Name: Imaging van de Cel Shape Wijziging en Cell Mutatie Drosophila Gastrulatie gebruik van DE-cadherine Reporter Transgene Flies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 42 s
Description: Leer levende beeldvorming van celvormveranderingen en celmutatie tijdens Drosophila gastrulatie met behulp van DE-cadherine reporter transgenen. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van apicale contractie en morfogenetische bewegingen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), Takeda Science Foundation (HT) en het door MEXT ondersteunde programma voor strategisch onderzoek aan particuliere universiteiten (HT).

OPMERKING: De transgene vliegen die in deze studie zijn: DE-cad :: GFP 10. 1. Bereiding van Apple Plate <ol><li> Maak een mengsel van 12,5 g agar, 125 ml 100% in de handel verkrijgbaar appelsap, 12,5 g glucose en 375 ml H2O Verhit het mengsel in een magnetron en giet het in een 3 cm celkweek schotel. Bewaar het mengsel bij 4 ° C voor toekomstig gebruik. </li><li> Na bereiding van de appel plaat, voeg een dunne laag gekneed gistpasta bovenop om de vliegen van eieren leggen. </li></ol> 2. Embryo Voorbereiding en Live-Imaging Protocol <ol><li> Plaats ongeveer 50 vliegen (25 mannen en 25 vrouwen) in een fles om te paren en vervolgens eieren leggen &#39;s nachts op een appel plaat bedekt met gekneed gist. Stel de appelsap plaat aan de monding van de fles. Bewaar de fles op zijn kop in een couveuse. Wikkel de plastic Drosophila voorraad flessen met aluminiumfolie om prompt the vliegt naar meer eieren te leggen. </li><li> De volgende ochtend, vervang de oude appelsap plaat met een nieuwe. </li><li> Laat de vliegen eitjes leggen gedurende 3-4 uur door het wikkelen van de fles met aluminiumfolie. </li><li> Drie tot vier uur later, het verzamelen van de embryo&#39;s in een embryo zeef van het appelsap plaat met een borstel of katoenen slecht en was ze met PBS. Was de embryo&#39;s 2-3 keer met PBS in 12-putjes. </li><li> Dechorionate de embryo&#39;s met 50% bleekwater gedurende 5 min in 12-putjes. </li><li> Na het dechorionation proces 2-3 keer was de embryo&#39;s met PBS. </li><li> Overdracht van de embryo&#39;s om een ​​3 cm celkweek schotel met PBS en selecteer stadium 5 embryo&#39;s onder de loep op basis van het niveau van transparantie aan hun grenzen. Pipetteer de geënsceneerde embryo&#39;s met behulp van een 200 pi pipet tip. </li><li> Plaats vervolgens twee geselecteerde embryo&#39;s op een glazen dekglaasje en verwijder overtollige PBS met fijn gedraaide papieren zakdoekje. Richt de embryo&#39;s dorsale kant naar boven ophet dekglaasje met behulp van een fijn gedraaide vloeipapier. Na dat, hechten de embryo&#39;s aan het glas dekglaasje met siliconen vet met behulp van een fijne naald en gedraaide papieren zakdoekje. </li><li> Voeg een druppeltje Halocarbonolie 700 op het embryo en plaats het dekglaasje met de embryo omgekeerd op het ingesprongen dia iets ruimer aan de onderkant van de schuif. </li><li> Onderzoek de embryo&#39;s met behulp van een confocale beeldvormingssysteem, een Argon / 488 laser, en een olie-immersie objectief (63x). Opmerking: Het identificeren van de embryo in de juiste ontwikkelingsstadium belangrijk om beelden van de gastrulatie gebeurtenis vast te leggen. Onder deze omstandigheden acht bijna alle embryo&#39;s ontwikkelen gewoonlijk tot tenminste fase 14. De geanalyseerde embryo verder kunnen worden gekweekt ontwikkelen als volwassene. </li></ol>

<ol><li>Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proximal+half+of+the+Drosophila+E-cadherin+extracellular+region+is+dispensable+for+many+cadherin-dependent+events+but+required+for+ventral+furrow+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation.</a> Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).</li>
<li>Oda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution%3A+structural+and+functional+diversity+of+cadherin+at+the+adherens+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction.</a> J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).</li>
<li>Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+induction+in+embryonic+development+and+tumor+growth+integrative+cues+through+molecular+to+multicellular+interplay+and+evolutionary+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives.</a> Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).</li>
<li>Alderton, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+Epithelial+to+mesenchymal+and+back+again%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again.</a> Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3(2013).</li>
<li>Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+into+the+Crossroads+between+EMT+and+Stemness+in+the+Context+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer.</a> J. Clin. Med. 5 (3), (2016).</li>
<li>Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial-mesenchymal+transition+through+epigenetic+and+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications.</a> Mol. Cancer. 15, (2016).</li>
<li>Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN-induced+disruption+of+Nanog+expression+results+in+reduced+proliferation%2C+invasiveness+and+migration%2C+increased+chemosensitivity+and+reversal+of+EMT+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Rep%22%5BJournal%5D)">TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells.</a> Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+is+dispensable+for+metastasis+but+induces+chemoresistance+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer.</a> Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).</li>
<li>Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed%2C+efficient%2C+and+versatile+modifications+of+the+Drosophila+genome+by+genomic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel we eerder een vergelijkbare procedure hebben gerapporteerd om live beelden van het gastrulatieproces in Drosophilla1 vast te leggen, is de methode die we hier beschrijven gedetailleerd en gemakkelijk om endogene cadherine-expressie te traceren en daarom vrij nuttig voor genetisch screening van belangrijke factoren die betrokken zijn bij gastrulatie. Om het succes met deze beeldvormingsprocedure te maximaliseren, is het essentieel om een ingedrukte glijbaan te gebruiken. Mechanische druk veroorz...

Gastrulatie is de eerste set van morfologisch dynamische gebeurtenissen die zich voordoen tijdens de embryonale ontwikkeling van meercellige dieren zoals Drosophila 1,2. Interessant nieuwe aanwijzingen dat dit proces wordt gereguleerd door de wisselwerking tussen mechanische en moleculaire mechanismen 3. Bovendien is het epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT), een cruciale proces gastrulatie, ook betrokken bij menselijke ziekteprocessen zoals kanker metastase 4-8. Als zodanig vele genen die apicale vernauwing controle is ook bekend dat een sleutelfactor is in het EMT waargenomen bij kanker metastase 9. Aldus apicale vernauwing bij de gastrulatie is een uitstekend model voor de genoemde regulerende mechanismen te onderzoeken en aan ons begrip van kanker metastase bevorderen. Het voordeel van deze techniek is dat we celbeweging bij de gastrulatie in real-time en daarom kan waarnemen, zullen wekunnen genen betrokken bij gastrulatie kanker metastase scherm. Hoewel relatief onbekend is cel-cel adhesie vermoedelijk een centrale rol spelen bij het apicale constrictie 1. Drosophila genetica is goed geschikt voor single cell niveau onderzoeken verkennen regulerende moleculaire mechanismen. Dit model stelt ons in staat om het belang van apicale beklemming ontdekken tijdens gastrulatie. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om genen betrokken bij kanker metastase screenen. Het vastleggen van live beelden van Drosophila gastrulatie verder ons in staat om te begrijpen in meer detail de moleculaire mechanismen die ten grondslag weefsel omlegging. Hierin geven we een uitvoerige beschrijving van een eenvoudige methode om dit te bereiken.

<table><tbody><tr><td>Halocarbon olie 700</td><td>Sigma</td><td>MKBH 5726</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum vet Silicone</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>Glazen dekglas&nbsp;</td><td>Matsunami glas</td><td>Dikte Nr1</td><td>24 - 36 mm</td></tr><tr><td>Embryo sterilisator</td><td>Corning</td><td>Corning3477</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof Drosophilla voorraadflessen</td><td>Hitec</td><td>MKC-100</td><td></td></tr><tr><td>DE-Cadherin knock-in vliegen</td><td></td><td></td><td>REF (10)</td></tr></tbody></table>

imaging van de cel shape wijziging en cell mutatie drosophila gastrulatie gebruik van de-cadherine reporter transgene flies

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Gastrulatie is de eerste set van morfologisch dynamische gebeurtenissen die zich voordoen tijdens de embryonale ontwikkeling van meercellige dieren zoals Drosophila. Deze morfologische wijziging wordt ook erkend als epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT). Ontregeling van EMT is geassocieerd met fibrose en kanker metastase. Er wordt steeds duidelijker dat EMT wordt bestuurd door een aantal moleculaire mechanismen. Als zodanig veel belangrijke genen die apicale vernauwing controle is ook bekend dat belangrijke factoren in de EMT waargenomen bij kanker metastase. Net als EMT tijdens Drosophila gastrulatie, kunnen epitheelcellen worden aangezet om hun vorm te veranderen en worden geherprogrammeerd om lot van de cel richten op verschillende andere celtypen. Hier bieden we een robuuste imaging methode Drosophila gastrulatie om de inleiding van morfogenetische cellulaire bewegingen en het lot van de cel identificatie testen tijdens deze fase van de embryonale ontwikkeling. Met behulp van deze methode, identificeren we cell omlegging bij de gastrulatie en tonen het belang van apicale constrictie tijdens gastrulatie behulp GFP gemerkte DE-cadherine.

Hier tonen wij de gastrulatie gebeurtenissen van de Drosophila embryo en een algemeen overzicht van de embryo bereidingsprocedure (figuur 1). Celmembranen geëtiketteerd met DE-cadherine :: GFP en live beeldvorming van celbewegingen wordt uitgevoerd ten tijde van gastrulatie in Drosophila (figuur 2). Sinds DE-cadherine GFP vliegt ons toelaten om celadhesie kruispunten te visualiseren, zijn we in staat om apicale cel vorm en bewegingen van het geb...

Hier beschrijven we een procedure om live beelden te maken van Drosophila gastrulatie. Dit heeft ons in staat gesteld om de apicale constrictie die betrokken is bij vroege ontwikkeling beter te begrijpen en verder mechanismen te analyseren die cellulaire bewegingen regelen tijdens modificatie van weefselstructuur.

Imaging van de Cel Shape Wijziging en Cell Mutatie Drosophila Gastrulatie gebruik van DE-cadherine Reporter Transgene Flies

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

Het algemene doel van deze procedure is om de cellulaire vorm en beweging beter te begrijpen, tijdens de gastrulatie van Drosophila. Hier bieden we een robuuste meetmethode van Drosophila gastrulatie, om de initiatie van morfogenetische cellulaire beweging te testen, tijdens dit stadium van embryonale ontwikkeling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat celherschikking op het moment van gastrulatie, kan worden geïdentificeerd samen met apicale constriktie, tijdens de gastrulatie.Om het experiment te beginnen, bereid een mengsel van 375 milliliter water. 125 milliliter 100% commercieel verkrijgbaar appelsap. 12,5 gram agar.12,5 gram glucose. Verwarm vervolgens het mengsel in een magnetron, totdat de agar gesmolten is. Giet het in een celcultuurschaal van drie centimeter.Bewaar het mengsel op 4 graden Celsius voor later gebruik. Nadat je de appelplaat hebt voorbereid, voeg een dunne laag gekneed gistdeeg toe, om de vliegen eieren te laten leggen. Plaats 25 mannelijke en 25 vrouwelijke vliegen in een fles op een appelplaat bedekt met gekneed gistdeeg.Wickel de plastic Drosophila-voorraadflessen in aluminiumfolie om de vliegen aan te moedigen om meer eieren te leggen. Houd de fles ondersteboven in een incubator overnacht. Vervang de volgende ochtend de appelsapplaat door een verse.Wickel vervolgens de fles in aluminiumfolie en laat de vliegen drie tot vier uur eieren leggen. Nadat de vliegen eieren hebben gelegd, los de eieren van de plaat met een wattenstaafje. Verzamel de embryo's in een zeef en was ze met fosfaatgebufferd zout water, of PBS.Was de embryo's nog drie keer met PBS, in 12-wells kweekschalen. Dechorioneer de embryo's met 50% bleekmiddel, in 12-wells kweekschalen. Na het dechorionatieproces, was de embryo's nog drie keer met PBS.Breng de embryo's over naar een celcultuurschaal van drie centimeter met PBS. Selecteer onder de microscoop de embryo's in stadium vijf, op basis van de mate van transparantie aan hun randen. Gebruik een 200 microliter pipettentip om de geselecteerde embryo's te verzamelen.Plaats vervolgens twee geselecteerde embryo's op een glazen dekglas en verwijder overtollig PBS met tissuepapier. Orienteer de embryo's met een fijn gedraaid tissuepapier, rugzijde naar boven op het dekglas. Bevestig vervolgens de embryo's aan het glazen dekglas met siliconenvet met behulp van een fijne naald.Voeg een kleine druppel holle koolstof olie 700 toe aan de embryo's en plaats het dekglas met de embryo's op de gekartelde schuif, ondersteboven. Laat wat ruimte aan de onderkant van de schuif. Bevestig vervolgens het dekglas op de schuif.Onderzoek tenslotte de embryo's met behulp van een confocale beeldvormingssysteem, een argon 488 laser en een olie-immersie objectief. Time-lapse beelden werden vastgelegd van levende beelden, met behulp van DE-cadherine GFP van celbeweging gedurende 500 seconden, om de apicale gebieden van individuele cellen van Drosophila tijdens gastrulatie te analyseren. Na 500 seconden zijn apicale constriktie en invaginatie duidelijk zichtbaar.Door onze methode te gebruiken. Kunnen we verder begrijpen, de moleculaire mechanismen, van Drosophila gastrulatie, evenals, epitheel naar mesenchymale overgang, betrokken bij kankermetastase.

imaging-cell-shape-alteration-cell-movement-drosophila-gastrulation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier beschrijven we een protocol om de migratie van gliacellen te onderzoeken in de zich ontwikkelende Drosophila oog met behulp van levende microscopische analyse gecombineerd met GFP gelabelde gliacellen.

Live-Imaging van gliale cel migratie in de Drosophila Eye verbeelding Disc

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Hier presenteren wij een montage protocol voor...

Rechtop beeldvorming van Drosophila Embryo&#39;s

Vroege ontwikkeling van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, wordt gekenmerkt door een aantal celvorm veranderingen die zeer geschikt zijn voor de beeldvorming benaderingen. Dit artikel beschrijft elementaire instrumenten en methoden die nodig zijn voor live-confocale beeldvorming van Drosophila embryo's, en zal zich richten op een cel van vorm te veranderen genaamd cellularization.

Imaging Cel Vorm wijzigen in Living Drosophila Embryo&#39;s

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

De volwassen structuren van Drosophila zijn afgeleid van zak-achtige structuren die imaginale schijven worden genoemd. Analyse van deze schijven biedt inzicht in vele ontwikkelingsprocessen, waaronder weefselbepaling, oprichting van compartimentgrenzen, celproliferatie, celbestemmingsspecificatie en cellulaire planaire polariteit. Dit protocol wordt gebruikt om imaginale schijven voor te bereiden op licht-/fluorescentiemicroscopie.

Dissectie en Immunokleuring van Imaginal schijven uit Drosophila melanogaster

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Dit protocol is ontworpen voor de beeldvorming en analyse van de dynamiek van celoriëntatie en weefselgroei in de Drosophila abdominale epithelia terwijl de fruitvlieg een metamorfose ondergaat. De hier beschreven methodologie kan worden toegepast op de studie van verschillende ontwikkelingsstadia, weefsels en subcellulaire structuren in Drosophila of andere modelorganismen.

Beeldvorming en analyse van weefseloriëntatie en groeidynamiek in de ontwikkeling van Drosophila Epithelia tijdens pupale stadia

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor langdurige live beeldvorming van de Drosophila-poot tijdens het popstadium, waarbij het puparium volledig wordt verwijderd. Dit protocol kan ook op andere weefsels worden toegepast.

Langdurige live beeldvorming van de ontwikkeling van de poppoot van Drosophila na verwijdering van Puparium

Leer levende beeldvorming van celvormveranderingen en celmutatie tijdens Drosophila gastrulatie met behulp van DE-cadherine reporter transgenen. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van apicale contractie en morfogenetische bewegingen mogelijk.

Imaging van de Cel Shape Wijziging en Cell Mutatie Drosophila Gastrulatie gebruik van DE-cadherine Reporter Transgene Flies

Meer video's verkennen