Name: Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Leer een eiwitbereidingsmethode voor de high-throughput identificatie van eiwitinteracties met een nucleair cofactor met behulp van LC-MS/MS-analyse. Deze aanpak helpt onderzoekers transcriptieregulatie te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), de Takeda Science Foundation (HT) en door een Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Young Scientists (B) aan HT.

1. Transfectie <ol><li> Zaad HEK293 cellen in 100 mm kweekplaten (2 x 10 6 cellen / schaal). Cultuur van de cellen in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum, 100 ug / ml streptomycine en 100 eenheden / ml penicilline. Incubeer de cellen in een vochtige incubator bij 5% CO2 en 37 ° C. </li><li> De volgende dag transfecteren de cellen met 10 ug-FLAG tag ARIP4 plasmide middels 40 gl transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant 11. </li></ol> 2. Eiwitextractie <ol><li> Ongeveer 36 uur na transfectie, was de cellen met ijskoude PBS en oogst de cellen met behulp van een schraper. Breng de cellen in een 1,5 mltube en Centrifugeer bij 8000 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 5x het volume pellet van 0,4 M KCl-buffer (met hoge zout buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,4 M KCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptethanol, 1x proteaseremmer cocktail). Draai het mengsel gedurende 20 minuten bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer de buis bij 17.700 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Breng de bovenstaande (whole-cell extract) naar een nieuwe 2 ml buis en voeg 3x het beginvolume van 0 M KCl-buffer (verdunning buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM β-mercaptoethanol, 1x proteaseremmer cocktail). </li><li> Maak een andere centrifugatie (17.700 g gedurende 10 min bij 4 ° C) en giet het supernatant (cellulair extract) naar een nieuwe 2 ml buis. </li></ol> 3. Immunoprecipitatie <ol><li> Tijdens de centrifugatie (2,4), was 50 pl anti-FLAG kralen met PBS, 0,1 M glycine-hydrochloride, en vervolgens 1 M Tris-hydrochloride, gevolgd door tweemaal wassen met 0,1 M KCl-buffer (lage zout buffer: 20 mM Tris HCl (pH 8,0), 0,1 m KCl, 5 mM MgCl2, 10% glycerol, 0,1% NP-40, 10 mM b-mercaptoethanol, 1x proteaseremmer cocktail). De centrifugatie gedurende dit wasproces wordt uitgevoerd bij 2000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. </li><li> Meng 50 pl FLAG kralen met de gehele celextracten en voorzichtig zwenken het mengsel gedurende 4 uur bij 2-4 ° C (1% van het gehele celextract uit stap 2.4 moeten ook bij -80 ° C voor toekomstig gebruik bewaard als ingang). </li><li> Breng het monster op een micro-spin-kolom (zwaartekracht drop). Houd het doorstroomkanaal in een 1,5 ml buis, bevriezen met vloeibare stikstof, en het op -80 ° C (controleer de eiwit niveaus van zowel de input en doorstroming via Western blot analyse). </li><li> Voeg 1 ml 0,1 M KCl-buffer (laag zout buffer) aan de FLAG parels (zwaartekracht drop) wassen. </li><li> Herhaal stap 3,4 ten minste vier keer (voor een totaal van vijf wassingen). </li></ol> 4. Elutie <ol><li> Plaats de kolom in een 1,5 ml buis en centrifugeer het op 2000 g gedurende 1 min; de korrels droogt. </li><li> Cap de onderkant vande kolom. </li><li> Voeg 50 ul (gelijk aan het volume van FLAG parels) van 0,1 M glycine-HCl (pH 2,5). </li><li> Schud het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats de kolom in een nieuwe 1,5 ml buis en centrifugeer bij 2000 xg deze gedurende 1 min. </li><li> De geëlueerde oplossing wordt geneutraliseerd met 10 pi 1 M Tris-HCl (pH 8,0); Meng goed door pipetteren of met een vortexmachine. </li></ol> 5. Alkylering en trypsine <ol><li> Voeg 50 ul van 100 mM NH 4 HCO 3, 10 pl CH3CN en 2 pl dithiothreitol aan het mengsel (112 ui totaal volume). </li><li> Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 56 ° C. </li><li> Het monster wordt bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Voeg 10 ul van 333 mM joodaceetamide om het monster en incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 10 ul trypsine (33 ng / ul) aan het mengsel en incubeer deze overnacht bij 37 ° C. </li></ol><ol><li> Na &#39;s nachts trypsine, vervoeren het eindproduct van een LC-MS / MS voorziening of aan een derde partij massaspectrometrie laboratorium voor analyse 12. </li></ol>

<ol><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.Biol%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).</li>
<li>Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interactions+involved+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interactions involved in cellular signaling.</a> Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).</li>
<li>MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+PLIN+proteins%2C+ATGL+and+CGI-58%2C+interactions+at+rest+and+following+stimulated+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction.</a> Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).</li>
<li>Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactive-state+preassembly+of+G%28q%29-coupled+receptors+and+G%28q%29+heterotrimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Chem.Biol%22%5BJournal%5D)">Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers.</a> Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).</li>
<li>Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+with+chromatin+modifiers+that+occupies+E2F-+and+Myc-responsive+genes+in+G0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells.</a> Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+histone+modifications+mediated+by+a+CtBP+co-repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex.</a> Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).</li>
<li>Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+human+papillomavirus+type+16+E7+oncoprotein+with+the+600-kDa+retinoblastoma+protein-associated+factor%2C+p600%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).</li>
<li>Huang, B. X., Kim, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+identification+of+Akt+interacting+proteins+by+two-step+chemical+crosslinking%2C+co-immunoprecipitation+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry.</a> PLoS One. 8 (4), 61430(2013).</li>
<li>ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+immuno-precipitation+proteomics+-+the+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide.</a> Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).</li>
<li>Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Suppression+by+Transient+Recruitment+of+ARIP4+to+Sumoylated+nuclear+receptor+Ad4BP%2FSF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Biol.Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1.</a> Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).</li>
<li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagic+receptor+p62+regulates+the+abundance+of+transcriptional+coregulator+ARIP4+during+nutrient+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Rep%22%5BJournal%5D)">Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation.</a> Sci.Rep. 5, 14498(2015).</li>
<li>Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+an+intracellular+lectin%2C+calnexin%2C+from+Aspergillus+oryzae+using+N-glycan-conjugated+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.Biotechnol.Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads.</a> Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).</li>
<li>Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyrk1A+potentiates+steroid+hormone-induced+transcription+via+the+chromatin+remodeling+factor+Arip4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Biol%22%5BJournal%5D)">Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4.</a> Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).</li>
<li>Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunoprecipitation+mass+spectrometry+of+endogenous+proteins+%28RIME%29+for+analysis+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes.</a> Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).</li>
<li>Fonslow, B. R., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+applied+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Sep.Sci%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis.</a> J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Efficiënte transfectie is essentieel voor een succesvol resultaat met dit protocol verkregen. Daarom raden wij u aan Western blot analyse om de immunogeprecipiteerd FLAG-gemerkte eiwitten te bepalen. Deze stap kan de gebruiker controleren of hun eiwit van interesse behoren tot overexpressie wordt gebracht en bovendien dat de IP is gelukt. FLAG-gemerkt eiwit niveaus ook vóór de massaspectrometrie analyse gecontroleerd. Een mock monster moet worden gebruikt als een negatieve controle te vermij...

Eiwit-eiwit interacties een belangrijke rol in vele biologische functies. Als zodanig zijn deze interacties betrokken bij signaaltransductie; eiwit transport over celmembranen; celstofwisseling; en verschillende nucleaire processen, waaronder DNA-replicatie, DNA schade herstel, recombinatie en transcriptie 1, 2, 3, 4. Het identificeren van de eiwitten die betrokken zijn bij deze interacties is daarom van cruciaal belang voor onze kennis van deze cellulaire processen. Immunoprecipitatie (IP) is een gevalideerde techniek om eiwit-eiwit interacties analyseren. Om de identificatie van co-immunogeprecipiteerd eiwitten vergemakkelijken, wordt vaak gebruikt massaspectrometrie 5, 6, 7, 8,9. Door zich te richten een bekend lid van een eiwitcomplex met een antilichaam, is het mogelijk om het eiwitcomplex te isoleren en vervolgens de onbekende componenten identificeren via massaspectrometrie analyse. ARIP4 (androgeen-receptor interactie eiwit 4), een transcriptie coregulator samenwerkt met nucleaire receptoreiwitten voor het activeren of onderdrukken zijn doel promotors in een context-afhankelijke wijze 9, 10. Om beter te begrijpen van de transcriptie regulerende mechanismen die deze nucleaire factoren beschrijven we een uitgebreide methode te zuiveren en te identificeren ARIP4 interagerende eiwitten met behulp van de LC-MS / MS-systeem.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfectie Reagens</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail (EDTA vrij) (100x)</td><td>nacalai tesque</td><td>03969-21</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Afiniteitsgel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Kolommen</td><td>BIO-RAD</td><td>732-6204</td><td></td></tr></tbody></table>

een eiwit bereidingswijze voor de high-throughput identificatie van eiwitten interactie met een nucleair cofactor met behulp van lc-ms / ms analysis

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Transcriptionele coregulators zijn essentieel voor de efficiënte transcriptionele regulatie van de structuur van nucleair chromatine. Co-regulators spelen een verscheidenheid aan rollen bij het reguleren van transcriptie. Deze omvatten de directe interactie met transcriptiefactoren, de covalente modificatie van histonen en andere eiwitten, en de incidentele verandering van chromatine-conformatie. Daarom is het vaststellen van relatief snelle methoden voor het identificeren van eiwitten die binnen dit netwerk interageren, cruciaal voor het verbeteren van ons begrip van de onderliggende regulatorische mechanismen. LC-MS/MS-gemedieerde identificatie van eiwitbindingspartners is een gevalideerde techniek die wordt gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te analyseren. Door immunoprecipitatie van een eerder geïdentificeerd lid van een eiwitcomplex met een antilichaam (soms met een antilichaam voor een getagd eiwit) is het mogelijk om de onbekende eiwitinteracties via massaspectrometrie-analyse te identificeren. Hier presenteren we een methode voor eiwitvoorbereiding voor de LC-MS/MS-gemedieerde high-throughput identificatie van eiwitinteracties die nucleaire cofactoren en hun bindingspartners betreft. Deze methode zorgt voor een beter begrip van de transcriptionele regulatorische mechanismen van de beoogde nucleaire factoren.

We identificeerden een sterk signaal ARIP4, ongeveer 160 kDa, evenals die van een mock vergelijkingsmonster en verscheidene andere onbekende eiwitten (Figuur 1). LC-MS / MS analyse identificeerde zowel ARIP4 complex peptiden en de potentiële peptide cofactoren in de fractie van FLAG parels (tabel 1). p62 (Sequestosome1), een bekende ARIP4 cofactor 11 werd geïdentificeerd in de analyse (tabel 1), waarbij de werkzaa...

We hebben een werkwijze voor het zuiveren van eiwitten mederegulerende interactie met de LC-MS / MS systeem.

Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van eiwitten die interageren met een nucleaire cofactor middels LC-MS/MS-analyse. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen met betrekking tot transcriptionele mechanismen binnen het veld van genregulatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de eiwitten kunnen identificeren die interageren met een nucleaire cofactor.Bovendien stelt deze methode ons in staat om de transcriptionele regulatiemechanismen van de beoogde nucleaire factoren beter te begrijpen. Oogst HEK 293-cellen die flag-getagd ARIP4 tot expressie brengen 36 uur na transfectie door de cellaag te wassen met ijskoud PBS en de cellen te verzamelen met een celscraper. Breng de cellen over in een 1,5 milliliter buis en centrifugeer deze vervolgens 2 minuten bij 8000g bij vier graden Celsius.Zuig het supernatant af en resuspendeer de celpellet in vijf keer het pelletvolume High Salt Buffer. Draai het mengsel 20 minuten bij vier graden Celsius. Centrifugeer de buis na 20 minuten draaien 10 minuten bij 17.700g bij vier graden Celsius.Breng vervolgens de supernatanten over naar een nieuwe buis van twee milliliter en voeg verdunningsbuffer toe in een hoeveelheid van drie keer het volume van de supernatant. Voer opnieuw een centrifugatie uit en breng de supernatant daarna over naar een nieuwe buis van twee milliliter. Was tijdens de 10 minuten durende centrifugatie 50 microliters anti-flag beads met PBS.Centrifugeer de buis vervolgens 1 minuut bij 2000g op vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en herhaal de wasstappen eerst met 1 M glycinehydrochloride en daarna met 1 M trishydrochloride. Was vervolgens twee keer met Low salt buffer.Meng vervolgens 50 µL gewassen beads met whole-cell extracten. Roteer het mengsel voorzichtig gedurende vier uur bij twee tot vier °C. Gebruik daarna een stompe tip om het monster over te brengen naar een micro spin-kolom en laat de oplossing doordruppelen in een 1,5 mL buisje.Bevries de doorstroomvloeistof snel in vloeibare stikstof en bewaar deze bij -80 °C. Was vervolgens de flag-beads vijf keer met Low salt buffer. Om te elueren, plaatst u de kolom in een buisje van 1,5 ml en centrifugeert u deze een minuut lang bij 2000g om de beads te drogen.Sluit de onderkant van de kolom af en voeg vervolgens 50 µL 1 M glycinehydrochloride toe. Schud het mengsel voorzichtig gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de kolom na 10 minuten in een nieuwe buis van 1,5 mL en centrifugeer 1 minuut bij 2000g.Neutraliseer de elueeroplossing met 10 µL 1 M tris-hydrochloride en meng deze goed door te pipetteren en te vortexen. Voeg 50 µL 100 mM ammoniumbicarbonaat, 10 µL acetonitril, 2 µL dithiothreïtol en 50 µL van het geneutraliseerde monster toe.Incubeer gedurende 30 minuten bij 56 °C. Laat het monster na incubatie 10 minuten bij kamertemperatuur staan. Voeg vervolgens 10 µL 333 mM iodoacetamide toe aan het monster en incubeer dit 30 minuten in het donker bij 37 °C. Voeg 10 µL trypsine toe aan het mengsel en incubeer dit overnacht bij 37 °C.Transporteer het eindproduct de volgende dag naar een LC-MS/MS-faciliteit of naar een extern massaspectrometrielaboratorium voor analyse. Deze afbeelding toont zilverkleuring van flag-epitope-getagd ARIP4 tot expressie gebracht in HEK 293-cellen na immunoprecipitatie met een flag-specifiek antilichaam en scheiding via elektroforese. Als controle werd een mock-zuivering uitgevoerd op HEK 293-cellen die geen exogene eiwitten tot expressie brachten.Met onze methode is het mogelijk om vermeende nucleaire cofactoren te identificeren via hun transcriptiefactor van belang en ons begrip van transcriptionele regulatiemechanismen verder te verdiepen.

a-protein-preparation-method-for-high-throughput-identification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wij presenteren een variatie van de QUICK (kwantitatieve Immunoprecipitatie combinatie met Knockdown) benadering die eerder werd onderscheid te maken tussen echte en valse eiwit-eiwit interacties. Onze aanpak is gebaseerd...

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

SILAC immunoprecipitatie experimenten vormen een krachtig middel voor het ontdekken van nieuwe eiwit: eiwit interacties. Doordat de nauwkeurige relatieve kwantificering van eiwitgehalte in zowel controle monsters, waar interacties gemakkelijk kan worden onderscheiden van experimenteel verontreinigingen en lage affiniteit interacties bewaard door het gebruik van minder stringente buffer omstandigheden.

Identificatie van eiwit interacties Partners in zoogdiercellen behulp SILAC-immunoprecipitaties Kwantitatieve Proteomics

Eiwit-eiwit interacties kunnen zowel in de kern als in het cytoplasma van een cel optreden. Om deze interacties te onderzoeken, worden traditionele co-immunoprecipitatie en moderne proximity ligatie-assay toegepast. In deze studie vergelijken we deze twee methoden om de verdeling van NF90-RBM3 interacties in de kern en het cytoplasma te visualiseren.

Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Hier presenteren we een protocol voor een verterings techniek op membraan voor de bereiding van monsters voor massaspectrometrie. Deze techniek vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties.

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Een veelzijdig cryoslicing BN-MS protocol met behulp van een microtoom wordt gepresenteerd voor hoge-resolutie complexome profilering.

Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

Beschreven is een proteomica-workflow voor het identificeren van eiwit interactie partners uit een nucleaire subcellulaire fractie met behulp van immunoaffinity verrijking van een gegeven proteïne van belang en label-vrije massaspectrometrie. De workflow omvat subcellulaire fractionering, immunoprecipitatie, filter aided monstervoorbereiding, offline opruimen, massaspectrometrie, en een downstream bioinformatica pijpleiding.

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Een neuronaal lysosoom proximity labeling proteomics protocol wordt hier beschreven om de dynamische lysosomale micro-omgeving in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen te karakteriseren. Lysosomale membraaneiwitten en eiwitten die interageren met lysosomen (stabiel of tijdelijk) kunnen nauwkeurig worden gekwantificeerd in deze methode met een uitstekende intracellulaire ruimtelijke resolutie in levende menselijke neuronen.

Karakterisering van neuronale lysosoom interactoom met proximity labeling proteomics

Hier presenteren we een protocol om het vastleggen en identificeren van ziektespecifieke eiwit-eiwitinteracties van natuurlijke cellen en weefsels mogelijk te maken met behulp van chemische sondes en massaspectrometrie. De resulterende interactiedatasets worden geanalyseerd via een speciaal webgebaseerd platform om dynamische netwerkdisfuncties en routeveranderingen die verband houden met ziekte aan het licht te brengen.

In kaart brengen van disfunctionele eiwit-eiwitinteracties bij ziekte

Een UV-gebaseerde ChIRP-methode om directe interacties tussen lncRNA en eiwitten te identificeren.

Een UV-gebaseerde ChIRP-methode voor de verifieerbare identificatie van eiwitten die direct interageren met LncRNA: van gekweekte cellen tot muistestikels

Leer een eiwitbereidingsmethode voor de high-throughput identificatie van eiwitinteracties met een nucleair cofactor met behulp van LC-MS/MS-analyse. Deze aanpak helpt onderzoekers transcriptieregulatie te bestuderen.

Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis (Video) | JoVE Journal

Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis

Meer video's verkennen