Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis
January 24th, 2017
We hebben een werkwijze voor het zuiveren van eiwitten mederegulerende interactie met de LC-MS / MS systeem.
Het algemene doel van deze procedure is om eiwitten te identificeren die interageren met een Nucleair Cofactor met behulp van LC-MS/MS Analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot transcriptionele mechanismen op het gebied van gen-regulatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de eiwitten kunnen identificeren die interageren met een nucleair cofactor.
Bovendien stelt deze methode ons in staat om de transcriptionele regulatorische mechanismen van de gerichte nucleaire factoren beter te begrijpen. Oogst HEK 293 cellen die flag-gelabeld ARIP4 tot expressie brengen 36 uur na transvectie door de celplaat te wassen met ijskoud PBS en de cellen te verzamelen met een celschraper. Breng de cellen over in een buisje van 1,5 milliliter en centrifugeer vervolgens gedurende twee minuten bij 8000g op vier graden Celsius.
Zuig het supernatant op en suspendeer de celpellet opnieuw in vijf keer het pelletvolume van High Salt Buffer. Roter het mengsel gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Na 20 minuten rotatie, centrifugeer de buis bij 17.700g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.
Breng vervolgens de supernatanten over naar een nieuwe buis van twee milliliter en voeg Dilutiebuffer toe tot drie keer het volume van supernatant. Voer een andere centrifugatie uit en breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis van twee milliliter. Was tijdens de 10 minuten centrifugatie 50 microliter anti-flag korrels met PBS.
Centrifugeer vervolgens de buis gedurende één minuut bij 2000g en vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en herhaal de wasstappen eerst met 1 molaair glycinezuur en vervolgens met 1 molaair tris-zout. Was vervolgens twee keer met Low salt buffer.
Meng vervolgens 50 microliter gewassen korrels met gehele-celextracten. Roter het mengsel gedurende vier uur bij twee tot vier graden Celsius. Gebruik vervolgens een stompe punt om het monster over te brengen naar een micro spin kolom en laat de oplossing druppelen in een buisje van 1,5 milliliter.
Bevriest de flow-through in vloeibare stikstof en bewaart bij min 80 graden Celsius. Was vervolgens de flag korrels vijf keer met Low salt buffer. Om te elueren, plaats de kolom in een buisje van 1,5 milliliter en centrifugeer gedurende één minuut bij 2000g om de korrels te drogen.
Dompel de onderkant van de kolom af en voeg vervolgens 50 microliter van 1 molaair glycinezuur toe. Schud het mengsel gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Plaats na 10 minuten de kolom in een nieuwe buis van 1,5 milliliter en centrifugeer gedurende één minuut bij 2000g.
Neutraliseer de geëluteerde oplossing met 10 microliter van 1 molaair tris-zout en meng goed door te pipetten en te vortexen. Voeg 50 microliter van 100 millimolaair ammoniumbicarbonaat toe. 10 microliter acetonitril, twee microliter dithiothreitol en 50 microliter van het geneutraliseerde monster.
Incubeer gedurende 30 minuten bij 56 graden Celsius. Laat na incubatie het monster gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 10 microliter van 333 millimolaair iodoacetamide toe aan het monster en incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij 37 graden C.Voeg 10 microliter trypsine toe aan het mengsel en incubeer een nacht bij 37 graden Celsius.
Breng de volgende dag het eindproduct naar een LC-MS/MS faciliteit of naar een derdepartij massaspectrometrie lab voor analyse. Deze afbeelding toont zilverkleuring van flag epitoopgetikt ARIP4 tot expressie gebracht in HEK 293 cellen na immunoprecipitatie met een flag specifiek antilichaam en scheiding door middel van elektroforese. Als controle werd een mock-zuivering uitgevoerd op HEK 293 cellen die geen exogene eiwitten tot expressie brachten.
Met behulp van onze methode is het mogelijk om putatieve nucleaire cofactoren te identificeren via hun transcriptionele factor van belang en ons begrip van transcriptionele regulatorische mechanismen verder te vergroten.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het zuiveren van co-regulatoire interactie-eiwitten met behulp van LC-MS/MS-analyse. De techniek is gericht op het identificeren van eiwitten die interageren met een nucleair cofactor, waardoor ons begrip van transcriptionele regulatoire mechanismen wordt verbeterd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Genregulatie
Achtergrond
- Het begrijpen van transcriptionele mechanismen is cruciaal in genregulatie.
- Het identificeren van eiwitinteracties kan inzichten opleveren in cellulaire processen.
- LC-MS/MS is een krachtig hulpmiddel voor het analyseren van eiwitinteracties.
- Deze methode richt zich op nucleaire cofactoren en hun regulerende rollen.
Doel van het onderzoek
- Om eiwitten te identificeren die interageren met een nucleair cofactor.
- Om transcriptionele regulatoire mechanismen te verduidelijken.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor eiwitzuivering.
Gebruikte methoden
- Het oogsten van HEK 293-cellen die flag-gelabeld ARIP4 tot expressie brengen.
- Cellen wassen met ijskoud PBS.
- Cellen verzamelen met behulp van een celschraper.
- Cellen centrifugeren bij 8000g gedurende twee minuten bij 4°C.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van eiwitten die interageren met nucleaire cofactoren.
- Verbeterd begrip van transcriptionele mechanismen.
- Demonstratie van de effectiviteit van de LC-MS/MS-methode.
- Mogelijke toepassingen in genregulatie-onderzoek.
Conclusies
- De methode biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van eiwitinteracties.
- Het draagt bij aan het bredere begrip van genregulatie.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze techniek voor verdere inzichten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput identification of nuclear cofactor protein interactions using LC-MS/MS is pivotal for de-risking early discovery and clarifying transcriptional regulatory networks. This workflow enables biopharma teams to interrogate mechanistic hypotheses and prioritize targets based on direct protein-protein interaction evidence. Integrating robust interactome mapping at the discovery stage supports predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of nuclear cofactor binding partners for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying transcriptional regulatory pathways.
- Provides direct evidence for protein interaction networks relevant to gene regulation.
- Facilitates prioritization of targets with validated molecular interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream quantitative LC-MS/MS analysis.
- Standardizes immunoprecipitation and sample preparation for reproducible interactome profiling.
- Generates quantitative data supporting assay development and screening readiness.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns interactome data with disease-relevant transcriptional mechanisms when nuclear cofactors are implicated in pathology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by mapping regulatory protein networks.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic insights.
Pipeline & Workflow Integration
This protein preparation and LC-MS/MS workflow fits at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational interactome data for downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping nuclear cofactor interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides mass spectrometry-based identification and quantification of protein complexes.
- Translational Research: Enables alignment of molecular interaction data with disease models when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for interactome mapping across targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes protein complex isolation and LC-MS/MS analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by grounding advancement in direct interaction data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on validated molecular mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, protein chemistry, and LC-MS/MS analytics.
- Needs access to mass spectrometry instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptable to different nuclear cofactors and tagged protein systems with protocol optimization.
- Dependent on antibody specificity and quality for reliable immunoprecipitation.
