Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer
26 december 2016
Het identificeren van nieuwe geneesmiddeldoelen die overgaan van preklinisch onderzoek naar menselijke proeven is een wetenschappelijke prioriteit. Daartoe beschrijven we hier een functionele genoombenadering voor het onderzoeken van de impact van gendepletie op kankerstamlijnsferoïden, die menselijke kankers beter modelleren in vivo.
Het doel van dit siRNA-screenprotocol is om de impact van genuitschakeling op de groei van kankersferoïden in cellijnen te onderzoeken. In vergelijking met traditionele tweedimensionale celkweektechnieken, tonen kankersferoïden omstandigheden die meer lijken op die in tumoren in vivo. Deze methode is nuttig voor de functionele beoordeling van frequent gewijzigde genen in menselijke kankers, en belangrijker nog, het kan worden gebruikt om te bepalen welke genen potentiële oncogenen of tumorsuppressorgenen zijn onder complexere kweekcondities, zoals die gezien worden in driedimensionale kweek, en in het bijzonder, onder hypoxie.
Het grote voordeel van deze techniek is dat deze gemakkelijk aanpasbaar is, zodat onderzoekers deze kunnen gebruiken om hun specifieke genen van belang in hun voorkeurscellijnen te bestuderen. Wij geloven dat het voortbouwt op huidige gerichte sRNA-screeningsbenaderingen. Het wordt algemeen gewaardeerd dat gerichte screens, in plaats van volledige genoomstrains, wetenschappers in staat stellen specifieke vragen te stellen en robuustere resultaten te genereren.
We hebben het effect van genuitschakeling op de levensvatbaarheid en grootte van sferoïd onderzocht, maar je zou ook biometrische kleurstoffen kunnen gebruiken voor een ander screenresultaat, zoals apoptose. Patty Wai uit ons laboratorium demonstreert de procedure. Begin door 96-well platen met de siRNA-bibliotheek bij kamertemperatuur te ontdooien.
Draai vervolgens vijf minuten bij 1.000 keer g, met behulp van een tafelcentrifuge. Gebruik een multikanaals pipet om 10 microliters gereduceerd serummedium met het geoptimaliseerde transfectiereagens toe te voegen aan de putjes van elke plaat. Laat 15 minuten incuberen om transfectiecomplexen, die siRNA bevatten, te laten vormen.
Zoals bij elke screeningspijplijn, moet de sferoïdvormende capaciteit van cellijnen onder transfectiecondities robuust worden geoptimaliseerd voordat de volledige screening wordt uitgevoerd. Trypsiniseer vervolgens de cellen die gescreend moeten worden tot ze loskomen van de fles. Zodra de cellen los zijn, neutraliseer de trypsine met een geschikt volume cellijn-specifiek medium, breng over naar een centrifugeerbuis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1.000 keer g in een tafelcentrifuge om de cellen te verzamelen.
Gooi het supernatant weg en resuspendeer het pellet in een eencellige suspensie met een geschikt volume medium. Voer een celtelling uit met een geautomatiseerde celteller. Verdun vervolgens de suspensie tot 5.000 cellen per 180 microliter met koud medium.
Breng de celsuspensie over naar een reservoir. Gebruik een multikanaals pipet, ingesteld op 180 microliter, pipet om te mengen en breng de celsuspensie over naar de 96-well plaat met de siRNA. Centrifugeer de plaat bij 1.000 keer g in een voorgekoelde centrifuge van 4 graden Celsius gedurende 10 minuten en incubeer vervolgens de plaat in een weefselcultuurincubator van 37 graden Celsius.
Op dit punt zullen de cellen als een mozaïek op de bodem van de putjes verschijnen. Na 24 uur observeer de cellen onder een microscoop. Op dit punt zouden de cellen samen moeten zijn geaggregeerd om een enkele sferoïd in het midden van de put te vormen.
Voeg 100 microliters compleet medium toe aan elke put om groei aan te moedigen voordat u terugkeert naar de incubator. Na drie dagen groei, verwijder voorzichtig 100 microliters medium uit elke put en voeg 100 microliters vers medium toe. Op dag zeven onderzoek de sferoïd onder een microscoop en kwantificeer vervolgens de sferoïdgrootte op een platelezer die de sferoïdgroei kwantitatief kan volgen over tijd.
Om de sferoïdgrootte te kwantificeren, open eerst de software op de computer. Selecteer 96-well plaat, selecteer het juiste plaattype en voer een experimentnaam in. Plaats vervolgens de 96-well plaat met de sferoïd in een tafel-micro-well plate imaging cytometer.
Selecteer vervolgens de Tumorsphere applicatie. Selecteer beeldgebaseerde focus om de focus aan te passen zodat de sferoïd scherp staat en een optimale contrast heeft. Selecteer de putten die gescand moeten worden en start de scan.
Zorg er vervolgens voor dat het objectmasker de sferoïdgrootte nauwkeurig weergeeft. Voor BT474 sferoïd gedurende zeven dagen gekweekt, pas de Precisie aan op Hoog en stel de minimale Koloniediameter in op 200 micrometer. Gebruik de Export functie om de gegevens te exporteren in de vorm van een geannoteerd databestand dat zal worden geanalyseerd om siRNAs met een statistisch significant effect op sferoïdgebied te identificeren.
Na het beeldvormen, verwijder 100 microliters medium uit elke put en voeg 100 microliters luminescente levensvatbaarheidskleurstof toe om de cellevensvatbaarheid te bepalen. Laat de platen 15 minuten incuberen en scan vervolgens de plaat met een luminescente platelezer. Dit protocol kan ook worden aangepast voor gebruik met andere kankerscellijnen.
De omgekeerde transfectieprocedure van niet-targeterende controles had geen significant effect op de levensvatbaarheid voor een van de geteste lijnen, terwijl de transfectie van Ubiquitine B, een positieve celdodende controle, de levensvatbaarheid significant verminderde. BT474 cellen werden omgekeerd getransfecteerd met de 200-gen Human siGENOME siRNA Bibliotheek in drievoudig. Sferoïdgebied en levensvatbaarheid werd waargenomen.
Belangrijke uitzonderingen met een z-score groter dan 1,7 werden geïdentificeerd. SiRNAs die het sferoïdgebied en de levensvatbaarheid significant verhoogden of verminderden, worden in blauw geschaduwd, en rood geeft de controle siRNAs weer. Deze reeks micrografieën toont representatieve beelden van BT474 sferoïd zeven dagen na omgekeerde transfectie met E-Cadherin, een niet-targeterende controle, PIK3CA, ERBB2 of SF3B1 siRNA.
Deze histogram toont hoe behandeling met elk siRNA de cellevensvatbaarheid zeven dagen na omgekeerde transfectie beïnvloedde. Knockdown van ERBB2 en PIK3CA verminderde de cellevensvatbaarheid significant in vergelijking met controles. Dit beeld toont aan dat de sferoïd succesvol kunnen worden geïmmunokleuring om de impact van genuitschakeling op doelwitteiwitten te onthullen.
Eenmaal onder de knie, kunnen enkele honderden genen in meerdere cellijnen in één dag worden gescreend, en dit maakt de rob
Overzicht
Dit artikel presenteert een functionele genomica-benadering om potentiële drugtargets te identificeren door de effecten van gendepletie in sferoïden van kankercellijnen te onderzoeken. Deze sferoïden bieden een nauwkeuriger model van menselijke tumoren in vivo vergeleken met traditionele 2D-culturen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Functionele genomica
- Kankerbiologie
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Genestilencing kan oncogenen en tumorsuppressors onthullen.
- Kankersferoïden bootsen de tumormicro-omgeving nauwkeuriger na dan 2D-culturen.
- Gerichte siRNA-screening maakt het mogelijk om specifieke genen te onderzoeken.
- Hypoxische omstandigheden kunnen met deze methode worden bestudeerd.
Doel van de studie
- Om de impact van gensilencing op de groei van kankersferoïden te onderzoeken.
- Om genen te identificeren die als nieuwe drugtargets kunnen dienen.
- Om het begrip van genfuncties in een 3D-culturomgeving te verbeteren.
Gebruikte methoden
- siRNA-screening in sferoïden van kankercellijnen.
- Optimalisatie van transfectiecondities voor een robuuste sferoïdevorming.
- Kwantificering van sferoïdegrootte en viabiliteit met behulp van imagingcytometrie.
- Analyse van de effecten van gensilencing op de celviabiliteit en groei.
Belangrijkste resultaten
- Er werden significante effecten van specifieke siRNAs op de levensvatbaarheid en grootte van de sferoïden waargenomen.
- Knockdown van ERBB2 en PIK3CA verminderde de cellevensvatbaarheid in vergelijking met de controles.
- Er werd een robuuste identificatie bereikt van genen die belangrijk zijn voor overleving in 3D-cultuur.
- De aanpasbaarheid van de methode voor diverse kankercellijnen werd aangetoond.
Conclusies
- Deze benadering maakt de screening van honderden genen in één dag mogelijk.
- Het biedt een waardig instrument voor het identificeren van potentiële therapeutische doelwitten bij kanker.
- De methode vergroot het inzicht in genfunctie binnen een meer fysiologisch relevante context.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Functionele genomische screening in 3D-kankerspheroidmodellen verbetert de validatie van targets door genafhankelijkheden onder fysiologisch relevante omstandigheden bloot te leggen. Deze aanpak vergroot de voorspellende betrouwbaarheid bij het identificeren van nieuwe drugtargets door invloeden van de tumormicro-omgeving vast te leggen die in 2D-culturen vaak over het hoofd worden gezien. De methode ondersteunt vroege beslissingen in het ontdekkingsproces door effecten van gen-silencing te koppelen aan de groei en levensvatbaarheid van sferoïden, waardoor mechanische risicoreductie van kandidaat-targets mogelijk wordt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de impact van gensilencing op de groei en levensvatbaarheid van kankersferoïden te beoordelen.
- Operationele waarde: Maakt functionele beoordeling mogelijk van genen die vaak veranderd zijn in menselijke kankersoorten onder complexe kweekcondities.
- Voorspellende waarde: Identificeert potentiële oncogenen of tumorsuppressoren die cruciaal zijn voor overleving in 3D-kweek, wat bijdraagt aan de prioritering van targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van siRNA-screening om kwantitatieve resultaten van het sferoïde-oppervlak en de levensvatbaarheid te genereren voor de analyse van geneffecten.
- Operationele waarde: Vereist optimalisatie van de transfectiecondities en het vermogen tot sferoïdevorming om robuuste en reproduceerbare screeningsresultaten te garanderen.
- Klaarheid van de assay: Maakt gebruik van imaging-cytometrie en luminescente levensvatbaarheidskleuren om high-content, kwantitatieve monitoring van de sferoïdegroei in de tijd mogelijk te maken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele relevantie: Bevestigt de ruimtelijke impact van genafhankelijkheden via immunohistochemie, waarbij moleculaire bevindingen worden gekoppeld aan veranderingen op proteïneniveau in sferoïden.
- Preklinische continuïteit: Toont de afhankelijkheid van HER2-amplificatie en PIK3CA-mutatie in BT474-sferoïden aan, wat bekende kankerdrivers valideert in een 3D-model.
- Mechanistische risicoreductie: Biedt ruimtelijke en functionele validatie van geneffecten, waardoor onduidelijkheid over het doelmechanisme wordt verminderd vóór verdere investeringen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm van targetidentificatie tot leadoptimalisatie, in het bijzonder voor targets die validatie vereisen in complexe, hypoxia-gevoelige tumormodellen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests en de verduidelijking van pathways door gen-knockdown te koppelen aan veranderingen in de levensvatbaarheid en grootte van sferoïden.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk via reverse transfectieprotocollen en gestandaardiseerde sferoïdevorming in 96-well formats.
- Analytics: Genereert kwantitatieve gegevens over het oppervlak en de levensvatbaarheid van sferoïden via imagingcytometrie en luminescente read-outs, wat de statistische identificatie van significante hits mogelijk maakt (bijv. z-score >1.7).
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de effecten van gen-silencing met ruimtelijke eiwitexpressie via immunohistochemie, wat de afstemming van biomarkers en het mechanistische inzicht verbetert.
- Enterprise Reuse: Aanpasbaar voor diverse kankercellijnen en siRNA-bibliotheken, waardoor het fungeert als een herbruikbaar platform voor target-validatiecampagnes.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door genafhankelijkheden in een tumor-relevante 3D-context te onthullen.
- Operationele waarde: Bevordert de reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde sferoïdevorming, optimalisatie van transfectie en kwantitatieve imaging-workflows.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het aantal fout-positieven uit 2D-modellen te verminderen en het vertrouwen in de essentialiteit van targets te verhogen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van functioneel bewijs uit fysiologisch relevante modellen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in celkweek, transfectietechnieken en de hantering van 3D-modellen om een robuuste sferoïdevorming te garanderen.
- Afhankelijk van toegang tot imaging-cytometrie en luminescente plaatlezers voor een kwantitatieve beoordeling van de sferoïdegrootte en -levensvatbaarheid.
- Maakt optimalisatie van de transfectiecondities en celdichtheid (5.000 cellen/180 µL) noodzakelijk voor een consistente sferoïdevorming in alle putjes.
- Vereist aanpassingen bij uitbreiding naar andere kankercellijnen of hypoxie-gemoduleerde condities.
- Praktische beperking: De screeningdoorvoer is afhankelijk van de omvang van de siRNA-bibliotheek en de imaging-capaciteit, hoewel er na optimalisatie honderden genen per dag gescreend kunnen worden.
