Een nieuwe techniek voor het genereren en Observing Chemiluminescence in een biologische instelling
9 maart 2017
Dit protocol beschrijft een nieuwe intraoperatieve beeldvormingstechniek die gebruik maakt van een rutheniumcomplex als bron van chemiluminescente lichtemissie, waardoor hoge signaal-ruisverhoudingen worden geproduceerd tijdens in vivo beeldvorming. Intraoperatieve beeldvorming is een groeiend veld dat de manier waarop chirurgische ingrepen worden uitgevoerd, zou kunnen revolutioneren.
Het algemene doel van dit protocol is om een nieuwe preklinische, interoperatieve, chemiluminescente beeldvormingstechniek aan te bieden die voordelen kan bieden boven bestaande optische technieken in termen van signaal-ruisverhoudingen en detectielimieten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen die in veel vakgebieden met betrekking tot de biologische wetenschappen niet toegankelijk waren met traditionele optische beeldvormingstechnieken. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze een hoge signaal-ruisverhouding heeft en dat deze geen direct licht of straling vereist.
Wat we hebben gevonden is dat de implicaties van deze techniek zich echt uitstrekken naar interoperatieve beeldvorming van meerdere ziektetoestanden, inclusief kanker, vanwege de hoge signaal-ruisverhoudingen die deze techniek te bieden heeft. Aangezien voor deze techniek geen invallend licht nodig is, zijn er geen problemen met absorptie van invallend licht. Verder is er een grote chemische toolbox beschikbaar om het chemiluminescente kernmolecuul te functionaliseren.
Om de procedure te beginnen, bereid 100 microliter standaardoplossing van tris(bypyridine)ruthenium(II)chloride in omgekeerd osmosewater. Combineer vervolgens elke standaard met 100 microliter van een 25 millimolair oplossing van ammonium ceriumnitraat in omgekeerd osmosewater op een microscoopglaasje. Open de bioluminescentielezer-beeldvormingssoftware en klik op initialiseren.
In de beeldvormingsmodus, zorg ervoor dat luminescent en fotograaf zijn aangevinkt en fluorescerend is niet aangevinkt. Stel de luminescente belichtingstijd, binning, f/stop en emissiefilterparameters in. Stel de fotobelichtingstijd, binning en f/stop parameters in.
Stel vervolgens de hoogte van het onderwerp overeenkomstig in met het te beeldvormen monster. Stel het gezichtsveld in op B voor een afstand van 14 centimeter tussen de camera en de monsterstandaard. Bedek de bodem van de bioluminescentielezer-beeldvormingskamer op de monsterstandaard met zwart constructiepapier.
Plaats vervolgens het eerste glaasje met de druppel standaardmengsel op de monsterstandaard met de druppel gecentreerd in het groene lichtkruishaar van de lichtbak. Vul vervolgens de drie-ounce spuitfles van een op maat gemaakte vernevelaar met de 1:3 oplossing van triethylamine in een 50/50 oplossing van water en ethanol. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de aspiratiepijp zijn.
Plaats de vernevelaareenheid in de beeldvormingskamer met de spuitmond gericht op de te beeldvormen druppel zonder het camerabeeld van de druppel te belemmeren. Zorg ervoor dat de aan/uit-schakelaar van de vernevelaar en de aan-indicator aan staan, de magnetische schakelknop uit staat en de aansluitkabels van de vernevelaar en de afstandsbediening niet verstrikt zijn. Bedek hete plekken zoals markeringen op het glaasje met kleine stukjes zwart constructiepapier.
Plaats ten minste 40 centimeter van de afstandsbedieningskabel van de vernevelaar in de beeldvormingskamer. Sluit de deur van de kamer voorzichtig zonder de kabels van de vernevelaar te knijpen. Klik in de instrumentsoftware op verwerven, schakel auto-opslaan in en stel de pad van het gegevensbestand in.
Start de beeldvormingssequentie. Wanneer de sluiter opengaat met een hoorbaar klikje, schakel de vernevelaarschakelaar drie keer om om drie uitbarstingen van de triethylamineoplossing op het monster te spuiten. Herhaal de procedure met elk standaardmonster om de minimaal detecteerbare concentratie van het rutheniumbeeldvormingsmiddel te bepalen.
Om de in vivo-beeldvormingsprocedure te beginnen, bereid 100 microliter oplossing met tussen de 8 en 33 nanomolen van tris(bypyridine)ruthenium(II)chloride in fosfaatgebufferd zoutoplossing. Bereid een 25-millimolaire waterige oplossing van ammonium ceriumnitraat. Injecteer vervolgens intraveneus 100 microliter van het rutheniumbeeldvormingsmiddel in de staartader van gezonde muizen.
Offer de muizen 10 minuten na injectie op door kooldioxide-asfyxiatie. Verwijder de huid van het romp met een Y-snede en verwijder vervolgens de costale boog om het hart en de longen bloot te leggen. Snijd een uitlaat in het rechter atrium en injecteer 20 milliliter PBS door een naald van 24 gauge in het linker ventrikel.
Snijd door de buikhuid om de nier en lever bloot te leggen. Als het orgaan van belang de lever, nier of milt is, maak een zichtbare longitudinale snede door het orgaan. Bereid een nieuwe beeldvormingssequentie voor in de bioluminescentielezer-software.
Voor beeldvorming van de hele buik, plaats de muis in de beeldvormingskamer met de open buik naar de camera gericht en het hoofd naar de achterkant van het instrument. Centreer het orgaan van belang in het groene lichtkruishaar. Spoel de spuitfles en de spuitmond van de vernevelaareenheid grondig door en vul vervolgens de fles met de ammonium ceriumnitraatoplossing.
Plaats de vernevelaar in de beeldvormingskamer met de spuitmond op de beeldvormingsplaats gericht. Zorg ervoor dat de camera onbelemmerd is, dat de kabels niet verstrikt zijn en dat ten minste 40 centimeter van de afstandsbedieningskabel in de kamer is. Sluit de kamer en start de beeldvormingssequentie.
Wanneer de sluiter opent met een klik, schakel de schakelaar drie keer om om drie uitbarstingen van het oxidatiemiddel op de beeldvormingsplaats te spuiten. Verwijder na de beeldvorming de vernevelaareenheid en spoel de spuitmond grondig om kristallisatie van het ammonium ceriumnitraat te voorkomen. Voor verdere individuele orgaanbeeldvorming en kwantificering, verwijder de muis uit het instrument en verwijder de inwendige organen beginnend vanaf de open lichaamsholte.
Snijd door de huid van de achterpoot om monsters van spierweefsel te verwijderen. Als het orgaan van belang de lever, nier of milt is, snijd het orgaan longitudinaal doormidden. Plaats vervolgens het orgaan op een petrischaal of stuk zwart constructiepapier.
Beeld elk orgaan op dezelfde manier af als het hele dier, spoel de spuitmond na elke sequentie grondig af. In deze procedure werden muizen geïnjecteerd met een rutheniumgebaseerd beeldvormingsmiddel en
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een nieuwe intraoperatieve beeldvormingstechniek die gebruikmaakt van een rutheniumcomplex voor chemiluminescente lichtemissie, waardoor de signaal-ruisverhoudingen tijdens in vivo beeldvorming worden verbeterd. Deze innovatieve benadering heeft het potentieel om chirurgische procedures te transformeren door duidelijkere beeldvormingsresultaten te bieden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Intraoperatieve beeldvorming
- Chemiluminescente technieken
- Chirurgische procedures
Achtergrond
- Bestaande optische beeldvormingstechnieken hebben beperkingen wat betreft de signaal-ruisverhoudingen.
- Hoge signaal-ruisverhoudingen zijn cruciaal voor nauwkeurige beeldvorming in chirurgische settings.
- Traditionele beeldvormingsmethoden vereisen vaak invallend licht, wat kan leiden tot absorptieproblemen.
- Er is een uitgebreide chemische toolkit beschikbaar voor het functionaliseren van het chemiluminescente kernmolecuul.
Doel van de studie
- Om een nieuwe preklinische intraoperatieve beeldvormingstechniek te introduceren.
- Om de detectielimieten en de helderheid van de beelden te verbeteren ten opzichte van bestaande methoden.
- Om een beter begrip te faciliteren van diverse ziektebeelden, waaronder kanker.
Gebruikte methoden
- Ontwikkeling van een rutheniumcomplex voor chemiluminescente lichtemissie.
- Evaluatie van signaal-ruisverhoudingen bij beeldvorming.
- Vergelijking met traditionele optische beeldvormingstechnieken.
- Toepassing van de techniek in diverse biologische wetenschapsgebieden.
Belangrijkste resultaten
- De nieuwe techniek biedt aanzienlijk hogere signaal-ruisverhoudingen.
- Het elimineert de noodzaak voor invallend licht, waardoor absorptieproblemen worden vermeden.
- Aangetoonde effectiviteit bij het in beeld brengen van meerdere ziektestadia.
- Potentieel voor bredere toepassingen in de biologische wetenschappen.
Conclusies
- Deze chemiluminescente beeldvormingstechniek kan de chirurgische beeldvorming verbeteren.
- Het biedt een levensvatbaar alternatief voor traditionele optische methoden.
- Toekomstig onderzoek zou de toepassingen ervan kunnen uitbreiden naar diverse ziekten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Hoogsensitieve chemiluminescente beeldvorming met ruthenium-gebaseerde reporters pakt kritieke detectie- en signaal-ruisuitdagingen aan in intraoperatief en preklinisch onderzoek. Deze techniek maakt een precieze visualisatie van biologische doelwitten mogelijk zonder de storende effecten van invallend licht, wat bijdraagt aan betrouwbare besluitvorming op cruciale ontdekkings- en translationele overgangspunten. De robuuste detectielimieten en aanpasbaarheid maken het tot een waardevol instrument voor de verdere ontwikkeling van pijplijnen en risico-gecorrigeerd portfoliomanagement.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het onderzoeken van biologische pathways en ziektestaten mogelijk met imaging met een hoge signaal-ruisverhouding.
- Ondersteunt de functionele validatie van moleculaire targets in vivo en ex vivo.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door het verstrekken van kwantitatieve gegevens over de ruimtelijke distributie.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen voor studies naar target engagement en weefsel lokalisatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve beelden voor de standaardisatie van assays.
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows voor compound-screening.
- Maakt robuuste detectie van targets met een lage abundantie mogelijk, wat een betrouwbare assayontwikkeling ondersteunt.
- Ondersteunt schaalbaarheid en hergebruik van het platform over meerdere biologische modellen.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Sluit aan bij ziekte-relevante modellen voor translationele biomarker-imaging.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door in vivo visualisatie mogelijk te maken.
- Ondersteunt risicogestuurde beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve imaging-drempels.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie in preklinische effectiviteits- en distributiestudies.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze chemiluminescente beeldvormingsmethode integreert processen van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, wat een naadloze hypothesetoetsing, targetvalidatie en translationele continuïteit mogelijk maakt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-gestuurd onderzoek naar weefseldistributie en target-engagement.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare imaging-resultaten voor assay-validatie.
- Analytics: Maakt gevoelige meting van reporterconcentraties en signaal-ruisverhoudingen mogelijk voor comparatieve analyse.
- Translationeel Onderzoek: Slaat de brug tussen discovery en preklinische validatie met in vivo imaging in ziekterelevante modellen.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een modulaire imaging-capaciteit die aanpasbaar is voor diverse biologische systemen en onderzoeksprogramma's.
Operationele & Zakelijke Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert imaging-protocollen voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over verschillende studies heen.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënte portfolio-progressie mogelijk.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en bevordering van discovery- en translationele assets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in chemiluminescente beeldvorming en het hanteren van biologische modellen.
- Vereist gespecialiseerde instrumentatie, zoals bioluminescentie-lezers en op maat gemaakte vernevelingssystemen.
- Vereist strikte standaardisatie tussen teams om reproduceerbaarheid en dataintegriteit te waarborgen.
- Aanpasbaar aan verschillende weefseltypen en modelsystemen met passende protocolaanpassingen.
- Zorgvuldige uitsluiting van omgevingslicht en contaminatie is cruciaal voor betrouwbare resultaten.
