Imaging van de Cel Shape Wijziging en Cell Mutatie Drosophila Gastrulatie gebruik van DE-cadherine Reporter Transgene Flies
29 december 2016
Hier beschrijven we een procedure om live beelden te maken van Drosophila gastrulatie. Dit heeft ons in staat gesteld om de apicale constrictie die betrokken is bij vroege ontwikkeling beter te begrijpen en verder mechanismen te analyseren die cellulaire bewegingen regelen tijdens modificatie van weefselstructuur.
Het algemene doel van deze procedure is om de cellulaire vorm en beweging beter te begrijpen, tijdens de gastrulatie van Drosophila. Hier bieden we een robuuste meetmethode van Drosophila gastrulatie, om de initiatie van morfogenetische cellulaire beweging te testen, tijdens dit stadium van embryonale ontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat celherschikking op het moment van gastrulatie, kan worden geïdentificeerd samen met apicale constriktie, tijdens de gastrulatie.
Om het experiment te beginnen, bereid een mengsel van 375 milliliter water. 125 milliliter 100% commercieel verkrijgbaar appelsap. 12,5 gram agar.
12,5 gram glucose. Verwarm vervolgens het mengsel in een magnetron, totdat de agar gesmolten is. Giet het in een celcultuurschaal van drie centimeter.
Bewaar het mengsel op 4 graden Celsius voor later gebruik. Nadat je de appelplaat hebt voorbereid, voeg een dunne laag gekneed gistdeeg toe, om de vliegen eieren te laten leggen. Plaats 25 mannelijke en 25 vrouwelijke vliegen in een fles op een appelplaat bedekt met gekneed gistdeeg.
Wickel de plastic Drosophila-voorraadflessen in aluminiumfolie om de vliegen aan te moedigen om meer eieren te leggen. Houd de fles ondersteboven in een incubator overnacht. Vervang de volgende ochtend de appelsapplaat door een verse.
Wickel vervolgens de fles in aluminiumfolie en laat de vliegen drie tot vier uur eieren leggen. Nadat de vliegen eieren hebben gelegd, los de eieren van de plaat met een wattenstaafje. Verzamel de embryo's in een zeef en was ze met fosfaatgebufferd zout water, of PBS.
Was de embryo's nog drie keer met PBS, in 12-wells kweekschalen. Dechorioneer de embryo's met 50% bleekmiddel, in 12-wells kweekschalen. Na het dechorionatieproces, was de embryo's nog drie keer met PBS.
Breng de embryo's over naar een celcultuurschaal van drie centimeter met PBS. Selecteer onder de microscoop de embryo's in stadium vijf, op basis van de mate van transparantie aan hun randen. Gebruik een 200 microliter pipettentip om de geselecteerde embryo's te verzamelen.
Plaats vervolgens twee geselecteerde embryo's op een glazen dekglas en verwijder overtollig PBS met tissuepapier. Orienteer de embryo's met een fijn gedraaid tissuepapier, rugzijde naar boven op het dekglas. Bevestig vervolgens de embryo's aan het glazen dekglas met siliconenvet met behulp van een fijne naald.
Voeg een kleine druppel holle koolstof olie 700 toe aan de embryo's en plaats het dekglas met de embryo's op de gekartelde schuif, ondersteboven. Laat wat ruimte aan de onderkant van de schuif. Bevestig vervolgens het dekglas op de schuif.
Onderzoek tenslotte de embryo's met behulp van een confocale beeldvormingssysteem, een argon 488 laser en een olie-immersie objectief. Time-lapse beelden werden vastgelegd van levende beelden, met behulp van DE-cadherine GFP van celbeweging gedurende 500 seconden, om de apicale gebieden van individuele cellen van Drosophila tijdens gastrulatie te analyseren. Na 500 seconden zijn apicale constriktie en invaginatie duidelijk zichtbaar.
Door onze methode te gebruiken. Kunnen we verder begrijpen, de moleculaire mechanismen, van Drosophila gastrulatie, evenals, epitheel naar mesenchymale overgang, betrokken bij kankermetastase.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een procedure voor het vastleggen van live-beelden van de gastrulatie bij Drosophila, wat ons begrip van apicale constrictie tijdens de vroege ontwikkeling vergroot. De techniek maakt een gedetailleerde analyse mogelijk van cellulaire bewegingen die betrokken zijn bij de modificatie van de weefselstructuur.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Ontwikkelingsbiologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Gastrulatie bij Drosophila is een kritieke fase in de embryonale ontwikkeling.
- Het begrijpen van de cellulaire vorm en beweging is essentieel voor het vatten van ontwikkelingsprocessen.
- Apicale constrictie speelt een belangrijke rol bij morfogenetische bewegingen.
- Live imaging-technieken kunnen inzicht bieden in dynamische cellulaire gedragingen.
Doel van de studie
- Om het begrip van cellulaire bewegingen tijdens de gastrulatie van Drosophila te verbeteren.
- Om een robuuste methode te ontwikkelen voor het meten van morfogenetische cellulaire beweging.
- Om celherschikkingen en apicale constrictie tijdens de gastrulatie te identificeren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een specifiek mengsel voor beeldvorming.
- Live imaging van Drosophila-embryo's tijdens de gastrulatie.
- Analyse van cellulaire bewegingen en vormveranderingen.
- Identificatie van belangrijke morfogenetische gebeurtenissen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle opname van live-beelden van de gastrulatie bij Drosophila.
- Identificatie van apicale constrictie en celherrangschikking.
- Verbeterd begrip van de cellulaire dynamiek tijdens de vroege ontwikkeling.
- Robuuste methodologie voor toekomstige studies in de ontwikkelingsbiologie.
Conclusies
- De procedure biedt waardevolle inzichten in de gastrulatie van Drosophila.
- Live-imaging is een krachtig instrument voor het bestuderen van cellulaire bewegingen.
- De bevindingen dragen bij aan het bredere begrip van ontwikkelingsprocessen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Live imaging van celvormverandering en beweging tijdens de gastrulatie van Drosophila biedt een robuust platform voor het analyseren van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de epitheliale-mesenchymale transitie (EMT), een proces dat betrokken is bij fibrose en kankermetastasen. Deze methode maakt visualisatie met hoge resolutie van apicale constrictie en celherrangschikking mogelijk, wat de voorspellende betrouwbaarheid bij de vroege validatie van targets voor EMT-gerelateerde pathways ondersteunt. De benadering versterkt de translationele continuïteit van ontwikkelingsbiologie naar ziekte-relevante mechanistische studies in biofarmaceutische R&D.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & doelwitvalidatie
- Maakt onderzoek naar de functie van EMT-gerelateerde genen en pathway-dynamiek mogelijk in een levende, multicellular context.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door directe visualisatie van morfogenetische gebeurtenissen die gekoppeld zijn aan ziektemechanismen.
- Faciliteert functionele target-validatie voor genen die apicale constrictie en overgangen in celbestemming controleren.
- Biedt voorspellende zekerheid bij het prioriteren van EMT-modulerende targets in oncologie- en fibroseportfolio's.
Screening & Assayontwikkeling
- Stelt een gevalideerd imagingsysteem vast voor het kwantificeren van celbeweging en vormveranderingen in real-time.
- Maakt reproduceerbare meting van apicale constrictie en celherschikking mogelijk als kwantitatieve assay-outputs.
- Ondersteunt de standaardisatie van fenotypische screeningplatforms voor EMT-modulerende verbindingen.
- Bereidt robuuste biologische systemen voor op downstream high-content screening workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt ontwikkelings-EMT-processen uit met ziekterelevante modellen van metastase en weefselremodellering.
- Biedt mechanistische inzichten die de selectie van translationele biomarkers voor preklinische studies informeren.
- Maakt risico-gecorrigeerde voortgang van EMT-gerichte kandidaten mogelijk op basis van fenotypisch bewijs in levende cellen.
- Versterkt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie in ziektegebieden die door EMT worden gedreven.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze beeldgevingsmethode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetoetsing tot de ontwikkeling van preklinische modellen voor EMT-gerelateerde targets.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking voor EMT- en morfogenetische regulatoren.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten voor celvorm en -beweging, wat de gereedheid van assays mogelijk maakt.
- Analytics: Biedt high-content imaginggegevens voor comparatieve analyse van genetische of farmacologische perturbaties.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen ontwikkelingsmechanismen en ziekterelevante EMT-modellen voor biomarker-afstemming.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een herbruikbaar imagingplatform dat aanpasbaar is aan diverse EMT- en morfogenese-studies.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en de mechanische risicoreductie voor discovery-programma's gericht op EMT.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare imaging-workflows voor reproduceerbaarheid over projecten heen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium bij EMT-gedreven indicaties.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van EMT-modulerende assets over verschillende therapeutische gebieden.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in live imaging, confocale microscopie en Drosophila-embryologie.
- Vereist toegang tot geavanceerde beeldvormingsinstrumentatie en analysesoftware voor time-lapse-analyse.
- Noodzaak van cross-team standaardisatie van embryo-stadiëring en beeldvormingsprotocollen voor reproduceerbaarheid.
- Aanpassing aan andere modelsystemen kan optimalisatie van reporterconstructen en beeldvormingscondities vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten beperkingen in de doorvoer en de noodzaak voor precieze hantering van embryo's.
