Een In Vitro Model voor het bestuderen van cellulaire transformatie door Kaposi sarcoom Herpesvirus

Het algemene doel van deze procedure is om leeftijd-en passage-gematchte mock in KSHV geïnfecteerde endotheelcellen voor te bereiden om de studie van KSHV-geassocieerde veranderingen in genexpressie van gastheercellen mogelijk te maken, inclusief veranderingen die leiden tot maligne transformatie in de context van geschikte controles. Deze methode kan helpen bij het definiëren van de belangrijkste pathofysiologische veranderingen in de biologie van gastheercellen die leiden tot KSHV-geassocieerde kankers, en zo nieuwe therapeutische doelen identificeren voor ziektepreventie of behandeling. Het belangrijkste voordeel van dit systeem is dat maligne transformatie van endotheelcellen na infectie met KSHV snel en reproduceerbaar optreedt, waardoor het mogelijk is om vroege gebeurtenissen in het oncogene proces te bestuderen met leeftijd-en passage-gematchte controlecellen.

Hoewel dit model van virale oncogenese inzicht kan geven in de ontwikkeling van Kaposi Sarcoma, kan het ook worden toegepast op andere kankertypen. Omdat Kaposi Sarcoma een vasculair tumor is, strekken de implicaties van dit celcultuurmodel zich uit naar het begrijpen van andere ziekteprocessen die worden aangedreven door pathologische angiogenese. Om te beginnen, bereid en filter steriel TNE-buffer zoals beschreven in het tekstprotocol.

Sla de oplossing vervolgens op bij vier graden Celsius. Kweek de KSHV positieve EBV negatieve primaire effusie lymfoomcellijn BCBL-1 in een T150 flacon gevuld met 60 milliliter RPMI-medium. Bewaar de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om een suspensie van ongeveer 1 tot 1,2 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter te verkrijgen.

Zodra de juiste dichtheid is bereikt, splits de cellen een op twee met vers medium en voeg PMA toe tot een eindconcentratie van 20 nanogram per milliliter om KSHV-productie te induceren. Incubeer vervolgens de culturen gedurende vijf dagen. Na vijf dagen incubatie, oogst virale deeltjes door de celsuspensies gedurende vijf minuten bij 300 keer g bij kamertemperatuur te centrifugeren.

Breng vervolgens de supernatanten over in een nieuwe buis. Centrifugeer de supernatanten nog eens bij 2.500 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten om cellulaire deeltjes te verwijderen. Nu het opgehelderd is, leg vijf milliliter 25% sucrose-oplossing in TNE met ongeveer 30 milliliter van de supernatant in zes ultracentrifugebuizen.

Centrifugeer de gebalanceerde buizen bij 75.000 keer g gedurende twee uur bij vier graden Celsius onder vacuüm. Zodra de centrifugatie voltooid is, decanteer het supernatant en dep de rand van elke buis af om zoveel mogelijk vloeistof te verwijderen. Spuit vervolgens het gepelletiseerde virus opnieuw op in 150 microliter TNE-buffer en verzamel alle monsters.

Meng de verzamelde suspensie grondig en verdeel deze in 25 microliter aliquots. Bewaar het stamvirus bij min 80 graden Celsius. Kweek primaire humane dermale microvasculaire of lymfatische endotheelcellen in EGM-medium in een T75-flacon.

Bewaar de celkweek bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot ongeveer 50% confluency bereikt is. Voorafgaand aan de transductie van endotheelcellen, kweek PA317 LXSN 16E6E7 cellen in een T150 celkweekflacon gevuld met 20 milliliter DMEM bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Zodra ongeveer 90% confluency is bereikt, vervang het medium van de PA317-celkweek met 16 milliliter vers medium en incubeer de cellen een nacht.

Na een nachtelijke incubatie, verzamel het medium van de PA317-celkweek en verhelder het door centrifugatie bij 300 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Vervang het EGM-medium van 50% confluente endotheelcelkweek met 12 milliliter van het opgehelderde PA317-medium. Incubeer de cellen gedurende vier uur.

Vervolgens vervang zes milliliter van het PA317-medium met zes milliliter vers EGM-medium en incubeer de cellen een nacht. Vervolgens verwijder het medium van de endotheelcelkweek en voer de cellen met 12 milliliter vers EGM. Blijf de cellen nog 48 uur incuberen.

Om endotheelcellen te subcultureren, verwijder het medium en was de cellen met 12 milliliter kationenvrij PBS. Voeg vervolgens drie milliliter van een commerciële enzymatische dissociatieoplossing toe en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende drie minuten. Breng de celsuspensie over in een 15 milliliter conische buis en centrifugeer de cellen bij 300 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Nadat ze zijn gepelleteerd, suspendeer de cellen in vers EGM-medium en verdeel de suspensie gelijkmatig in drie T75-flacons. Pas het volume van de culturen aan tot 12 milliliter EGM per flacon. Voeg vervolgens 200 microgram per milliliter G418 toe om getransduceerde endotheelcellen te selecteren.

Oogst de getransduceerde endotheelcellen door enzymatische dissociatie zoals eerder is getoond. Suspendeer het endotheelcelpellet in één milliliter EGM-medium. Meng vervolgens vijf microliter van de celsuspensie met 45 microliter Trypan Blue-oplossing en tel de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer.

Zaai 2,5 keer 10 tot de vijfde levensvatbare cellen in twee milliliter EGM-medium per putje van een zes-putjesplaat. Verwijder op de volgende dag het EGM-medium en was de cellen in elke put met drie milliliter PBS met calcium en magnesium. Voeg vervolgens twee milliliter EBM-medium toe aan elke put.

Om cellen met KSHV te infecteren, voeg vijf tot twintig microliter van het virusstaam toe aan elke put en draai de plaat om de suspensies te mengen. Voeg een gelijk volume TNE-buffer toe aan elke put met mock-geïnfecteerde cellen. Na centrifugatie van de plaat bij 400 keer g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, incubeer deze bij 37 graden Celsius gedurende 90 minuten.

Voeg vervolgens twee milliliter EGM-medium toe aan elke put en incubeer de culturen een nacht. Na de incubatie, verwijder het EGM-medium uit elke put en vervang het door t