het vervolgens gedurende 24 uur in een liter 1 XPBS met zacht roeren bij vier graden Celsius.

Vervang de PBS-oplossing driemaal gedurende de 24-uursperiode. Bepaal vervolgens de eiwitconcentratie van de HDL-fractie met behulp van een BCA-methode. Extracellulaire vesicles of exosomen hebben een vergelijkbare dichtheid als kleine HDL en kunnen dus in dezelfde dichtheidsfractie als de HDL aanwezig zijn.

Daarom vereist de HDL-fractie verdere zuivering door FPLC. Direct voor het gebruik van de FPLC, laat 1,2 milligram van de DGUC HDL-fractie in 500 microliter oplossing door een 0,22 micron centrifugaalfilter lopen. Verzamel het gefilterde monster in een FDLC-injectiespuit en zorg ervoor dat er geen luchtbellen vastzitten.

Stel vervolgens de FPLC-stroomsnelheid in op 0,3 milliliter per minuut met een druklimiet van 2,6 megapascal. Equilibreer vervolgens de kolommen met 0,2 kolomvolumen buffer. Injecteer nu het monster met drie milliliter buffer in het FPLC-instrument en start de run.

Verzamel 1,5 milliliter fracties voor een totaal van 72 fracties. Identificeer de FPLC-fracties die overeenkomen met DGUC HDL door de totale