Name: G Protein-selectieve GPCR Conformaties gemeten met behulp van FRET sensoren in een Live Cell Suspension Fluorometer Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Leer hoe je G-eiwit-selectieve GPCR-conformaties meet met FRET-sensoren in levende cellen. Deze modulaire methode biedt inzicht in receptorinteracties en geneesmiddelwerking.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RUM werd gefinancierd door de American Heart Association Pre-doctorale Fellowship (14PRE18560010). Onderzoek werd gefinancierd door de American Heart Association Wetenschapper Development Grant (13SDG14270009) en de NIH (1DP2 CA186752-01 &amp; 1-R01-GM-105646-01-A1) naar SS

1. DNA Voorbereiding <ol><li> Ontwerp sensor bouwt met behulp van een modulaire klonen regeling. Gelieve te verwijzen naar de β 2 AR sensor ontwerp eerder 1 gedetailleerd. </li><li> Bereid DNA volgens commerciële miniprep kit protocol en elueren in 2 mM Tris-HCl, pH 8, in een concentratie ≥ 750 ng / ul, A260 / A280 van 1,7-1,9, A 260 / A 230 van 2,0-2,29. </li></ol> 2. Cell Culture Voorbereiding <ol><li> Cultuur HEK-293T-Flp-n-cellen in DMEM bevattende 4,5 g / l D-glucose, aangevuld met 10% FBS (warmte geïnactiveerd) (v / v), 1% L-glutamine supplement, 20 mM HEPES, pH 7,5 bij 37 ° C in bevochtigde atmosfeer van 5% CO2. Behandel cellen in biologische veiligheid kap voor vervolgstappen. </li><li> Sta cellen groeien tot een confluente monolaag voordat passage in zes putjes. Tijd om confluentie te bereiken, hangt af van de eerste plating dichtheid. Gebruik platen diekomen tot samenvloeiing binnen 1-2 dagen in de platen zes-well platen. Een confluente 10 cm weefselkweek-behandeld schotel heeft celdichtheid van ongeveer 4 x 10 6 cellen / ml. Zie figuur 1 voor het van celkweek groei. </li><li> Was de cellen met 10 ml PBS, en trypsinize met 0,25% trypsine (zie Discussie, paragraaf 2). Plaat 8 x 10 5 cellen / putje in 2 ml medium in weefselkweek behandelde zes putjes en laat zich voor 16 - 20 uur. </li></ol> 3. Transfectie Voorwaarden <ol><li> Wankelen transfecties voor constructies die verschillende bedragen van de tijd nodig om optimale expressie te bereiken (tussen 20-36 uur). Synchroniseer voorwaarden voor een uniforme experiment tijd. ook een ongetransfecteerde controlewell onder gelijkwaardige celdichtheid te worden gebruikt voor achtergrondruis en verstrooiing aftrekken tijdens de analyse. </li><li> Breng transfectie reagentia op kamertemperatuur: verminderde serum media, DNA, transfectie reagens. </li><li> In eenbiologische beschermkap combineren reagentia in een steriele microcentrifugebuis in deze volgorde: meng 2 ug DNA met 100 ul gereduceerd serum medium. Spike 6 ul van transfectiereagens in media / DNA mix zonder het aanraken van het oppervlak van het mengsel of de zijkant van de buis. Opzetten van een reactie transfectie per putje. Transfectie omstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd (1-4 ug DNA, 3-6 pl transfectiereagens) vaste expressieniveaus te bereiken. Zie tabel 1 voor meer optimale verhoudingen. </li><li> Incubeer mengsel bij KT in biologische veiligheid kap voor 15-30 min. Gebruik geen reactie als links incuberen meer dan 30 min. </li><li> reactie op cellen in een druppelsgewijze manier toe te voegen heel goed en schud zes goed om grondig mengen te garanderen. Voeg één reactie per well. </li><li> Na 20 uur van meningsuiting, de monitor fluorescentie met behulp van weefselkweek fluorescentiemicroscoop. Beoordelen van de bevolking expressie met 10x objectief en eiwit lokalisatie in een cel op 40x. Observe voor eiwitexpressie bij plasmamembraan (PM). Als er geen wezenlijke internalisatie wordt opgemerkt, bewaken transfectie tot een significante expressie wordt gedetecteerd bij PM. </li></ol> 4. reagentia en apparatuur voorbereiding <ol><li> Bereid 100 mM drug voorraden en bewaar bij -80 ° C: isoproterenol bitartraat (100 mM in dH 2 O bevattende 300 mM ascorbinezuur). Maak op ijs / in koude kamer, en flash-vries onmiddellijk. Monsters kunnen worden gemaakt en gebruikt worden tot één jaar. </li><li> Bereid Cell Buffer (~ 2 ml / conditie) en op te slaan in een 37 ° C waterbad. Maak fris elke dag. Referentie tabel 2 voor Cell Buffer bestanddelen. </li><li> Bereid Drug buffer (10 ml) en bij kamertemperatuur geroerd. Referentie tabel 2 voor Drug Buffer bestanddelen. </li><li> Zuur wassen cuvetten met geconcentreerd HCl. Neutraliseren met een zwakke basis (1 M KOH), en grondig cuvettes met dH 2 O. </li><li> Bereid werkplek rond fluorometer met een aantaldozen van 10, 200 en 1000 ui pipet tips, een timer in te stellen met een 10 min countdown, een toegankelijke vacuüm lijn met tips voor cuvette reinigen, delicate taak doekjes, en spuit fles met ultrapuur H 2 O. </li><li> Verhit externe waterbad fluorometer en warmte blok naar 37 ° C. </li><li> Schakel fluorometer; set fluorescentie collectie programma voor het GVB-collectie tot 430 nm, bandpass 8 nm excitatie; emissie van 450 nm - 600 nm, bandpass 4 nm. Voor YFP collectie als sensorregeling (zie Discussie) set excitatie tot 490 nm, bandpass 8 nm, emissie range 500-600 nm, bandpass 4 nm. CFP verzameling instellingen worden gebruikt om een ​​FRET spectrum in dit experiment krijgen. </li><li> Plaats twaalf 1,5 ml microcentrifugebuizen in verwarmingsblok zoals weergegeven in figuur 2 hieronder. Deze buizen zijn houders voor cel hoeveelheid tubes (500 pl microcentrifugebuizen.) Plaats een klein stukje weefsel in de houders 1 en 7 van de cuvettes hier geplaatst vangen. Opmerking: Gebruik aparte cuvetten voor onbehandelde aandoening en geneesmiddel voorwaarde om kruisbesmetting te voorkomen. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig2.jpg" /> Figuur 2. microcentrifugebuis Set Up en Position Reference in Heat Block Cuvette voor onbehandelde monsters in de stand. 1; cel aliquot buizen zijn op posities 2 - 6. cuvette geneesmiddel behandelde monsters in positie 7; cel hoeveelheid buizen zijn in de posities 8 - 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol start="9"><li> Vul houders 2-6 en 8-12 met ~ 750 ul water om een ​​mini 37 ° C waterbad maken. </li><li> Plaats tien 500 pl microcentrifugebuizen voor mobiele fracties in mini-waterbaden (houders 2-6, 8-12). Elke buis wordt een individuele herhaling van de aandoening (5 untreated, 5 geneesmiddel behandelde). </li><li> Monitor cellen voor expressie (zie stap 3.6). </li></ol> 5. Experiment &amp; Data Collection <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig3.jpg" /> Figuur 3. Experimentele Schematische. Een gedetailleerde stapsgewijze handleiding voor experimentele opstelling en uitvoering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <ol><li> Referentie Figuur 3 voor experimentele schema. Wanneer cellen zijn klaar om geoogst te worden, op basis van eiwit expressie gedetecteerd met fluorescentie microscoop (zie Discussie, paragraaf 4): in biologische veiligheid kap, verwijder voorzichtig ~ 1 ml media, resuspendeer cellen in hun cultuur met een P1,000 en overdragen resuspensie in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Opmerking: Gebruik trypsine zoals de N-terminus kunnen verteren en /of binding zak van de GPCR sensor. </li><li> Aantal cellen de juiste celdichtheid in resuspensie waarborgen. Optimaliseren resuspensie volume 4 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Spin cellen in swinging bucket centrifuge bij kamertemperatuur 290 g gedurende 3 min. Verwijder supernatant na centrifugeren. </li><li> ZACHT resuspendeer cellen in 1 ml celbuffer (bewaard bij 37 ° C) en herhaal stap 5,3. Tijdens de tweede rotatie, het verzamelen van 100 mM drug voorraad hoeveelheid van -80 ° C. Maak 1: 100 verdunning in Drug buffer voor 1mM werkvoorraad en houden bij RT. </li><li> Na de tweede centrifugering verwijderd supernatant en voorzichtig resuspendeer cellen in 1 ml celbuffer (4 x 10 6 cellen / ml). Maat OD 600 van het monster in de spectrofotometer 1 ml cellen en 1 ml celbuffer als blanco. Verdeel cellen in een wegwerp plastic cuvet en transfer terug naar een microcentrifugebuis onmiddellijk na spectrofotometrie. </li><li> Voor een controle ongetransfecteerde cell voorwaarde spectrum, zacht resuspendeer ongetransfecteerde cellen in 1 ml Cell Buffer met P1,000 pipet, voeg 90 ul van cellen aan de cuvet en het verwerven van FRET spectrum bij excitatie 430 nm, bandpass 8 nm, emissie 450-600 nm, bandpass 4 nm. Verzamel 3-5 repeat spectra met verse 90 ul van cellen. Houd voorraad van de cellen bij 37 ° C tussen de specs, mengen voorzichtig met P1,000 tussen elk monster portie, en spoel cuvette met ultrapuur H 2 O tussen de monsters. </li><li> Voor experimentele omstandigheden aliquot 90 ul van getransfecteerde cellen voor elk van de 500 pi buizen in houders 2-6, 8-12 in het verwarmingsblok. Voorzichtig resuspendeer voorraad van cellen met P1,000 pipet tussen elke portie. </li><li> Na de cellen zijn in porties verdeeld, voeg 10 ul van Drug Buffer buizen 2-6 voor onbehandelde aandoening monsters. </li><li> Begin experiment door het toevoegen van 10 pi van 1 mM oplossing van geneesmiddel in de buis 8, start de timer aftellen van 10 min en meng buis met P200 pipet. Sluit de buis en terug te keren naar 37° C warmte-blok. </li><li> Onmiddellijk pick-up buis 2, meng voorzichtig met P200 (gebruik een nieuwe tip), voeg 90 ul van celsuspensie onbehandelde toestand cuvette, en plaats in de fluorometer. </li><li> Acquire FRET spectrum bij excitatie 430 nm, bandpass 8 nm, emissie 450-600 nm, bandpass 4 nm. </li><li> Op 9 min - 10 sec, spike buis 9 met 10 ui 1 mM drug oplossing, meng met een P200 (gebruik nieuwe tip), en terug te keren naar de buis blok te verwarmen. </li><li> Herhaal stap 5,10-5,11 met buis 3 en 5.12 met buis 10. </li><li> Herhaal stap 5,10-5,13 op 1 min intervallen (08:10, 07:10, etc.) totdat spectra worden verzameld voor alle onbehandelde conditie samples, en drug is toegevoegd aan alle drug conditie monsters. Gebruik een nieuwe tip voor elke pipet stap om kruisbesmetting te voorkomen. </li><li> Op 5 min - 10 sec, beginnen mengpijp 8 (drug conditie) voorzichtig met P200 pipet, voeg 90 ul van celsuspensie afzonderlijke cuvette voor drug behandelde monster en plaats in de fluorometer. </li><li> verwerven FRET spectrum (zie stap 5.11 voor instellingen). </li><li> Herhaal stap 5,15-5,16 op 1 min intervallen (04:10, 03:10, etc.) voor de resterende drug voorwaarde monsters (tubes 9-12). </li><li> Na het experiment is beëindigd, sparen projectdossiers, grondig wassen cuvettes met ultrapuur H 2 O, en re-voorraad buizen voor de volgende conditie. Zorg ervoor dat kruisbesmetting in de wasstap te voorkomen. Wijzig de tip over het H2O fles als de vacuümleiding tussen wasbeurten. </li></ol> 6. Data Analysis <ol><li> Opslaan en exporteren van gegevens in bestanden SPC te formatteren om te worden gebruikt voor analyse. Analyse programma&#39;s zijn beschikbaar om te downloaden uit de Sivaramakrishnan Lab publicatie website. </li><li> Maak pad bestanden voor analyse software die de analyse programma&#39;s (v9, v15), ongetransfecteerde monsters bestanden (zie stap 5.6 voor ongetransfecteerde cel spectrum collectie), OUTPUT databestand en komma&#39;s gescheiden waarden (CSV) bestanden voor het invoeren van gegevens op te nemen. </li><li> Voer volgende informatienaar CSV-bestand (zie voorbeeld in tabel 3) en wijzen respectieve voorwaarden voor elk monster, waaronder: bestandsnaam - individuele SPC grafiek bestanden Receptor - aanwijzen die GPCR construct werd getest (bijv Β2) Binder - aanwijzen welk peptide variant van het construct werd getest (bijvoorbeeld, S) Agonist - aanwijzen onbehandeld (N) of geneesmiddel behandelde (D) voorwaarden Directory - het pad van de map waarin de SPC-bestanden worden opgeslagen, meestal georganiseerd op datum OD - opgenomen optische dichtheid van het monster van de spectrofotometer </li><li> Voer bestandsnamen voor ongetransfecteerde monsters (stap 5.6) naar buffer en verstrooiing lawaai van monsters af te trekken. </li><li> Voer voorwaarden in analyseprogramma. </li><li> Programma&#39;s uitvoeren om monsters binnen de individuele omstandigheden (versie 9) en over de omstandigheden (v15) te analyseren. </li><li> Uitsluiten voorbeeld bestanden die duidelijk uitschieters in de dataset zijn, of aan te passen voor aftrekken door verhoging of verlaging OD-waarde van inddubbele bestanden. </li><li> Gegevens exporteren naar output-bestand voor toegang tot de berekende FRET-ratio&#39;s (525 nm / 475 nm). </li><li> Bereken ΔFRET door het aftrekken van de gemiddelde FRET-ratio voor onbehandelde toestand van het individu FRET verhoudingen voor behandeld (drugs) omstandigheden. </li></ol>

<ol><li>Malik, R. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+G+Protein-selective+G+Protein-coupled+Receptor+%28GPCR%29+Conformations+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells.</a> J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).</li>
<li>Oldham, W. M., Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotrimeric+G+protein+activation+by+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Alexander, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetic+analysis+of+the+rhodopsin-G-protein+complex+links+the+%CE%B15+helix+to+GDP+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).</li>
<li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq%CE%B1+to+that+of+Gi%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li>
<li>Conklin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxyl-Terminal+Mutations+of+Gq%CE%B1+and+Gs%CE%B1+That+Alter+the+Fidelity+of+Receptor+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation.</a> Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).</li>
<li>Onaran, H. O., Costa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+have+all+the+active+receptor+states+gone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Bio%22%5BJournal%5D)">Where have all the active receptor states gone.</a> Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li>
<li>Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence%2Fbioluminescence+resonance+energy+transfer+techniques+to+study+G-protein-coupled+receptor+activation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling.</a> Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).</li>
<li>Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+millisecond+activation+switch+of+G+protein-coupled+receptors+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells.</a> Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).</li>
<li>Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).</li>
<li>Stumpf, A. D., Hoffman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+probes+based+on+G+protein-coupled+receptors+-+added+work+or+added+value%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Optical probes based on G protein-coupled receptors - added work or added value.</a> Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).</li>
<li>Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+control+of+protein+interaction+using+a+modular+ER%2FK+%CE%B1-helix+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen.

De strakke dynamische bereik van FRET metingen in dit systeem versterkt de noodzaak gevoelige kwaliteitscontrole bij elke stap van dit protocol. De belangrijkste stappen voor een succesvolle FRET experiment waarborgen 1) celcultuur, 2) transfectie 3) eiwitexpressie en 4) tijdige, nauwkeurige coördinatie bij de test uitvoeren. Cel gezondheid en onderhoud / plating kwaliteit kan een aanzienlijke invloed op de signaal-ruisverhouding van het experimentele systeem en slechte gezondheid cel kan he...

G-proteïne-gekoppelde receptoren (GPCR&#39;s) zijn zeven-transmembraan receptoren. Het menselijk genoom alleen bevat ongeveer 800 genen die coderen voor GPCR&#39;s, die worden geactiveerd door een verscheidenheid aan liganden, waaronder licht, geurstoffen, hormonen, peptiden, geneesmiddelen en andere kleine moleculen. Bijna 30% van alle geneesmiddelen die momenteel op de doelmarkt GPCR&#39;s, omdat ze spelen een grote rol in vele ziekten 2. Ondanks tientallen jaren van uitgebreid werk aan deze receptor familie, blijven er belangrijke onopgeloste vraagstukken in het veld, in het bijzonder met betrekking tot de moleculaire mechanismen die GPCR-effector interacties rijden. Tot op heden heeft slechts één hoge-resolutie kristalstructuur gepubliceerd, die inzicht geven in de wisselwerking tussen de β 2-adrenerge receptor (β 2-AR) en de Gs eiwit 3. Samen met een uitgebreid onderzoek in de afgelopen drie decennia, herhaalt hij een specifieke structurele component die is van cruciaal belang in dezeinteractie: de Ga subeenheid C-terminus. Deze structuur is zowel voor G-eiwit activatie van de GPCR 4 en G-eiwit selectie 5-6. Vandaar dat de Ga-C-uiteinde heeft een cruciale schakel tussen ligand stimulatie van GPCR en selectieve G-eiwit activatie. Onderzoek in de afgelopen tien jaar blijkt dat GPCRs bevolken een brede conformatie landschap, met een ligand-bindend stabiliserende subsets van GPCR conformaties. Hoewel verschillende technieken, waaronder kristallografie, NMR en fluorescentiespectroscopie en massaspectrometrie zijn beschikbaar om de GPCR conformationele landschap besproken, is er een gebrek aan benaderingen hun functionele betekenis effector selectie 7 helderen. Hier schetsen we een Fӧrster resonantie energie-overdracht (FRET) -gebaseerde aanpak van de G-eiwit-selectieve GPCR conformaties te detecteren. FRET steunt op de afstand en de parallelle oriëntatie van de twee fluoroforen met overlappende emissie (donor) eennd excitatie (acceptor) spectra 8. Als de donor en acceptor fluoroforen dichter bij elkaar als gevolg van hetzij conformationele verandering in het eiwit of eiwit-eiwit interactie komen, de FRET hiertussen oplopen en kan worden gemeten met behulp van diverse methoden 8. FRET gebaseerde biosensoren zijn uitgebreid tewerkgesteld GPCR 9. Ze werden gebruikt om veranderingen in de conformatie GPCR sonde door het invoegen van donor en acceptor in de derde intracellulaire lus en C-terminus GPCR; sensoren zijn ontworpen sonderen GPCR en effector interacties door het afzonderlijk labelen van de GPCR en effector (G-eiwit subeenheden / arrestins) met een FRET paar 10; aantal sensoren ook detecteren conformatieveranderingen in het G-eiwit 11. Deze biosensoren hebben het veld nodig om een veelheid aan onopgeloste kwesties, waaronder conformationele veranderingen in de GPCR en effector, GPCR-effector interactie kinetiek en allosterische liganden 12 vragen. Onze groepwas vooral geïnteresseerd in het creëren van een biosensor die G-eiwit-specifieke GPCR conformaties onder-agonist gedreven omstandigheden kon ontdekken. Deze biosensor gebaseerd op een recent ontwikkelde techniek genaamd SPASM (systematische eiwitaffiniteit sterkte modulatie) 13. SPASM omvat tethering interactie eiwitdomeinen met een ER / K linker, die de effectieve concentratie regelt. Weerszijden van de linker met een FRET paar fluoroforen wordt een instrument waarin de stand van de interactie tussen eiwitten 12 kunnen melden. Eerder 1 de SPASM module werd gebruikt om de Ga-C-terminus tether een GPCR en bewaken hun interacties met FRET fluoroforen, mCitrine (in dit protocol ingeleid door de algemeen bekende variant, geel fluorescent eiwit (YFP), excitatie- / emissie piek 490/525 nm) en mCerulean, excitatie / emissie piek 430/475 nm) (als bedoeld in dit protocol door zijn algemeen bekend variant Cyaan Fluorescent Protein (GVB genoemd). Van N- naar C-terminus, tzijn genetisch gecodeerde enkele polypeptide bevat: een volledige lengte GPCR, FRET acceptor (mCitrine / YFP), 10 nm ER / K linker FRET donor (mCerulean / CFP), en de Ga-C-terminus peptide. In deze studie worden sensoren afgekort als GPCR-linkerlengte-Ga-peptide. Alle componenten worden gescheiden door een niet gestructureerde (Gly-Ser-Gly) 4 verbindingsstuk dat vrije rotatie van elk gebied stelt. De gedetailleerde karakterisering van dergelijke sensoren is eerder uitgevoerd met behulp van twee prototypische GPCRs: β 2 AR en opsin 1. Deze sensor wordt transiënt getransfecteerd in HEK-293T-cellen en fluorometer gebaseerde live cell experimenten meten fluorescentie spectra van het FRET paar op willekeurige eenheden van counts per seconde (CPS) in aanwezigheid of afwezigheid van ligand. Deze metingen worden gebruikt om een FRET verhouding tussen de fluoroforen (YFP max / CFP max) te berekenen. Een verandering in FRET (ΔFRET) wordt dan berekend door de gemiddelde verhouding FRETonbehandelde monsters van de FRET verhouding van ligand behandelde monsters. ΔFRET vergelijkbaar in constructen (β 2 AR-10 nm-Gαs peptide versus ß2-AR-10 nm-geen peptide). Hier hebben we detail het protocol bij deze sensoren in levende HEK-293T-cellen te uiten, hun expressie te controleren, en de opzet, uitvoering en analyse van de fluorometer gebaseerde levende cellen FRET-meting voor onbehandeld versus geneesmiddel behandelde omstandigheden. Hoewel dit protocol is specifiek voor het β 2 AR-10 nm-Gαs peptide sensor behandeld met 100 uM isoproterenol bitartraat, kan worden geoptimaliseerd voor verschillende GPCR-Ga-paren en liganden.

<table><tbody><tr><td>B2-AR-10 nm-Gas peptide sensor</td><td>Addgene</td><td>47438</td><td>https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/</td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Fermentas/Fisher Sci</td><td>FERK0503</td><td>Elute in 2 mM Tris elution buffer</td></tr><tr><td>HEK-293T-Flp-n cellen</td><td>Life Technologies</td><td>R78007</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM- hoge glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>Verwarmen in&nbsp; 37 &deg;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>FBS, gecertificeerd, Hitte geïnactiveerd, VS-oorsprong</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I 100x</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>MT25060CL</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Verminderd serum medium; Breng naar RT voor gebruik</td></tr><tr><td>XtremeGene HP transfectiereagens</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>Zeer aanbevolen vanwege de consistentie. Breng naar RT voor gebruik</td></tr><tr><td>FluoroMax 4</td><td>Horiba</td><td></td><td>Gebruik met FluorEssence V3.8 software</td></tr><tr><td>3-mm padlengte kwarts cuvet</td><td>Starna</td><td>NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)</td><td>Mogelijk een cuvethouder/adapter vereist voor gebruik in Fluorometer, verkrijgbaar bij Starna</td></tr><tr><td>Sc100-S3 Verwarmde Circulerende waterbadpomp</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-874-826</td><td>Verwarmen tot 37 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>Thermomixer Heat Block</td><td>Eppendorf</td><td>22670000</td><td>Verwarmen tot 37 &deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>Ultrapure DNA/RNAse vrij water</td><td>Life Technologies</td><td>10977015</td><td>Gebruik bij RT</td></tr><tr><td>D(+)-glucose, watervrij</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>aprotinine uit runderlong</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>leupeptine hemisulfaat</td><td>EMD</td><td>10-897</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbinezuur, reagentiakwaliteit</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>(-)-isoproterenol (+)-bitartraat</td><td>Sigma</td><td>I2760</td><td>Gebruik verse aliquot bij elk experiment</td></tr></tbody></table>

g protein-selectieve gpcr conformaties gemeten met behulp van fret sensoren in een live cell suspension fluorometer assay

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Fӧrster resonantie energie-overdracht (FRET) -gebaseerde studies hebben in het onderzoek van GPCR signalering steeds vaker voor. Onze onderzoeksgroep ontwikkelde een intramoleculaire FRET sensor om de interactie tussen Ga subeenheden en GPCRs in levende cellen na agonist stimulatie detecteren. Hier hebben we gedetailleerd protocol voor het detecteren van veranderingen in FRET tussen de β 2 adrenerge receptor en Gαs C-terminus peptide na behandeling met 100 uM isoproterenol hydrochloride zoals eerder gekarakteriseerde 1. Onze FRET sensor is een polypeptide bestaande serie van een full-length GPCR, een FRET acceptor fluorofoor (mCitrine), een ER / K SPASM (systematische eiwitaffiniteit sterkte modulatie) linker, een FRET donor fluorofoor (mCerulean) en een Ga-C terminale peptide. Dit protocol zal detail celpreparaat, transfectie voorwaarden, installeren van apparatuur, uitvoering assay, en data-analyse. Deze experimentele ontwerp detecteert kleine langes FRET indicatief voor eiwit-eiwit interacties, en kan ook worden gebruikt om de sterkte van de interactie tussen de liganden en GPCR-G-eiwit paringen vergelijken. Om de signaal-ruis in onze metingen verbeteren, dit protocol vereist verhoogde precisie in alle stappen, en wordt hier gepresenteerd om reproduceerbare uitvoering mogelijk.

Een algemeen schema van het experiment opgezet en uitvoering wordt beschreven in Figuur 3. Om een ​​FRET verandering in de smalle dynamisch bereik van de sensor op te sporen, is het essentieel om zich te houden aan de nuances van het systeem worden nageleefd. Cell kwaliteit is noodzakelijk om eiwitexpressie en consistentie in monstername. Figuur 1 kenmerken afbeeldingen gekweekte cellen groeien in een consistente monolaag (10X) die optimaal is voor zes putje...

Eenvoudige methoden om de selectieve activering van G-eiwitten door G-eiwit-gekoppelde receptoren te detecteren, blijven een grote uitdaging in celsignalering. Hiervoor zijn Fӧrster resonantie-energieoverdracht (FRET) biosensoren ontwikkeld door een GPCR paarsgewijs vast te maken aan G-eiwitpeptiden om conformationele veranderingen te onderzoeken bij gecontroleerde concentraties in levende cellen.

G Protein-selectieve GPCR Conformaties gemeten met behulp van FRET sensoren in een Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

Het algemene doel van deze assay op basis van Forster resonantie-energietransfer (FRET) in levende cellen is het beoordelen van G-proteïne-selectieve G-proteïnegekoppelde receptor (GPCR) conformaties onder verschillende agonistcondities. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het GPCR-veld over interacties van GPCR's met verschillende effectoren en het effect van verschillende geneesmiddelen op de receptorconformatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de sensoren modulair zijn en eenvoudig kunnen worden aangepast voor verschillende combinaties van GPCR's en G-alpha-peptiden, inclusief de volledige G-alpha-subeenheid.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de selectie van G-eiwitten en de respons op verschillende liganden, kan deze ook worden toegepast om de fysiologische gevolgen van differentiële G-eiwitactivatie te onderzoeken. Kweek vóór aanvang van de procedure de betreffende cellen in volledig medium bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met vijf procent kooldioxide totdat de culturen confluent zijn.Detach daarna de cellen met Trypsin en passeer de culturen bij een dichtheid van 8 × 10⁵ cellen per put in 2 ml medium in weefselkweek-behandelde six-well platen voor 16 tot 20 uur incubatie. Bereid na 16 tot 20 uur, zodra de cellen aan de platen zijn gehecht, in een biologische veiligheidskabinet één transfectiereactie per put en laat de reagensmengsels 15 tot 30 minuten equilibreren. Voeg aan het einde van de incubatie één reactie druppelgewijs over de put verdeeld toe aan elke celcultuur.Schud de plaat voorzichtig om een grondige verspreiding van het reagens door de culturen te waarborgen. Plaats de plaat vervolgens terug in de celkweekincubator. Analyseer na 20 uur de culturen op eiwitexpressie van het plasmamembraan en beoordeel de gezondheid van de cellen.Indien er aanzienlijke internalisatie van het eiwit wordt waargenomen, dient de transfectie te worden gemonitord totdat er een significante expressie aan het plasmamembraan wordt gedetecteerd. Het beoordelen van het eiwitexpressieniveau is essentieel voor een optimale experimentele opzet. Als de cellen slecht zijn getransfecteerd of de eiwitexpressie te laag is, dient men te wachten met het oogsten van de cellen.Anders kan het fluorescentiesignaal onvoldoende zijn voor analyse. Wanneer de cellen klaar zijn om geoogst te worden, brengt u ze over naar de biologische veiligheidskabinet en verwijdert u voorzichtig één milliliter medium. Resuspendeer de cellen met een P1000-pipet in één milliliter van het resterende medium per well en breng de cel-suspensies over naar individuele 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes.Tel de cellen en pellet de cellen door centrifugatie. Verwijder het medium van de celpellet. Resuspendeer het supernatant voorzichtig in één milliliter celbuffer van 37 °C en herhaal de centrifugatie.Resuspendeer het pellet na de tweede centrifugatie in vers celbuffer tot een concentratie van 4 × 10⁶ cellen per milliliter. Voeg vervolgens 90 µL controlecellen toe aan een cuvet en neem het controle-FRET-spectrum op. Nadat er drie tot vijf herhaalde controlespectra zijn verzameld met telkens een nieuw volume van 90 µL cellen per meting, worden de stappen voor suspensie, centrifugatie en wassing herhaald voor de getransfecteerde cellen. Verdeel aliquots van 90 µL getransfecteerde cellen over elke 500 µL buis in houder twee tot zes en acht tot 12 in een heat block, waarbij de cellen tussen elke aliquot voorzichtig worden geresuspendeerd. Wanneer alle cellen zijn overgebracht, voegt u 10 µL drug buffer toe aan buizen twee tot zes voor de onbehandelde controlemonsters. Voeg vervolgens 10 µL van de 1 mM drugoplossing toe aan buis acht.Start een timer voor een aftelling van 10 minuten en gebruik een P200-pipet om de inhoud van de buis voorzichtig te mengen. Sluit de buis na het mengen en plaats deze terug in het warmteblok. Pak vervolgens onmiddellijk buis twee op.Meng de inhoud voorzichtig met een nieuwe tip. Voeg 90 µL van de suspensie van getransfecteerde cellen toe aan de cuvet van de onbehandelde conditie en plaats de cuvet in de fluorometer. Registreer het FRET-spectrum voor het monster met dezelfde parameters als voor de controlespectra.Voeg bij negen minuten en 10 seconden 10 µL van de 1 mM drugoplossing toe aan buis negen. Meng de inhoud van de buis voorzichtig en plaats de buis terug in het warmteblok. Neem vervolgens onmiddellijk buis drie op, meng de inhoud van de cuvet en meet deze, zoals zojuist gedemonstreerd voor buis twee.Meng buis acht na vijf minuten en 10 seconden voorzichtig met een P200-pipet. Voeg 90 µL van de celсусpensie toe aan een aparte cuvet voor de meting van het met het geneesmiddel behandelde monster en registreer het FRET-spectrum voor het monster onder de conditie met het geneesmiddel. Sla de projectbestanden op nadat alle spectra zijn geregistreerd.Was de cuvetten grondig met ultrapuur water en vul de buisjes opnieuw voor de volgende conditie. In deze afbeelding wordt een homogene monocultuur van cellen getoond die optimaal is voor uitplating in zes-wellplaten en transfectie. Cellen die echter in klonten groeien en leiden tot dendritische vormen, worden niet aanbevolen voor een consistente uitplating en een nauwkeurige analyse van de eiwitexpressie of FRET-meting.De transfectiecondities kunnen ook worden geoptimaliseerd om een reproduceerbare expressie te bereiken. Zodra alle gegevens zijn verzameld en in een CSV-bestand zijn ingevoerd voor analyse, zullen de gegenereerde resultaten lijken op deze representatieve RAW- en genormaliseerde gemiddelde FRET-spectra. Alle RAW FRET-spectra van dit representatieve experiment vertonen een vloeiend, voldoende signaal-ruisverhouding, wat een consistente data-analyse mogelijk maakt met een minimale waterpiek van het monster.Wanneer de gegevens worden genormaliseerd bij 475 nanometer, wordt het aantal tellingen per seconde van deze waarde ingesteld op 1,0 en wordt de significante verandering in de meting bij 525 nanometer tussen de behandelde en onbehandelde monsters duidelijk. Als de eiwitexpressie laag is, of als er sprake is van een slechte transfectie-efficiëntie of een lage celdichtheid in de cuvet voor de fluorescentiemeting, kunnen de RAW-gegevens ruis bevatten, wat problemen veroorzaakt bij de achtergrondsubtractie en normalisatie, met spectra tot gevolg die niet uitlijnen en niet geanalyseerd kunnen worden. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 25 minuten worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de cellen in alle stappen van het experiment voorzichtig behandeld moeten worden. Na het volgen van deze procedure kan de techniek worden uitgebreid om verschillende receptor-FRET-sensoren, verschillende geneesmiddelen en effectoren en verschillende celtypen te testen. Na de ontwikkeling heeft deze techniek bijgedragen aan het vakgebied van GPCR's, waarbij recente studies met deze sensoren licht hebben geworpen op het moleculaire mechanisme van G-eiwitselectie.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe specifieke GPCR-conformaties kunnen worden beoordeeld met behulp van een meetassay met een live-cell tether FRET-construct. Vergeet niet dat werken met zoogdiercelculturen en bepaalde experimentele geneesmiddelen extreem gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, bij het uitvoeren van deze procedure.

g-protein-selective-gpcr-conformations-measured-using-fret-sensors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

Door het gebruik van een spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging-systeem, zijn pixel-niveau kaarten van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiëntie verkregen voor cellen die membraanreceptoren verondersteld dat homo-oligomere complexen vormen. Van de efficiëntie kaarten FRET, we zijn in staat om stoichiometrisch informatie over het oligomeer complex schatting in studie.

In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

We beschrijven hier gedetailleerde live cell imaging methoden voor onderzoek van chemotaxis. We presenteren fluorescentie microscopische methoden om spatiotemporele dynamiek van de signalering gebeurtenissen in migrerende cellen te controleren. Meting van signalering gebeurtenissen laat ons toe verder te begrijpen hoe een GPCR-signalering netwerk gradiënt sensing van chemoattractants en controles directionele migratie van eukaryote cellen bereikt.

Imaging G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR)-gemedieerde Signaling Gebeurtenissen die controle Chemotaxis van Dictyostelium discoideum</em

Förster resonance energy transfer (FRET) microscopie is een krachtige techniek voor real-time monitoring van signalering gebeurtenissen in levende cellen met behulp van verschillende biosensoren als verslaggevers. Hier beschrijven we hoe u een aangepaste epifluorescentie bouwen FRET beeldverwerkingssysteem van in de handel verkrijgbare componenten en hoe deze te gebruiken voor FRET experimenten.

FRET microscopie voor Real-time monitoring van Signalering Evenementen in levende cellen met behulp Unimoleculaire Biosensoren

De hier beschreven op fluorescentie gebaseerde calcium-mobilisatie assay is een medium-doorvoer screening omgekeerde farmacologie identificatie van functioneel activerend ligand (en) orphan G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR).

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

GPCR-β-vanger-interacties zijn een opkomende veld in GPCR-geneesmiddelen ontdekking. Nauwkeurige, nauwkeurige en eenvoudig te stellen methoden zijn nodig om dergelijke interacties in levende systemen te monitoren. We vertonen een structurele complementatie test om de interacties van GPCR-β-de-vanger in real-time levende cellen te monitoren, en deze kan worden uitgebreid naar elke GPCR.

Monitoren van GPCR-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen

Aangezien GPCRs aantrekkelijke geneesmiddelendoelstellingen zijn, is GPCR ligandscreening dus onmisbaar voor de identificatie van loodverbindingen en voor deorphanisatiestudies. In de richting van deze inspanningen beschrijven we PRESTO-Tango, een open-source resource platform dat wordt gebruikt voor gelijktijdige profilering van voorbijgaande β-arrestin2 werving bij ongeveer 300 GPCRs met behulp van een TEV-gebaseerde reporter test.

Parallelle ondervraging van β-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening op een GPCR-Brede Schaal met presto-Tango Assay

Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie resonantie energie transfer (smFRET) experimenten op G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) met behulp van site-specifieke etikettering via onnatuurlijke aminozuur (OCG) incorporatie. Het protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor smFRET-monstervoorbereiding, experimenten en gegevensanalyse.

Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, illustreert de effectiviteit van de cAMP Difference Detector In Situ  bij het meten van cAMP door middel van twee methoden. Eén methode maakt gebruik van een spectrofotometer met 96 putjes voor plaatlezen met HEK-293-cellen. De andere methode demonstreert individuele HASM-cellen onder een fluorescerende microscoop.

Real-time cAMP-dynamiek in levende cellen met behulp van de fluorescerende cAMP-verschildetector in situ

Dit protocol beschrijft het gebruik van op BRET gebaseerde biosensoren voor real-time meting van G-eiwitactivering in levende HEK293-cellen bij G-eiwitgekoppelde receptorligandstimulatie. Hier dienen de β2-adrenerge receptor en cannabinoïde type 1-receptor als voorbeeld om de efficiëntie van sensoren voor verschillende G-eiwitsubtypes en voor verschillende GPCR's aan te tonen.

Op BRET gebaseerde G-eiwitbiosensoren voor het meten van G-eiwitgekoppelde receptoractiviteit in levende cellen

Leer hoe je G-eiwit-selectieve GPCR-conformaties meet met FRET-sensoren in levende cellen. Deze modulaire methode biedt inzicht in receptorinteracties en geneesmiddelwerking.

G Protein-selectieve GPCR Conformaties gemeten met behulp van FRET sensoren in een Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Meer video's verkennen