Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis

Het algemene doel van deze procedure is om eiwitten te identificeren die interageren met een Nucleair Cofactor met behulp van LC-MS/MS Analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot transcriptionele mechanismen op het gebied van gen-regulatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de eiwitten kunnen identificeren die interageren met een nucleair cofactor.

Bovendien stelt deze methode ons in staat om de transcriptionele regulatorische mechanismen van de gerichte nucleaire factoren beter te begrijpen. Oogst HEK 293 cellen die flag-gelabeld ARIP4 tot expressie brengen 36 uur na transvectie door de celplaat te wassen met ijskoud PBS en de cellen te verzamelen met een celschraper. Breng de cellen over in een buisje van 1,5 milliliter en centrifugeer vervolgens gedurende twee minuten bij 8000g op vier graden Celsius.

Zuig het supernatant op en suspendeer de celpellet opnieuw in vijf keer het pelletvolume van High Salt Buffer. Roter het mengsel gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Na 20 minuten rotatie, centrifugeer de buis bij 17.700g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Breng vervolgens de supernatanten over naar een nieuwe buis van twee milliliter en voeg Dilutiebuffer toe tot drie keer het volume van supernatant. Voer een andere centrifugatie uit en breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis van twee milliliter. Was tijdens de 10 minuten centrifugatie 50 microliter anti-flag korrels met PBS.

Centrifugeer vervolgens de buis gedurende één minuut bij 2000g en vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en herhaal de wasstappen eerst met 1 molaair glycinezuur en vervolgens met 1 molaair tris-zout. Was vervolgens twee keer met Low salt buffer.

Meng vervolgens 50 microliter gewassen korrels met gehele-celextracten. Roter het mengsel gedurende vier uur bij twee tot vier graden Celsius. Gebruik vervolgens een stompe punt om het monster over te brengen naar een micro spin kolom en laat de oplossing druppelen in een buisje van 1,5 milliliter.

Bevriest de flow-through in vloeibare stikstof en bewaart bij min 80 graden Celsius. Was vervolgens de flag korrels vijf keer met Low salt buffer. Om te elueren, plaats de kolom in een buisje van 1,5 milliliter en centrifugeer gedurende één minuut bij 2000g om de korrels te drogen.

Dompel de onderkant van de kolom af en voeg vervolgens 50 microliter van 1 molaair glycinezuur toe. Schud het mengsel gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Plaats na 10 minuten de kolom in een nieuwe buis van 1,5 milliliter en centrifugeer gedurende één minuut bij 2000g.

Neutraliseer de geëluteerde oplossing met 10 microliter van 1 molaair tris-zout en meng goed door te pipetten en te vortexen. Voeg 50 microliter van 100 millimolaair ammoniumbicarbonaat toe. 10 microliter acetonitril, twee microliter dithiothreitol en 50 microliter van het geneutraliseerde monster.

Incubeer gedurende 30 minuten bij 56 graden Celsius. Laat na incubatie het monster gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 10 microliter van 333 millimolaair iodoacetamide toe aan het monster en incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij 37 graden C.Voeg 10 microliter trypsine toe aan het mengsel en incubeer een nacht bij 37 graden Celsius.

Breng de volgende dag het eindproduct naar een LC-MS/MS faciliteit of naar een derdepartij massaspectrometrie lab voor analyse. Deze afbeelding toont zilverkleuring van flag epitoopgetikt ARIP4 tot expressie gebracht in HEK 293 cellen na immunoprecipitatie met een flag specifiek antilichaam en scheiding door middel van elektroforese. Als controle werd een mock-zuivering uitgevoerd op HEK 293 cellen die geen exogene eiwitten tot expressie brachten.

Met behulp van onze methode is het mogelijk om putatieve nucleaire cofactoren te identificeren via hun transcriptionele factor van belang en ons begrip van transcriptionele regulatorische mechanismen verder te vergroten.