Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van kleine moleculen die in staat zijn de interactie tussen TRIP8b en HCN-kanalen te verstoren. Deze methode identificeert kandidaatmoleculen die ontwikkeld kunnen worden tot nieuwe behandelingen voor depressie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze in een hoog doorvoerformaat kan worden voltooid.

Deze techniek heeft implicaties voor de ontwikkeling van een nieuwe therapie voor ernstige depressieve stoornis omdat ons laboratorium heeft aangetoond dat het verstoren van TRIP8b-binding aan HCN mogelijk van therapeutisch voordeel kan zijn. Hoewel deze methode met depressie in gedachten is ontwikkeld, kan het verstoren van de interactie tussen TRIP8b en HCN ook van therapeutisch voordeel zijn bij andere aandoeningen zoals chronische pijn. Visuele demonstratie van dit protocol is belangrijk omdat het de voordelen illustreert van het gebruik van geautomatiseerde hoogdoorvoerinstrumenten om fundamenteel en translationeel onderzoek te bevorderen in open faciliteiten zoals het hoogdoorvoeranalyselaboratorium van de Northwestern University.

Na het zuiveren van het TRIP8b 241-602 eiwitfragment en het onderzoeken van eiwit-eiwitinteracties met een positieve controle volgens het tekstprotocol, bevriest u aliquoten van TRIP8b en HCN1-FITC en bewaart u deze op ijs. Gebruik FP Buffer om 20 milliliter van 2 micromolar TRIP8b en 50 nanomolar HCN1-FITC te bereiden. Deel vervolgens 25 microliter van het mengsel in elke put van een laag bindende 384-putten zwarte microtiterplaat uit.

Voor bibliotheeksscreening, gebruik een akoestische vloeistofhandler om 100 nanoliters van verbindingen in elke put van kolommen 3 tot 22 te doseren voor een uiteindelijke concentratie van 40 micromolen. Doseer 100 nanoliters van DMSO in elke put van kolommen 1 en 23 als negatieve controles. Doseer 100 nanoliters van ongelabeld HCN1-peptide in elke put van kolommen 2 en 24 als positieve controles met een uiteindelijke concentratie van 10 micromolen.

Incubeer de platen gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Meet de fluorescentiepolarisatie met een platelezer. Alternatief kunnen platen gedurende 16 uur bij 4 graden Celsius worden bewaard voordat ze worden uitgelezen.

Gebruik de volgende vergelijking om het percentage remming te berekenen waarbij XN de genormaliseerde procentuele remming is die overeenkomt met het signaal X.X positief is het gemiddelde signaal van de positieve controleputten en X negatief is het gemiddelde signaal van de negatieve controleputten. Om hits met meer dan 50% remming te valideren, bereidt u een mastermix van 20 milliliter van 2 micromolar TRIP8b en 50 nanomolar HCN1 TAMRA in FP-buffer. Deel 25 microliter van de mastermix in elke put van een zwarte 384-putten microtiterplaat uit.

Voeg vervolgens 100 nanoliters van verbindingen toe uit een plaat met tweedubbele seriële verdunningen van elke actieve verbinding in de respectieve putten. Voor de negatieve controleputten voegt u 100 nanoliters van DMSO toe. Voeg voor een positieve controle 100 nanoliters van serieel verdund ongelabeld HCN1-peptide toe met eindconcentraties variërend van 200 micromolen tot 0,1 micromolen.

Incubeer de plaat gedurende twee uur bij kamertemperatuur, of gedurende 16 uur bij 4 graden Celsius. Meet de fluorescentiepolarisatie met een platelezer. Bereken de IC50-waarden door de concentratieafhankelijke FP-gegevens van elk compound te passen met behulp van een niet-lineair regressiemodel met 4 parameters.

Bevriest u elk een aliquot van HIS-gelabeld TRIP8b en GST-gelabeld HCN1-fusie-eiwitten en bewaart u deze op ijs. Bereid 1 milliliter van 200 nanomolar HIS TRIP8b en 20 nanomolen van GST-HCN1C40 in assaybuffer voor voor elk compound dat getest moet worden. Gebruik een 16-kanaals pipet om 7 microliter van het HIS-TRIP8b GST-HCN1C40-mengsel toe te voegen aan drie putten per rij van rijen A tot en met N om elk compound in drievoud te testen.

Centrifugeer de plaat kort om ervoor te zorgen dat de vloeistoffen op de bodem van elke put zitten en om eventuele bubbels te verwijderen. Dispenseer vervolgens de te testen hit-verbindingen in de plaat om een uiteindelijke concentratie van 200 micromolen in rij A te bereiken en te eindigen met 0,1 micromolen in rij L. Voeg hetzelfde volume DMSO toe aan rij M. Deel vervolgens ongelabeld HCN1-peptide tot een uiteindelijke concentratie van 10 micromolen in rij N. Schud de plaat gedurende twee minuten en incubeer gedurende 2,5 uur bij kamertemperatuur. Verdun de Anti-GST-acceptorkralen 1 tot 50 met assaybuffer.

Voeg met een 16-kanaals pipet 3,5 microliter van de verdunde acceptorkralen toe aan elke put van de plaat en meng door voorzichtig te pipetten om bubbels te voorkomen. Incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende een uur. Verdun de Nickel Chelate-donorkralen 1 tot 50 met assaybuffer terwijl de mengsel niet wordt blootgesteld aan licht.

Voeg 3,5 microliter van de verdunde donorkralen toe aan elke put van de plaat en meng voorzichtig, luchtbellen vermijden. Verzegeld de plaat en incubeer het in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1,5 uur. Gebruik vervolgens een platelezer om de plaat te lezen met de hier vermelde meetparameters.

Bereken tenslotte de IC50-waarden door de gegevens voor elk compound te passen met behulp van een niet-lineair regressiemodel met 4 parameters. Om de interactie met HCN1 TAMRA te beoordelen, werd TRIP8b getitreerd in een vaste concentratie van HCN1 TAMRA. Deze grafiek toont dat naarmate de concentratie van TRIP8b toeneemt, meer HCN1 TAMRA-moleculen worden gebonden en de polarisatie toeneemt.

In dit experiment, terwijl ongelabeld HCN1 werd getitreerd in een vaste concentratie van TRIP8b en HCN1 TAMRA, werd het gelabelde peptide verplaatst en nam het signaal af. Een hoogdoorvoerscreening toont het percentage remming van elke compound weergegeven door enkele punten op de grafiek. De resultaten van deze screening worden weergegeven met positieve en negatieve controles, en het