Name: Xenopus Eicellen: Geoptimaliseerd Methoden voor Micro-injectie, Verwijdering van folliculaire Lagen en Fast Solution Veranderingen in elektrofysiologische experimenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Leer geoptimaliseerde methoden voor micro-injectie en verwijdering van folliculaire lagen in Xenopus oocyten voor elektrofysiologische experimenten. Deze technieken verbeteren de overlevingskans en betrouwbaarheid van eiwitexpressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Swiss National Science Foundation-subsidie 315230_156929/1. M.C.M. is een ontvanger van een beurs (Beca Chile Postdoctorado van CONICYT, Ministerio de Educacion, Chili).

Dierproeven zijn goedgekeurd door de plaatselijke commissie van het kanton Bern Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15). 1. Bereiding van Xenopus Eicellen <ol><li> Handhaven kikkers (Xenopus laevis) op een 12 uur / 12 uur licht / donkercyclus in water die strikt bij 20 ° C wordt gehouden. </li><li> Verwijder de lobben van de eierstokken van vrouwelijke kikkers 9. Opmerking: Het verwijderen van de lobben is een stimulans voor regeneratie en vaak de kwaliteit van de oöcyten verbetert met chirurgie. De eicel wordt onder een vitelline laag, een laag van follikel cellen en bindweefsel die de bloedvaten 21. Het geheel wordt aangeduid als de &quot;follikel.&quot; </li><li> Plaats de lobben van de eierstokken die dicht zijn verpakt met de follikels die de oöcyten in steriele Barth&#39;s zoutoplossing 7 (MBS) aangevuld met penicilline en streptomycine (88 mM NaCl, 1 mM KCI, 2,4 mMNaHCO3, 0,82 mM MgSO 4, 0,41 mM CaCl2, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 ug / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine). </li><li> Single-out fase V-VI 21 follikels. Houd de eierstok kwab met een tang. Laat de platina lus (figuur 1) via follikels en voorzichtig terugtrekken van de lus om het bindweefsel dat de follikel van eierstokweefsel verstoren. OPMERKING: Fase V-VI 21 follikels worden gekenmerkt door hun grootte (1,0-1,2 mm diameter) en de goed contrast tussen de donkere gepigmenteerde dier halfrond en de gelige plantaardige halfrond. </li><li> Transfer alleen gezond ogende follikels (dwz perfect sferisch en met intacte pigmentatie) een 35 mm petrischaal met behulp van een kunststof pasteurpipet (knip terug naar een openingsdiameter van 1,5 mm). </li></ol> Opmerking: Het micro- injectie systeem beschreven wordt afgeleid van het door Kressmann en Birnstiel 22 gerapporteerd. <ol><li> Bereid cRNA&#39;s van de respectievelijke cDNA&#39;s coderend voor de subeenheden van de α β 4 2 δ GABAA-receptor in vitro transcriptie, toevoeging van een poly (A +) staart en RNA kwantificering door 23 gelelektroforese. </li><li> Bereid micro-injectie pipetten van borosilicaatglas capillairen (1,0 mm buitendiameter (OD), 0,58 mm binnendiameter (ID), 100 mm lengte) met behulp van een micropipet trekker. Breek de uiteinden van de glazen capillairen onder een microscoop met een micromanipulator en microvezel een tip diameter van 12 creëren - 15 urn met een afgeschuinde punt. </li><li> Backfill de micro-injectie pipetten met paraffine olie met behulp van een 10 ml spuit en vervolgens monteer de micro-injectie pipet op een zelfbouw MICRoinjection inrichting (figuur 2). Attentie: de zelfbouw olie hydraulische injectie apparaat bestaat uit een grill motor bestuurd door een voetpedaal schakelaar. Een extra schakelaar wijzigt de stand draaien van de motor. Deze motor drijft een micrometer schroef (0,5 mm / turn) die voorschotten of trekt de zuiger van een 10 pi glazen spuit. De injectie met een snelheid van ongeveer 3 rpm en 0,5 beurt overeenkomt met een 50 nL injectie in een follikel. Het uiteinde van de spuit is verbonden met dikwandige polytetrafluorethyleen buis die zich aan de injectienaald verbonden door een kort stuk Tygon-buis. De injectie capillair wordt gehouden door een boorkop, dat wordt gecontroleerd door een micromanipulator. Het gehele systeem is gevuld met paraffineolie. Eventuele luchtbellen moeten worden vermeden, aangezien zij het injectiesysteem zal schaden. De setup is verlicht met een koude lichtbron. Een stereomicroscoop vereist voor optische controle. Follikels worden gevisualiseerd onder koud licht met een stereomicroscope (40x vergroting). Prestaties van de injectie opstelling wordt getest door het injecteren van radioactieve tracer in Xenopus oocyten. Een volume van 45 - 55 nL moet per injectie worden geleverd. </li><li> Met behulp van een pipet met steriele plastic tip, test de opstelling door een druppeltje steriel water op de schone binnenkant van een vochtbestendige thermoplast (2 x 2 cm). Dompel de punt van de injectie pipet in dit druppeltje, en zet de motor aan de zuiger (negatieve druk in de injectie pipet) intrekken. OPMERKING: Water moet de pipet te geven en een zichtbare interface met olie. </li><li> Trek de punt van de pipet uit de druppel en positieve druk aan op de binnenzijde van de injectiepipet. Een waterdruppeltje dient de punt van de injectiepipet vormen. </li><li> Voorbereiden op de injectie van de follikels door voering ze met vegetatieve polen naar boven gericht in de tussenruimten van een nylon mesh (G: 0,8 mm) vastgelijmd aan de bodem van een Petri schaal (60 mm) bedekt met MBS. </li><li> Verdeel 2 pl mRNA met een pipet met steriele plastic tip op de schone binnenkant van een thermoplast. Neem het mRNA tot in de injectiepipet door toepassing van negatieve druk op de binnenkant van de injectiepipet. </li><li> Plaats de injectie pipet over een individuele follikel met behulp van de micromanipulator. </li><li> Steek de injectienaald in het midden van de vegetatieve pool en injecteer 50 nL van mRNA met een stroomsnelheid van 0,6 ul / min door het toepassen van positieve druk aan de binnenkant van de pipet. Wacht 5-10 s voor het verwijderen van de injectie pipet tip van de follikel tot mRNA ontsnapping te voorkomen. Opmerking: Het mRNA worden geïnjecteerd in de vegetatieve (geel) pool injectie in de kern, die is gelegen in het dier halfrond voorkomen. </li><li> Breng de geïnjecteerde follikels een nieuwe petrischaal (35 mm) gevuld met 2 ml MBS. Plaats de schotel in een wijnkoeler ingesteld op 18 ° C. Incubeer de geïnjecteerde follikels voor 1 -7 d voor de opname, afhankelijk van de identiteit van de nieuw tot expressie gebrachte eiwit. </li></ol> 3. Strippen van de follikels (figuur 3) OPMERKING: Zoals hierboven vermeld, de eicel onder een vitelline laag, follikel cellen en bindweefsel, die de bloedvaten 24 bevat, is bekend als een &quot;follikel.&quot; Alle lagen behalve de vitelline laag die mechanische stabiliteit verricht zonder beperking van de toegang van oplossingen aan het celoppervlak moet worden verwijderd voordat elektrofysiologische experimenten. De follikel zonder het omringende cellagen eerder werd aangeduid als een &quot;Denuded&quot; eicel 25. Deze stap wordt gewoonlijk uitgevoerd op dezelfde dag als de elektrofysiologische experimenten. <ol><li> Transfer tien geïnjecteerd follikels een borosilicaatglas met 0,5 ml MBS, 1 mg / ml collagenase en 0,1 mg / ml trypsineremmer. Dompel de buis in een waterbad gehandhaafd op 36 ° C. Incubeer defollikels gedurende 20 min en schud de buizen af ​​en toe. </li><li> Spoel de follikels door ze over een tweede buis met 1 ml MBS bij kamertemperatuur. Laat ze in de buis gedurende ongeveer 10 s. </li><li> Breng de follikels een derde buis met 0,5 ml dubbel geconcentreerde MBS met 4 mM ethyleenglycol-bis (2-aminoethylether) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetraazijnzuur (EGTA) en incubeer ze gedurende 4 minuten bij RT. Schud de buis af en toe. OPMERKING: De hypertone oplossing (dubbel geconcentreerde MBS) gebruikt om krimp van de oöcyten in follikel cellagen, waardoor folliculaire cellagen van de eicel los te induceren; EGTA toegevoegd om collagenase te remmen. </li><li> Spoel de follikels door ze over een tweede buis met 1 ml MBS bij kamertemperatuur. Laat ze in de buis gedurende ongeveer 10 s. </li><li> Breng de eicellen naar een petrischaal (35 mm diameter) met 2 ml MBS. Onder een stereomicroscoop, scheiden de buitenste enveloppen uit de follikels doorgewoon druk op de naakte eicel weg met behulp van de platina lus. OPMERKING: De buitenste omhulsels van de oöcyten goed zitten aan de kweekschaal en kunnen gemakkelijk worden gescheiden van de oöcyten. Sommige eicellen spontaan verliezen hun buitenste enveloppen en zullen worden verhaald als blootgelegde eicellen. Deze procedure leidt tot een relatief stabiel preparaat dat de sferische uiterlijk van de oöcyten houdt. </li></ol> 4. Snel Oplossing Verander rond de eicel <ol><li> Voer een voltage clamp experiment, zoals beschreven 9,26. </li><li> Verander de oplossing van de zwaartekracht perfusie systeem door de perfusie schakelaars zoals vereist door het experiment. <ol><li> Breng de perfusie-oplossing bij 6 ml / min door een glazen capillair met een binnendiameter van 1,35 mm, waarvan de mond wordt geplaatst ongeveer 0,4 mm vanaf het oppervlak van de eicel, om snelle veranderingen in de concentratie agonist rond de eicel mogelijk maken. LET OP: De snelheid van verandering heeft eerder raming geweestd 70% in minder dan 0,5 s 27. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+frog+eggs+and+oocytes+for+the+study+of+messenger+RNA+and+its+translation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells.</a> Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).</li>
<li>Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthesis+of+biologically+active+proteins+in+mRNA-microinjected+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22CRC+Crit+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes.</a> CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).</li>
<li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Xenopus+oocytes+for+the+functional+expression+of+plasma+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins.</a> J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).</li>
<li>Dascal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Xenopus+oocytes+for+the+study+of+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22CRC+Crit+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels.</a> CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).</li>
<li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+single+sodium+channels+translated+by+Xenopus+oocytes+after+injection+with+messenger+ribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid.</a> J Physiol. 386, 73-90 (1987).</li>
<li>Sigel, E., Minier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+oocyte%3A+system+for+the+study+of+functional+expression+and+modulation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins.</a> Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).</li>
<li>Colman, A. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColman%2C+A+%22Transcription+and+Translation%27A+Practical+Approach%22">Transcription and Translation'A Practical Approach</a>. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. Oxford. 49-69 (1984).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defolliculation+of+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Defolliculation of Xenopus oocytes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).</li>
<li>Smart, T. G., Krishek, B. J. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmart%2C+TG+%22Patch-Clamp+Applications+and+Protocols%22">Patch-Clamp Applications and Protocols</a>. Boulton, A. A., Baker,, Wolfgang, W. alz , Humana Press. New Jersey. 259-305 (1995).</li>
<li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+sites+involved+in+modulation+of+the+GABA+receptor+channel+by+the+intravenous+anesthetics+propofol%2C+etomidate+and+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital.</a> Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).</li>
<li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+positive+allosteric+modulators+of+GABAA+receptors+with+anesthetic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity.</a> Sci Rep. 6, 25943(2016).</li>
<li>Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWongsamitkul%2C+N+%22J+Biol+Chem%22">J Biol Chem</a>. 291 (35), 18474-18483 (2016).</li>
<li>Burgunder, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chloride+channel+mutations+leading+to+mild+myotonia+among+Chinese%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese.</a> Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).</li>
<li>Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heteromeric+potassium+channel+involved+in+the+modulation+of+the+plasma+membrane+potential+is+essential+for+the+survival+of+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes.</a> FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).</li>
<li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((myo-Inositol+uptake+is+essential+for+bulk+inositol+phospholipid+but+not+glycosylphosphatidylinositol+synthesis+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+Bloodstream+Forms+Depend+upon+Uptake+of+myo-Inositol+for+Golgi+Complex+Phosphatidylinositol+Synthesis+and+Normal+Cell+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth.</a> Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).</li>
<li>Wu, M., Gerhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raising+Xenopus+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Raising Xenopus in the laboratory.</a> Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).</li>
<li>Gurdon, J. B. American clawed frogs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGurdon%2C+JB+%22Methods+in+developmental+biology%22">Methods in developmental biology</a>. Wilt, F. H., Wessels, N. K. , Thomas Y. Crowell Co. New York. 75-84 (1967).</li>
<li>Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poor+quality+of+oocytes+from+Xenopus+laevis+used+in+laboratory+experiments%3A+prevention+by+use+of+antiseptic+surgical+technique+and+antibiotic+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation.</a> Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).</li>
<li>Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+oogenesis+in+the+South+African+clawed+frog+%28Xenopus+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).</li>
<li>Kressmann, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKressmann%2C+A+%22Transfer+of+Cell+Constituents+into+Eucaryotic+Cells%22">Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells</a>. Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. , Plenum Press. 388-407 (1980).</li>
<li>Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+modulation+of+synaptic+and+extrasynaptic+GABAA+receptors+by+an+antagonist+of+the+high+affinity+benzodiazepine+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site.</a> Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).</li>
<li>Dumont, J. N., Brummett, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+V.+Relationships+between+developing+oocytes+and+their+investing+follicular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues.</a> J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).</li>
<li>Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+oocyte+resting+potential%2C+muscarinic+responses+and+the+role+of+calcium+and+guanosine+3%27%2C5%27-cyclic+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate.</a> J Physiol. 352, 551-574 (1984).</li>
<li>Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocytes+as+an+expression+system+for+studying+receptor%2Fchannel+targets+of+drugs+and+pesticides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides.</a> Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).</li>
<li>Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+subunit+combination+of+rat+brain+GABAA+receptors+on+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function.</a> Neuron. 5, 703-711 (1990).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De in dit artikel beschreven methoden afwijken van die van oudsher 7-9 gebruikt. Standaard worden de lobben van de eierstok blootstellen aan een 1-2 uur collagenase behandeling 8; isoleren onbeschadigd, ontdaan eicellen; en injecteren mRNA met gebruik van commerciële injecteerinrichtingen. Deze klassieke werkwijze heeft de volgende nadelen: 1) Eicellen waarschijnlijk beschadigd door langdurige blootstelling aan hoge concentraties collagenase. 2) De onstabiele blootgelegde oöcyten worden opgeslagen ...

Xenopus oöcyten worden veel gebruikt als een expressiesysteem (referenties 2-3, en referenties daarin). Ze kunnen goed assembleren en op te nemen functioneel actief multisubunit eiwitten in de plasmamembranen. Met dit systeem is het mogelijk om functioneel onderzoek membraaneiwitten alleen of in combinatie met andere proteïnen, teneinde de eigenschappen van gemuteerde chimere of aaneengeschakelde proteïnen, en potentiële geneesmiddelen te screenen. Voordelen van oöcyten opzichte van andere heterologe expressiesystemen omvatten de eenvoudige bediening van de reuscellen, het hoge aandeel van cellen die vreemde genetische informatie, de eenvoudige besturing van de van eicel middels bad perfusie en de controle van de membraanpotentiaal . Het nadeel van dit expressiesysteem is de seizoensgebonden variatie waargenomen in veel laboratoria 17-20. De reden voor deze variatieis verre van duidelijk. Bovendien wordt de kwaliteit van de oöcyten waargenomen vaak sterk variëren. Traditionele methoden 7-9 hebben de isolatie van eierstok lobben, de blootstelling van eierstok kwabben om collagenase voor een aantal uur, de selectie van de blootgelegde eicellen en de eicel micro-injectie opgenomen. Hier wordt een aantal alternatieve, snelle procedures gerapporteerd die konden we met dit expressiesysteem meer dan 30 jaar zonder seizoensgebonden variatie en weinig variatie in kwaliteit van de oöcyten. De gewijzigde en verbeterde werkwijzen beschreven voor het isoleren van oöcyten, micro-injectie met cRNA en verwijdering van folliculaire lagen kunnen worden gebruikt voor de expressie van een eiwit van keuze in het Xenopus oöcyt. De eenvoudige werkwijze voor snelle oplossing verandert van het medium rond de eicel kan worden toegepast op de studie van elke ligand-gated ionkanaal en dragers.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO3)2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 &mu;g penicillin/mL en 100 &mu;g streptomycin/mL</td></tr><tr><td>Platinum wire loop</td><td>zelf gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>10 &mu;L, Type 701N</td></tr><tr><td>Polytetrafluorethyleen buis met dikke wanden</td><td>Labmarket GmBH</td><td></td><td>1,0 mm OD&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraffine olie</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>Nylon net, G: 0,8 mm&nbsp;</td><td>ZBF Zürcher Beuteltuchfabrik AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicaat glasbuis&nbsp;</td><td>Corning</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>Collagenase NB Standard Grade</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine inhibitor type I-S</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>Glas capillair</td><td>Jencons (Scientific ) LTD.</td><td>H15/10</td><td>1,35 ID mm (voor perfusie), alternatieve leverancier: Harvard Apparatus Limited</td></tr><tr><td>Borosilicaat glas capillair</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0019</td><td>1,0 OD x&nbsp; 0,58 ID x 100 Lengte mm (voor microinjectie)&nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicaat glas capillair&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0044</td><td>1,2 OD x 0,69 ID x 100 Lengte mm (voor voltage clamp met twee elektroden)</td></tr><tr><td>&gamma;-aminoboterzuur (GABA)</td><td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3&alpha;,21-Dihydroxy-5&alpha;-pregnan-20-on (THDOC)</td><td>Sigma</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr><td>grill motor</td><td>Faulhaber&nbsp;</td><td></td><td>DC micromotor Type 2230 met tandwieloverbrenging Type 22/2</td></tr><tr><td>Micrometerschroef</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>Steriele kunststof transfer pipetten</td><td>Saint-Amand&nbsp; Mfg.</td><td>222-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus eicellen: geoptimaliseerd methoden voor micro-injectie, verwijdering van folliculaire lagen en fast solution veranderingen in elektrofysiologische experimenten

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

De Xenopus oöcyt als een heteroloog expressiesysteem voor eiwitten, werd eerst beschreven door Gurdon et al. 1 en is op grote schaal gebruikt sinds zijn ontdekking (referenties 2-3, en referenties daarin). Een kenmerk dat de eicel aantrekkelijk voor buitenlandse kanaal expressie maakt is de slechte overvloed van endogene ionkanalen 4. Het expressiesysteem is nuttig voor het karakteriseren van verschillende proteïnen, waaronder ligand-gated ionkanalen bewezen. De expressie van GABAA-receptoren in Xenopus oocyten en hun functionele karakterisatie wordt beschreven, inclusief isolatie oöcyten, micro-injecties met cRNA, de verwijdering van folliculaire cellagen en snelle oplossing veranderingen in elektrofysiologische experimenten. De procedures werden geoptimaliseerd in dit laboratorium 5,6 en afwijken van die welke routinematig gebruikt 7-9. Traditioneel worden ontdaan oöcyten bereidmet een verlengde collagenase behandeling van ovarium lobben bij kamertemperatuur en deze blootgelegde oöcyten gemicroinjecteerd met mRNA. Met de geoptimaliseerde methoden hebben verschillende membraaneiwitten tot expressie gebracht en onderzocht met dit systeem, zoals recombinante GABA A-receptoren 10-12, menselijk recombinant chloride kanalen 13, Trypanosoom kaliumkanalen 14 en een myo-inositol transporter 15, 16. De hier beschreven werkwijzen kunnen worden toegepast voor de expressie van een eiwit van keuze in Xenopus oöcyten, en de snelle verandering oplossing kan worden gebruikt om andere ligand-gated ionkanalen bestuderen.

Xenopus oocyten werden mechanisch aangeduid met een platina lus (figuur 1). De eicellen werden gemicroinjecteerd met mRNA coderend voor de GABAA-receptor subunits a4, p 2, δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / eicel (figuur 2). Na 4 d, werden folliculaire cel lagen verwijderd (figuur 3). Oöcyten spanning geklemd bij -80 mV en blootgesteld aan toenemende concentraties van γ-aminoboterzuur (GABA) in aanwezigheid...

Geoptimaliseerde procedures voor de isolatie van enkele follikels, cytoplasmatische RNA-microinjecties, het verwijderen van omliggende cellagen en eiwitexpressie in Xenopus eicellen worden beschreven. Daarnaast wordt een eenvoudige methode gepresenteerd voor snelle oplossingsveranderingen in elektrofysiologische experimenten met ligand-gebonden ionenkanalen.

Xenopus Eicellen: Geoptimaliseerd Methoden voor Micro-injectie, Verwijdering van folliculaire Lagen en Fast Solution Veranderingen in elektrofysiologische experimenten

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Het algemene doel van deze procedure is om nieuwe eiwitten, zoals ionenkanalen, tot expressie te brengen in Xenopus-eicellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in elk vakgebied dat een functioneel expressiesysteem vereist. De belangrijkste voordelen van de variaties van deze techniek zijn de snelheid, betrouwbaarheid en verbeterde overleving van de eicellen.Deze methode kan inzicht geven in de werking van ionenkanalen. Bovendien kan het worden toegepast op de studie van elk ander eiwit. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we ons realiseerden dat klassieke methoden resulteerden in een lage overlevingssnelheid van de eicellen.Na het verwijderen van de lobben van de eierstokken van vrouwelijke kikkers volgens het protocol in de tekst, plaatst u de lobben in steriele gemodificeerde Barth's oplossing, aangevuld met penicilline en streptomycine. Snijd de lobben open om de weefsels toegang tot zuurstof te geven. Om follikels in stadium vijf tot zes te selecteren, gebruikt u een pincet om de eierstok vast te houden en laat vervolgens een platina lus over de follikels zakken en trek de lus voorzichtig terug om het bindweefsel met de follikel van het eierstokweefsel los te maken.Sorteer gezonde eicellen met behulp van de platina lus. Gebruik een plastic Pasteur-pipet met de punt gesneden tot een diameter van 1,5 millimeter om geselecteerde follikels over te brengen naar een petrischaal van 35 millimeter diameter. Nadat u de cRNA's voor de GABA A-receptor en micro-injectiepipetten volgens het protocol in de tekst hebt voorbereid, gebruikt u paraffine-olie en een spuit van 10 milliliter met een dunne naald om een micro-injectiepijpje terug te vullen.Bevestig vervolgens het pijpje op een zelfgemaakte micro-injectie-inrichting. Gebruik een pijpje met een steriele plastic punt, plaats een druppel mRNA-oplossing op de schone kant van een stuk vochtwerend thermoplast. Dompel vervolgens de punt van het injectiepijpje in de druppel en zet de motor aan om de plunjer terug te trekken.De mRNA-oplossing moet in het pijpje binnenkomen en een zichtbaar grensvlak met de olie vormen. Trek vervolgens de punt van het pijpje terug uit de druppel en breng een positieve druk aan aan de binnenkant van het injectiepijpje. Er moet een druppel mRNA-oplossing op de punt van het injectiepijpje ontstaan.Gebruik een petrischaal van 60 millimeter met nylon gaaslijm op de bodem en bedekt met MBS voor injectie, lijn de follikels uit met hun vegetatieve polen naar boven wijzend. Gebruik de micromanipulator om het injectiepijpje over een individueel follikel te positioneren. Breng de injectienaald in het centrum van de vegetatieve pool aan en breng een positieve druk aan aan de binnenkant van het pijpje om 50 nanoliters mRNA te injecteren met een stromingssnelheid van 0,6 microliter per minuut.Wacht vijf tot 10 seconden voordat u de punt van het injectiepijpje uit het follikel verwijdert om te voorkomen dat messenger-RNA ontsnapt. Breng geïnjecteerde follikels over naar een nieuwe petrischaal gevuld met twee milliliter MBS. Plaats de schaal in een wijnkast ingesteld op 18 graden Celsius.Incubeer de geïnjecteerde follikels één tot zeven dagen voor opname, afhankelijk van de identiteit van het nieuw geëxprimeerde eiwit. Om follikels te strippen, brengt u tien geïnjecteerde follikels over naar een boorsilicaatglasbuis met 0,5 milliliter MBS, één milligram per milliliter collageenase en 0,1 milligram per milliliter trypsine-remmer. Dompel de buis in een waterbad van 36 graden Celsius en incubeer de follikels gedurende 20 minuten.De temperatuur is hier cruciaal omdat een graadje meer de eicellen kan doden. Spoel de follikels door ze over te brengen naar een tweede buis met één milliliter MBS op kamertemperatuur en laat ze ongeveer tien seconden in de buis. Breng vervolgens de follikels over naar een derde buis met 0,5 milliliter dubbel geconcentreerde MBS met vier millimolair EGTA en incubeer de monsters gedurende vier minuten op kamertemperatuur, waarbij u de buizen af en toe schudt.De incubatietijd van vier minuten is cruciaal om ervoor te zorgen dat de folliculaire lagen loskomen van de eicel. Spoel de follikels door ze over te brengen naar een andere buis met één milliliter MBS op kamertemperatuur en laat ze ongeveer 10 seconden in de buis. Breng de eicellen over naar een petrischaal van 35 millimeter met twee milliliter MBS.Gebruik vervolgens onder een stereomicroscoop een platina lus om de buitenste omhulsels van de follikels te scheiden door simpelweg de naakte eicel weg te duwen. Bewaar de ontbloote eicellen tot gebruik. In dit experiment werden mechanisch gescheiden Xenopus-eicellen geïnjecteerd met mRNA-coating voor GABA A-receptorsubeenheden.Vervolgens werden folliculaire cellagen verwijderd. De eicellen werden voltage-geklemd op minachttig millivolt en blootgesteld aan toenemende concentraties GABA en de aanwezigheid van THDOC, een krachtige positieve allosterische modulator van de GABA A-receptor. Dit paneel toont geëliceteerde stroomamplituden afhankelijk van de GABA-concentraties, wat de gevoeligheid van deze subeenhedencombinatie voor GABA aangeeft.De gebruikte vergelijking was I(c)Imax/n)waarbij c de concentratie van GABA is, de EC50 de concentratie van GABA is in de aanwezigheid van één micromolair THDOC, die een half-maximale stroomamplitude oproept. Imax is de maximale stroomamplitude. I is de stroomamplitude en n is de Hill-coëfficiënt.De EC50 van de alfa vier bèta twee delta GABA A-receptor bedroeg 0,41 0,12 micromolair en n was 0,76 0,04 Eenmaal beheerst, kunnen folliculaire cellagen in een half uur worden verwijderd als het goed wordt uitgevoerd. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers om de eiwitexpressieprocedure in Xenopus-eicellen te verbeteren. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u Xenopus-eicellen kunt isoleren die worden omringd door folliculaire cellagen, hun micro-injectie met mRNA en

xenopus-oocytes-optimized-methods-for-microinjection-removal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier laten we zien cytoplasmatische micro-injectie...

Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen

Het visualiseren van RNA Lokalisatie in Xenopus Eicellen

Bemesting van Xenopus oöcyten Het gebruik van de Host Transfer Methode

Xenopus embryonale epitheel is een ideaal modelsysteem om cel gedrag, zoals polariteit ontwikkeling en vorm veranderen tijdens epitheliale morfogenese bestuderen. Traditionele histologie van vaste monsters wordt in toenemende mate aangevuld door live-cell imaging confocale. Hier laten we zien methoden om de kikker weefsel te isoleren en te visualiseren live-epitheliale cellen en hun cytoskelet met behulp van live-cell confocale microscopie.

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Ionische stroom van BK kanalen wordt geregistreerd met behulp van patch-clamp technieken. BK kanalen worden uitgedrukt...

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

We beschrijven methoden om onrijpe eicellen van Xenopus laevis te manipuleren, in vitro rijping van eicellen tot eieren, en intracytoplasmatische sperma-injectie. Dit protocol maakt degradatie van sommige maternale eiwitten en overexpressie van interessante genen bij bevruchting mogelijk, en is daarom waardevol om de rollen van specifieke factoren in de vroege embryonale ontwikkeling te bestuderen.

Manipulatie en<em&gt; In Vitro</em&gt; Rijping van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling

Controle van eiwitsynthese vindt voornamelijk plaats tijdens de initiatiefase van translatie, waarvan tekortkomingen zijn gekoppeld aan verschillende aandoeningen. Om de etiologie beter te begrijpen, beschreven we hier een protocol met Xenopus laevis eicellen dat de translatie van het mos-transcript beoordeelt in aanwezigheid van een mutant van translatie-initiatiefactor eIF4G1.

Xenopus laevis als een model te identificeren Vertaling Impairment

Het manuscript hier een eenvoudige set van methoden voor het analyseren van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabelde liganden in Xenopus. Dit verschaft een context voor het testen van het vermogen van andere eiwitten ligand distributie passen en waardoor experimenten inzicht in mechanismen reguleren morfogeen gradiënten kunnen leiden.

Met behulp van confocale Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek

We beschrijven een Xenopus eicel en dierlijk kapsysteem voor de expressie-klonering van genen die in staat zijn om een respons te induceren in competent ectoderm, en bespreken technieken voor de daaropvolgende analyse van dergelijke genen. Dit systeem is nuttig bij de functionele identificatie van een breed scala aan genproducten.

Functionele klonen behulp van een<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel Expression System

Dit artikel beschrijft een versterking van conventionele Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) waar Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) worden gebruikt in plaats van maleimide kleurstoffen, om structurele herrangschikkingen in ionenkanalen te onderzoeken. De procedure omvat Xenopus oocyt DNA injectie, RNA / fUAA coinjection, en gelijktijdige stroom en fluorescentie metingen.

Spanningsklem Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyten Met Fluorescerende Onnatuurlijke Aminozuren

Hier presenteren we een protocol om gap junction-eiwitten in Xenopus-eicellen tot expressie te brengen en junctionele stroom tussen twee geapofesteerde eicellen te registreren met behulp van een commerciële versterker die is ontworpen voor dubbele oöcytspanningsklemopnamen in een hoge zijstroommeetmodus.

Opname gap junction stroom van Xenopus Oocyten

Leer geoptimaliseerde methoden voor micro-injectie en verwijdering van folliculaire lagen in Xenopus oocyten voor elektrofysiologische experimenten. Deze technieken verbeteren de overlevingskans en betrouwbaarheid van eiwitexpressie.

Xenopus Eicellen: Geoptimaliseerd Methoden voor Micro-injectie, Verwijdering van folliculaire Lagen en Fast Solution Veranderingen in elektrofysiologische experimenten (Video) | JoVE Journal

Xenopus Eicellen: Geoptimaliseerd Methoden voor Micro-injectie, Verwijdering van folliculaire Lagen en Fast Solution Veranderingen in elektrofysiologische experimenten

Meer video's verkennen