Xenopus Eicellen: Geoptimaliseerd Methoden voor Micro-injectie, Verwijdering van folliculaire Lagen en Fast Solution Veranderingen in elektrofysiologische experimenten

Het algemene doel van deze procedure is om nieuwe eiwitten, zoals ionenkanalen, tot expressie te brengen in Xenopus-eicellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in elk vakgebied dat een functioneel expressiesysteem vereist. De belangrijkste voordelen van de variaties van deze techniek zijn de snelheid, betrouwbaarheid en verbeterde overleving van de eicellen.

Deze methode kan inzicht geven in de werking van ionenkanalen. Bovendien kan het worden toegepast op de studie van elk ander eiwit. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we ons realiseerden dat klassieke methoden resulteerden in een lage overlevingssnelheid van de eicellen.

Na het verwijderen van de lobben van de eierstokken van vrouwelijke kikkers volgens het protocol in de tekst, plaatst u de lobben in steriele gemodificeerde Barth's oplossing, aangevuld met penicilline en streptomycine. Snijd de lobben open om de weefsels toegang tot zuurstof te geven. Om follikels in stadium vijf tot zes te selecteren, gebruikt u een pincet om de eierstok vast te houden en laat vervolgens een platina lus over de follikels zakken en trek de lus voorzichtig terug om het bindweefsel met de follikel van het eierstokweefsel los te maken.

Sorteer gezonde eicellen met behulp van de platina lus. Gebruik een plastic Pasteur-pipet met de punt gesneden tot een diameter van 1,5 millimeter om geselecteerde follikels over te brengen naar een petrischaal van 35 millimeter diameter. Nadat u de cRNA's voor de GABA A-receptor en micro-injectiepipetten volgens het protocol in de tekst hebt voorbereid, gebruikt u paraffine-olie en een spuit van 10 milliliter met een dunne naald om een micro-injectiepijpje terug te vullen.

Bevestig vervolgens het pijpje op een zelfgemaakte micro-injectie-inrichting. Gebruik een pijpje met een steriele plastic punt, plaats een druppel mRNA-oplossing op de schone kant van een stuk vochtwerend thermoplast. Dompel vervolgens de punt van het injectiepijpje in de druppel en zet de motor aan om de plunjer terug te trekken.

De mRNA-oplossing moet in het pijpje binnenkomen en een zichtbaar grensvlak met de olie vormen. Trek vervolgens de punt van het pijpje terug uit de druppel en breng een positieve druk aan aan de binnenkant van het injectiepijpje. Er moet een druppel mRNA-oplossing op de punt van het injectiepijpje ontstaan.

Gebruik een petrischaal van 60 millimeter met nylon gaaslijm op de bodem en bedekt met MBS voor injectie, lijn de follikels uit met hun vegetatieve polen naar boven wijzend. Gebruik de micromanipulator om het injectiepijpje over een individueel follikel te positioneren. Breng de injectienaald in het centrum van de vegetatieve pool aan en breng een positieve druk aan aan de binnenkant van het pijpje om 50 nanoliters mRNA te injecteren met een stromingssnelheid van 0,6 microliter per minuut.

Wacht vijf tot 10 seconden voordat u de punt van het injectiepijpje uit het follikel verwijdert om te voorkomen dat messenger-RNA ontsnapt. Breng geïnjecteerde follikels over naar een nieuwe petrischaal gevuld met twee milliliter MBS. Plaats de schaal in een wijnkast ingesteld op 18 graden Celsius.

Incubeer de geïnjecteerde follikels één tot zeven dagen voor opname, afhankelijk van de identiteit van het nieuw geëxprimeerde eiwit. Om follikels te strippen, brengt u tien geïnjecteerde follikels over naar een boorsilicaatglasbuis met 0,5 milliliter MBS, één milligram per milliliter collageenase en 0,1 milligram per milliliter trypsine-remmer. Dompel de buis in een waterbad van 36 graden Celsius en incubeer de follikels gedurende 20 minuten.

De temperatuur is hier cruciaal omdat een graadje meer de eicellen kan doden. Spoel de follikels door ze over te brengen naar een tweede buis met één milliliter MBS op kamertemperatuur en laat ze ongeveer tien seconden in de buis. Breng vervolgens de follikels over naar een derde buis met 0,5 milliliter dubbel geconcentreerde MBS met vier millimolair EGTA en incubeer de monsters gedurende vier minuten op kamertemperatuur, waarbij u de buizen af en toe schudt.

De incubatietijd van vier minuten is cruciaal om ervoor te zorgen dat de folliculaire lagen loskomen van de eicel. Spoel de follikels door ze over te brengen naar een andere buis met één milliliter MBS op kamertemperatuur en laat ze ongeveer 10 seconden in de buis. Breng de eicellen over naar een petrischaal van 35 millimeter met twee milliliter MBS.

Gebruik vervolgens onder een stereomicroscoop een platina lus om de buitenste omhulsels van de follikels te scheiden door simpelweg de naakte eicel weg te duwen. Bewaar de ontbloote eicellen tot gebruik. In dit experiment werden mechanisch gescheiden Xenopus-eicellen geïnjecteerd met mRNA-coating voor GABA A-receptorsubeenheden.

Vervolgens werden folliculaire cellagen verwijderd. De eicellen werden voltage-geklemd op minachttig millivolt en blootgesteld aan toenemende concentraties GABA en de aanwezigheid van THDOC, een krachtige positieve allosterische modulator van de GABA A-receptor. Dit paneel toont geëliceteerde stroomamplituden afhankelijk van de GABA-concentraties, wat de gevoeligheid van deze subeenhedencombinatie voor GABA aangeeft.

De gebruikte vergelijking was I(c)Imax/n)waarbij c de concentratie van GABA is, de EC50 de concentratie van GABA is in de aanwezigheid van één micromolair THDOC, die een half-maximale stroomamplitude oproept. Imax is de maximale stroomamplitude. I is de stroomamplitude en n is de Hill-coëfficiënt.

De EC50 van de alfa vier bèta twee delta GABA A-receptor bedroeg 0,41 0,12 micromolair en n was 0,76 0,04 Eenmaal beheerst, kunnen folliculaire cellagen in een half uur worden verwijderd als het goed wordt uitgevoerd. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers om de eiwitexpressieprocedure in Xenopus-eicellen te verbeteren. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u Xenopus-eicellen kunt isoleren die worden omringd door folliculaire cellagen, hun micro-injectie met mRNA en