Name: Rapid Isolatie van BMPR-IB + Adipose-afgeleide stromacellen voor gebruik in een calvarial Defect Healing Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Leer de isolatie van BMPR-IB+ adipose-afgeleide stromacellen voor regeneratieve geneeskunde. Deze methode test osteogene activiteit in vivo in een calvariaal defectmodel voor craniofaciale biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.D.M. werd ondersteund door de American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship. M.S.H. werd ondersteund door de California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159. M.S.H., H.P.L. en M.T.L. werden ondersteund door de American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award. H.P.L. werd ondersteund door NIH grant R01 GM087609 en een schenking van Ingrid Lai en Bill Shu ter ere van Anthony Shu. H.P.L. en M.T.L. werden ondersteund door het Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine en The Oak Foundation. M.T.L. werd ondersteund door NIH grants U01 HL099776, R01 DE021683-01 en RC2 DE020771. D.C.W. werd ondersteund door NIH grant 1K08DE024269, het Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine en de Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.

LET OP: Monsters werden verkregen van patiënten die geïnformeerde toestemming gaf. Alle protocollen zijn beoordeeld en door de passende Stanford University Institutional Review Board goedgekeurd. Terwijl de behandeling van menselijke weefsels en cellen, altijd houden aan Biosafety Level 2 (BSL2) voorzorgsmaatregelen, zoals gespecificeerd door uw instelling. 1. Bereiding van reagentia <ol><li> Bereid FACS-buffer: Voeg 10 ml FBS, 5 ml Poloxameer 188 en 5 ml Pen-Strep tot 500 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Bereid verteren mengsel: Voeg 0,375 g C. hemolyticum collagenase type II poeder en 5 ml Poloxamer 188-500 ml steriele 199 / EBSS medium. </li><li> Bereid standaardmedium Voeg 50 ml FBS en 5 ml Pen-Strep 500 ml Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium. </li></ol> 2. Oogsten en isolatie van ASC OPMERKING: Zorg dat adequate institutionele goedkeuringen zijn in de plaats voor het gebruik van menselijk weefsel en voor het isoleren van human stamcellen. Het verkrijgen van menselijke buik, flank, of dij onderhuids vet van een gezonde donor electieve liposuctie ondergaan. Houd het vet in een plastic zuigkracht bus. <ol><li> Voeg steriel PBS in een 1: 1 verhouding tot het vet in de originele plastic bus. (Als er 500 ml vet, voeg 500 ml PBS). Meng door zacht schudden gedurende 30 s. Laat de waterlaag om naar de bodem (figuur 1) en vervolgens aspireren en gooi de waterlaag met een 10 ml plastic pipet verbonden afzuiging. </li><li> Giet het vet in een grote plastic container en voeg verteren mengsel in een 1: 1 ratio. Het vat en de buitenkant met 70% ethanol reinigen. Dicht de dop met paraffine film. </li><li> Schud verpakking in een orbitale schudder bij 180 rpm bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Neutraliseer de vertering door toevoeging standaardmedium in een 1: 1 ratio. (Als er 1000 ml vetmengsel, voeg 1000 ml standaard medium). </li><li> Verdeel het mengsel gelijkmatig in een even aantal 250 ml plastic conische centrifugebuizen en gecentrifugeerd mengsel bij 300 xg gedurende 20 min bij 4 ° C </li><li> Zuig het supernatant en wees voorzichtig om de pellet intact te laten. Resuspendeer pellets in 5 ml standaardmedium per conische buis. </li><li> Filtreer de suspensie door een 100 micron filter in een 50 ml conische centrifugebuis. Vervolgens centrifuge bij 300 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 ml kamertemperatuur RBC lysisbuffer. Laat het mengsel zitten 5 minuten bij kamertemperatuur en centrifugeer bij 300 xg gedurende 15 min bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 15 ml standaard medium. Opnieuw filteren door een 100 micron filter in een 50 ml conische centrifugebuis. </li><li> In een nieuwe 50 ml conische, voeg 15 ml polysucrose oplossing die is ontworpen voor de dichtheid gebaseerde scheiding (zie lijst van de reagentia). Vervolgens, die de buis bij 45 ° voorzichtig pipet de cellen op de zijkant vande buis zodat de celsuspensie voorzichtig lagen bovenop de polysucrose oplossing (figuur 2). Opmerking: Het is belangrijk pipet cellen op het oppervlak van de oplossing. Mis polysucrose oplossing aan een suspensie van cellen als deze een onomkeerbare mengsel zal maken. Ook niet de cellen pipet in het midden van de polysucrose oplossing. </li><li> Centrifugeer dit mengsel bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Gebruik een lage versnelling (2 - 3 van de 10) en stel de remfunctie van de centrifuge tot nul voor deze stap. LET OP: helder op de bodem, bewolkt in het midden, en zalmkleurige op de top: Drie lagen zichtbaar. De middelste laag bevat de cellen van belang. </li><li> Met behulp van een 10 ml pipet verwijder voorzichtig de middelste laag en over te dragen aan een nieuwe 50 ml conische buis. Opmerking: Het is beter om de middelste laag volledig overdragen en in het proces neemt een deel van de bovenste en onderste lagen dan achter een deel van de middelste laag. </li> &lt;li&gt; Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en het bepalen van het totale levend aantal cellen. OPMERKING: We gebruiken meestal trypan blue toegevoegd aan het celmengsel tot een uiteindelijke concentratie van 0,8% om te helpen bij het tellen van cellen. Levensvatbare levende cellen zal niet nemen van de blauwe kleurstof en zal verschijnen wit. </li></ol> 3. FACS sorteren voor BMPR-IB positieve cellen en bereiding van-Cell met steigers <ol><li> Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de cellen in FACS buffer bij een concentratie van 1 miljoen cellen per 100 pl (gebaseerd op het aantal cellen gedaan in stap 2.13). </li><li> Transfer ten minste 10 miljoen cellen een plastic centrifugebuis label &quot;BMPR-IB.&quot; Afzonderlijk overdracht één miljoen cellen in 100 gl FACS buffer tot een aparte plastic centrifugebuis label &quot;Ongekleurde.&quot; Voeg 1 ml FACS buffer om de &quot;Ongekleurde&quot; tube. Houd de rest van de cellen in FACS-buffer op ijs terwijl de FACS sortering gedeelte van de experrimentele wordt gedaan. Label deze cellen &quot;Unsorted.&quot; Gebruik deze als controles later in het experiment. </li><li> Voeg een geschikte hoeveelheid van een fluorescerend anti-humaan BMPR-IB antilichaam aan de &quot;BMPR-IB&quot; beeldbuis volgens de instructies van de fabrikant. Pipet het mengsel op en neer voorzichtig aan het antilichaam te verdelen. LET OP: Wij maken gebruik van een Human BMPR-IB / ALK-6 APC-geconjugeerd antilichaam tegen een 1:10 verdunning (zie de lijst van reagentia voor details). Echter, antilichamen van verschillende fabrikanten verschillende aanbevolen concentraties. </li><li> Bedek de ijsemmer op een manier die buiten houdt licht. De zonnecel / antilichaam mengsel zitten gedurende 30 minuten (of volgens de instructies van de fabrikant antilichaam). Opmerking: Als de anti-BMPR-IB antilichaam wordt geleverd als een primaire ongeconjugeerde antilichaam dat een secundair antilichaam vereist, voert een afzonderlijke stap kleuring op ijs met het secundaire antilichaam volgens instructies van de fabrikant. </li><li> Centrifugeer beide buisjes300 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant, zorg dat u de pellet niet te zuigen. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 1 ml FACS buffer. Weer Centrifugeer de buizen bij 300 g gedurende 5 min. Zorgvuldig aspireren het supernatant en resuspendeer de cellen in FACS-buffer tot een concentratie van 1 miljoen cellen per 1 ml. </li><li> Filter &quot;BMPR-IB,&quot; &quot;Ongekleurde&quot; en &quot;gesorteerde&quot; cellen door 40 micron cel zeven in nieuwe gemerkte glazen buizen FACS. Spoel de filters met 500 pi FACS-buffer zodat cellen niet achterblijven in het filter. Voeg ook 2 ml standaard medium om twee afzonderlijke plastic centrifugebuizen label &quot;BMPR-IB-positieve&quot; en &quot;BMPR-IB-negatief.&quot; Met deze twee om de gesorteerde cellen te verzamelen in de FACS machine. </li><li> Op de FACS-machine, gebruikt u de ongekleurde cellen om een ​​negatieve poort definiëren voor de fluorescente merker. </li><li> Met een 100 micron nozzle rangschikken BMPR-IB positieve en negatieve cellen in de respectievelijke buizen conTaining standaard medium. Houd deze buizen gekoeld bij 4 ° C gedurende de soort als de FACS-machine heeft dit vermogen. LET OP: Raadpleeg de JOVE artikel 13 van Sharon et al. een uitstekende protocol voor FACS-sortering. </li><li> Met behulp van een hemocytometer, tellen de cellen in elke buis. Centrifugeer de &quot;BMPR-IB-positief,&quot; &quot;BMPR-IB-negatieve,&quot; en &quot;gesorteerde&quot; buizen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C en zuig de supernatant voorzichtig de cel pellet te verstoren. resuspendeer dan de cellen in standaard medium tot een concentratie van 1 miljoen cellen per 250 pl. </li><li> Verkrijgen voorgesneden 4 mm PLGA (poly [melkzuur-co-glycolzuur]) steigers bekleed met hydroxyapatiet. Plaats elke steiger in een putje van een 24-wells plaat. Bedek elk steiger met 50 pi celsuspensie uit een van de drie groepen (i .e, 200.000 cellen.): Ongesorteerd, BMPR-IB-positieve en BMPR-IB-negatief (Figuur 3). OPMERKING: GelieveRaadpleeg de JOVE artikel 14 van Lo et al. voor meer informatie over de bouw van PLGA steigers. </li><li> Gedeeltelijk In de onmiddellijke lege putjes met standaard medium (om uitdrogen van de steigers te voorkomen), bedekken de plaat met het deksel en incubeer in een cel incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li></ol> 4. Oprichting van calvarial Gebreken en toepassing van de ACS-bevattende Steiger OPMERKING: Zorg dat adequate institutionele goedkeuringen zijn in de plaats voor de creatie van calvarial defecten in levende muizen. Dit protocol werd goedgekeurd door de Stanford University Institutional Animal Care en gebruik Comite. <ol><li> Verdoven van een CD-1 naakt muis met behulp van geïnhaleerde isofluraan gas of een geïnjecteerde langwerkende verdoving cocktail. <ol><li> Om gas alleen te gebruiken, plaatst u de muis in een verdoving kamer en start de toevoer van zuurstof bij 2-3 l / min met een concentratie van isofluraan 2%. Zodra de muis fully bewusteloos, plaats het naar voren gebogen op een warm water recirculatie deken met een absorberend kussen en plaats zijn snuit in een verdoving neuskegel met dezelfde concentratie van zuurstof en isofluraan. nauwlettend de ademhaling en pas de concentratie van isofluraan als dat nodig is. </li><li> Een geïnjecteerde langwerkende verdoving cocktail gebruik verdoven de muis in een anesthesie geplaatst zoals hierboven beschreven en injecteer het anestheticum cocktail. Verwijder de muis uit de narcose kamer en zijn gedrag observeren. OPMERKING: De muis kan kortstondig ontstaan ​​uit narcose maar binnen enkele minuten opnieuw moet volledig verdoofd onder invloed van de geïnjecteerde narcose. Breng de muis naar een warm water recirculatie deken bedekt met een absorberende pad. LET OP: Voor een anestheticum cocktail, raden wij een mengsel dat ketamine 10 mg / ml en xylazine 1 mg / ml in fysiologische zoutoplossing, intraperitoneaal afgeleverd. De standaarddosis van dit mengsel is300 ul van een 30 g muis, wat overeenkomt met 100 mg / kg en xylazine 10 mg / kg ketamine. Zie de discussie sectie voor meer informatie over de injecteerbare verdoving. </li><li> Gebruik een teen knijpen manoeuvre om de diepte van de anesthesie te bepalen. Een voldoende verdoofd muis zal zijn poot niet terug te trekken als het licht wordt geknepen door de chirurg. </li><li> Toepassen oogzalf uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. </li><li> Dien 1 mg / kg buprenorfine SR subcutaan. LET OP: Het verstrekken van pijnstilling voorafgaand aan de operatie resulteert in een superieure pijnbestrijding. </li><li> Tijdens de gehele procedure controleren de ademhaling van de muis. LET OP: - 100 ademhalingen / min Een muis goed verdoofd onder isofluraan zou een ademfrequentie van 50 hebben. Een versnelde ademhaling aangeeft dat anesthesie te licht, terwijl een verminderde ademhalingsfrequentie kunnen aangeven dat verdoving te diep. </li></ol></li><li> Prep de huid van de dorsale zijde van de schedel met povidon-IODine oplossing gevolgd door 70% ethanol driemaal. Draperen met steriele doeken, waardoor de operatieplaats blootgesteld. LET OP: Draag steriele chirurgische handschoenen en een steriele techniek te houden tijdens de procedure. Raak alleen steriele oppervlakken en voorwerpen, zoals de steriele laken en geautoclaveerd instrumenten. Heb je al een assistent belichting aanpassen, geopend hechtdraad pakketten, etc. </li><li> Met behulp van een 15-blad scalpel een sagittale middellijn incisie die zich over het grootste deel van de dorsale schedel. Met een fijn getande tang, trek de huid aan de rechterkant van de incisie naar rechts pariëtale bot bloot. </li><li> Het gebruik van een boor met een geautoclaveerd 4 mm diamantgecoate trephine boor, boor een defect door de pariëtale bot. Heeft het gebrek verleden bot niet uit te breiden naar de dura mater laag. (Figuur 4) </li><li> Plaats een steiger in het defect, en sluit de huid incisie met het runnen van nylon hechtdraad. </li><li> Bewaken van de muis en bieden standaard postoperatieve zorg eenolgens de institutionele richtlijnen. <ol><li> Houd de muis op een schone papieren handdoek in een schone kooi, terwijl het zich herstelt. De helft van de kooi moet over een warm water recirculatie deken geplaatst en de muis moeten eerst Deze helft geplaatst. </li><li> Laat een muis zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn ambulate heeft herwonnen. Heeft een muis die een operatie heeft ondergaan om een ​​kooi met andere muizen totdat deze volledig is hersteld niet meer terug. </li></ol></li><li> Herhaal de bovenstaande stappen met een nieuwe muis voor elke steiger die getest moet worden. Steriliseren chirurgische instrumenten tussen operaties met een hete kraal sterilisator of andere geschikte methode. </li><li> Kort na de procedure, en vervolgens bij 2, 4, 6 en 8 weken gebruiken micro CT scan om de snelheid van calvarial sluiten van defecte analyseren. OPMERKING: Zie het artikel van Levi et al. 6 voor een beschrijving van micro CT-scan van calvariale defecten. </li><li> Wanneer het experiment complete, euthanaseren de muizen door ze in een schone kamer euthanasie en een stroom van kooldioxidegas in de kamer met een snelheid van 2 l / min gestart. Na ademhaling volledig hebben opgehouden (na ongeveer 10 min) uit te voeren cervicale dislocatie om euthanasie te bevestigen. </li><li> Eventueel na het experiment voltooid is, gebruik snijden en histologische kleuring botvorming binnen het defect te evalueren. OPMERKING: Zie het artikel van McArdle et al. 12 voor meer informatie over de voorbereiding van het bot specimens voor histologie. Voor een overzicht van histologische en vlekken technieken, zie je een histologische handleiding, zoals het Handboek Surgical Pathology 15. </li></ol>

<ol><li>Silber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+site+morbidity+after+anterior+iliac+crest+bone+harvest+for+single-level+anterior+cervical+discectomy+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion.</a> Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).</li>
<li>Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+substitutes%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Bone substitutes: an update.</a> Injury. 36, S20-S27 (2005).</li>
<li>Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+graft+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Med+Devices%22%5BJournal%5D)">Bone graft substitutes.</a> Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).</li>
<li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+in+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology in bone tissue engineering.</a> Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).</li>
<li>Chapekar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: challenges and opportunities.</a> J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+derived+stromal+cells+heal+critical+size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects.</a> PLoS One. 5 (6), e11177(2010).</li>
<li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for regenerative medicine.</a> Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD105+protein+depletion+enhances+human+adipose-derived+stromal+cell+osteogenesis+through+reduction+of+transforming+growth+factor+beta1+%28TGF-beta1%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling.</a> J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).</li>
<li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90+%28Thy-1%29-positive+selection+enhances+osteogenic+capacity+of+human+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells.</a> Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).</li>
<li>Wozney, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+regulators+of+bone+formation%3A+molecular+clones+and+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities.</a> Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).</li>
<li>Wan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+mouse+adipose-derived+adult+stromal+cells+requires+retinoic+acid+and+bone+morphogenetic+protein+receptor+type+IB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).</li>
<li>McArdle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+for+bone+morphogenetic+protein+receptor+type-IB+promotes+differentiation+and+specification+of+human+adipose-derived+stromal+cells+toward+an+osteogenic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage.</a> Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).</li>
<li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (71), e4425(2013).</li>
<li>Lo, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+a+critical-sized+calvarial+defect+model+using+adipose-derived+stromal+cells+harvested+from+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate.</a> J Vis Exp. (68), (2012).</li>
<li>Lester, S. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLester%2C+SC+%22Manual+of+surgical+pathology%22">Manual of surgical pathology</a>. , Saunders/Elsevier. (2010).</li>
<li>Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen onthullingen te doen.

Kritische stappen in het protocol Tijdens de oogst van ASC, de kritische stap is voldoende vertering van vet met collagenase. Onvoldoende vertering leidt tot een lage opbrengst van ASC. Tijdens FACS sortering van BMPR-IB + cellen, is het belangrijk om de poort zorgvuldig definiëren positiviteit. Het definiëren poorten te los kan resulteren in gesorteerde populaties die niet zuiver zijn. Tijdens het maken van de calvarial defect, is het essentieel om het defect te boren door het bot van de sched...

Grote botdefecten als gevolg van letsel, infectie of invasieve kanker hebben een aanzienlijke invloed op het herstel en de kwaliteit van het leven van een patiënt. Technieken bestaan om deze gebreken gezond bot vulling van elders in lichaam van de patiënt, maar deze overdracht draagt zijn eigen morbiditeit en risico van complicaties 1, 2, 3. Bovendien zijn sommige gebreken zo omvangrijk of complex die voldoende donorbot beschikbaar is om het defect te vullen. Protheses zijn een mogelijke optie voor het vullen van botdefecten, maar deze zijn geassocieerd met een aantal nadelen waaronder infectierisico werkende hardware en vreemd lichaam reactie 4. Om deze redenen is er grote belangstelling voor de mogelijkheid van engineering van biologische botvervangers behulp van eigen cellen van de patiënt 5. -Vet-afgeleide stromale cellen (ASC)hebben potentieel voor deze toepassing, omdat zij overvloedig aanwezig in de eigen vetweefsel van de patiënt en ze hebben het vermogen om botdefecten te helen door het genereren van nieuw botweefsel 6, 7 getoond. ASC&#39;s zijn een diverse populatie van cellen en verscheidene studies hebben aangetoond dat het selecteren van specifieke celoppervlak markers celpopulaties met verhoogde osteogene activiteit 8, 9 kan produceren. ASC selecteren met het hoogste osteogeen potentieel zou de waarschijnlijkheid toenemen dat een scaffold bezaaid met deze cellen een grote botdefecten kan regenereren. Bone morfogenetisch eiwit (BMP) signalering is essentieel voor het reguleren van differentiatie en bot- vorming 10 en het BMP receptor type IB (BMPR-IB) is bekend belangrijk voor osteogenese in ASCs 11 zijn. Onlangs hebben we aangetoond dat expressie van BMPR-IB kan be gebruikt om te selecteren voor het ASC met verhoogde osteogene activiteit 12. Hier laten we een protocol voor de isolatie van BMPR-IB tot expressie ASC&#39;s uit menselijk vet, gevolgd door een analyse van hun osteogene activiteit met een in vivo model calvarial defect.

<table><tbody><tr><td>100 micron celzeef</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 mes scalpel</td><td>Miltex</td><td>4-515</td><td></td></tr><tr><td>24 wellsplaat</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>40 micron celzeef</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konische centrifugeerbuisjes</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Ethilon nylon hechtdraad, 18", P-3 naald,&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1698G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BMPR-IB primaire antilichaam</td><td>R&amp;D systems</td><td>FAB5051A</td><td></td></tr><tr><td>BioGel PI chirurgische handschoenen</td><td>M&ouml;lnlycke Health Care</td><td>ALA42675Z</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine SR</td><td>ZooPharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castro-Viejo naaldhouder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>CD1 naakte muis</td><td>Charles River</td><td>086</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase Type II poeder</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-medium</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td></td></tr><tr><td>Boor: Circulaire mes 4,0 mm</td><td>Xemax Surgical</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>Boor: Z500 Brushless Micromotor</td><td>NSK</td><td>NSKZ500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gicbo</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand absorberende onderlaag, 20" x 24"</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand steriele katoengaas, 4" x 4"</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingspad</td><td>Kent Scientific</td><td>DCT-20</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 199/EBSS-medium</td><td>GE&nbsp; Life Sciences</td><td>SH30253.01</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia isofluraand</td><td>Henry Schein&nbsp;</td><td>050033</td><td></td></tr><tr><td>Microtang met tanden</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Microtang met tanden</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine film (Parafilm)</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PLGA-scaffolds</td><td>Proprietary Formulation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188, 10%</td><td>Sigma</td><td>P5556-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Polylined steriele werkveld, 18" x 24"</td><td>Busse Hospital Disposables</td><td>696</td><td>Snij een rechthoekig gat van de juiste grootte</td></tr><tr><td>Polysucrose-oplossing: Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-jood voorbereidingsoplossing</td><td>Medline</td><td>MDS093944H</td><td></td></tr><tr><td>Puralube vaseline oogzalf, 1/8 oz. tube</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RBC-lysebuffer</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Webcol alcohol prepoepstukjes</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid isolatie van bmpr-ib + adipose-afgeleide stromacellen voor gebruik in een calvarial defect healing model

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Invasieve kankers, ernstige verwondingen en infecties kunnen botdefecten veroorzaken die te groot zijn om te worden gereconstrueerd met bestaand bot uit het eigen lichaam van de patiënt. De mogelijkheid om bot de novo te laten groeien met behulp van de eigen cellen van een patiënt, zou het mogelijk maken om botdefecten te vullen met adequaat weefsel zonder de morbiditeit van het oogsten van eigen bot. Er is interesse in het gebruik van vetafgeleide stromale cellen (ASC's) als bron voor weefsel engineering omdat deze worden verkregen uit een overvloedige bron: het eigen vetweefsel van de patiënt. Echter, ASC's zijn een heterogene populatie en sommige subpopulaties kunnen effectiever zijn in deze toepassing dan andere. Isolatie van de meest osteogene populatie van ASC's zou de efficiëntie en effectiviteit van een bot engineering proces kunnen verbeteren. In dit protocol worden ASC's verkregen uit subcutaan vetweefsel van een menselijke donor. De subpopulatie van ASC's die de marker BMPR-IB tot expressie brengt, wordt geïsoleerd met behulp van FACS. Deze cellen worden vervolgens toegepast op een in vivo calvarial defect genezingstest en het wordt gevonden dat ze een verbeterd osteogeen regeneratief potentieel hebben in vergelijking met ongesorteerd cellen.

Micro CT scan uitgevoerd op de dag van de operatie zal duidelijk de schedel defect. Op dit moment is er geen ingroei in de 4 mm defect. Latere scans worden verkregen in de tijd om de grootte van het defect kwantificeren in tijd ten opzichte van de basislijn. Defecten geënt met BMPR-IB + cellen moeten aantonen snellere sluiting van het defect vergelijking met BMPR-IB en gesorteerde cellen (Figuur 5). Bovendien kan het deel van de schedel dat het defect wordt ontkalkt en v...

Adipositas-afgeleide stromale cellen kunnen nuttig zijn voor het ontwerpen van nieuw weefsel uit de eigen cellen van een patiënt. We presenteren een protocol voor de isolatie van een subpopulatie van humane adipositas-afgeleide stromale cellen (ASC's) met een verhoogd osteogeen potentieel, gevolgd door toepassing van de cellen in een in vivo calvariaal genezingsassay.

Rapid Isolatie van BMPR-IB + Adipose-afgeleide stromacellen voor gebruik in een calvarial Defect Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Het algemene doel van dit protocol is het isoleren van specifieke celpopulaties van uit vetweefsel afgeleide stromale cellen en het testen van hun osteogene activiteit met behulp van een in vivo assay. De methode kan worden gebruikt om belangrijke vragen in het vakgebied van de craniofaciale regeneratieve biologie te beantwoorden, zoals de wijze waarop uit vetweefsel afgeleide stamcellen kunnen worden ingezet voor het creëren van volledig functioneel botweefsel in beschadigde botdefecten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de cellen snel uit vers menselijk weefsel worden geïsoleerd; op deze manier wordt voorkomen dat de cellen tijd doorbrengen in een celcultuur, waarvan bekend is dat het de expressie van genen en celoppervlaktemarkers beïnvloedt.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot patiënten met grote botdefecten, veroorzaakt door kanker, trauma of infectie. In de toekomst zou het mogelijk zijn om celpopulaties van ASC's te isoleren en deze regeneratief in te zetten. Een visuele demonstratie van deze techniek is cruciaal, aangezien het aanmaken van het calvariale defect moeilijk te leren is, voornamelijk omdat het defect wordt gemaakt in een gewelfde schedel en zeer dicht bij de dura mater ligt.Verzamel voor dit protocol subcutaan vet uit de buik, flank of dij van een gezonde menselijke donor en bewaar dit in een plastic zuigcanister. Voeg een gelijk volume steriele PBS toe aan het vet en meng dit gedurende 30 seconden door voorzichtig te schudden. Laat de waterige laag bezinken en verwijder deze vervolgens met een plastic pipet van 10 milliliter.Giet vervolgens het vet af in een grote plastic container en voeg een gelijk volume van het digestiemengsel toe. Reinig de verzegelde vetcontainer met 70% ethanol en verzegel deze met paraffine. Schud de container vervolgens 30 minuten lang bij 180 omwentelingen per minuut in een incubator van 37 °C.Neutraliseer vervolgens de digestie door het reactievolume te verdubbelen met standaard medium. Centrifugeer de cellen, verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer elk pellet in 5 milliliters standaard medium. Breng daarna alle suspensies door een 100 micron filter in een 50 milliliter conisch buisje.Centrifugeer het filtraat bij 4 °C gedurende 15 minuten bij 300 G. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 mL RBC-lysebuffer op kamertemperatuur. Laat het mengsel, zodra het gesuspendeerd is, gedurende vijf minuten lyseren bij kamertemperatuur. Centrifugeer de buis vervolgens bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en voltooi de scheidingsstappen volgens het tekstprotocol.Correcte cel sortering is essentieel voor dit protocol. Resuspendeer de cellen eerst in FACS-buffer tegen een concentratie van one million cellen per 100 microliters en bewaar deze op ijs. Breng vervolgens ten minste 10 million cellen over naar een plastic centrifugebuis op ijs, gelabeld als BMPR-1B.Breng één miljoen cellen over naar een op ijs geplaatste buis met het label ongestuifd en voeg één milliliter FACS-buffer toe. Label de overige cellen als ongesorteerd. Voeg vervolgens het antilichaam toe aan de BMPR-1B-buis en meng deze door voorzichtig te pipetteren.Laat dit mengsel incuberen gedurende de door de fabrikant aanbevolen tijd. Centrifugeer vervolgens de cellen voor FACS-sortering en resuspendeer ze voorzichtig in één milliliter FACS-buffer. Herhaal dit vervolgens en resuspendeer de cellen op een concentratie van één miljoen cellen per milliliter.Breng nu alle drie de celpopulaties door 40 micron celzeven in glazen FACS-buisjes. Gebruik 500 microliters FACS-buffer om de laatste cellen van de filters te spoelen. Bereid vervolgens twee opvangbuisjes voor, één voor de antilichaam-positieve en één voor de antilichaam-negatieve populaties.Vul elke buis met twee milliliters standaard celkweekmedium. Analyseer bij de FACS-machine eerst de ongesteinde cellen en gebruik de resultaten om een negatieve gate voor de fluorescente marker te definiëren. Sorteer vervolgens, met gebruik van een nozzle van 100 micron, de gekleurde cellen in de respectievelijke buizen met standaard medium. Houd deze buizen, indien mogelijk, tijdens het sorteren gekoeld op vier graden Celsius.Ga verder door de cellen in het scaffold te laden zoals beschreven in het tekstprotocol. Nadat het dier is genarceerd, knipt u het haar van de operatieruimte en schrobt u de blootgestelde huid drie keer met povidonjodiumoplossing, gevolgd door 70% ethanol. Dek vervolgens het dier af met een steriele doek, waarbij de operatieruimte bloot blijft.Maak nu met een scalpelsmes nr. 15 een sagittale middenincisie die over het grootste deel van de dorsale schedel loopt. Trek vervolgens met fijntandige pincetten de huid aan de rechterkant van de incisie terug om het rechter pariëtaalbeen bloot te leggen. Stel de boor in met een geautoclaveerde, vier millimeter diamantgecoate trepanboorkop.Boor vervolgens een defect door het pariëtale bot, maar breid het defect niet verder uit dan het bot; laat de laag van de dura mater ongemoeid. Plaats nu een scaffold met cellen of controle-oplossing in het defect en sluit de huidincisie met een doorlopende nylon hechting. Ga daarna verder met de postoperatieve verzorgingsprotocollen voor muizen zoals beschreven in het tekstprotocol.Micro-CT-scans van het schedeldefect, uitgevoerd op de dag van de operatie, tonen het nieuwe defect duidelijk aan. Herhaalde scans op latere tijdstippen laten zien dat defecten waarin BMPR-1B-positieve cellen zijn gezaaid, sneller sluiten dan defecten met BMPR-1B-negatieve of ongesorteerde cellen. Wanneer de genezing wordt gekwantificeerd als een percentage van de volledige wondsluiting, is het verschil duidelijk waarneembaar.Vervolgens werden delen van de schedels die de defecten bevatten gedecalcificeerd en gekleurd om nieuw en ongecontroleerd botregeneraat te identificeren met behulp van Movat's pentachroom, waarmee kraakbeen van bot en alle tussenliggende rijpingsstadia kan worden onderscheiden. Vergeleken met ongesorteerde cellen hadden BMPR-1B-positieve cellen een sterke impact op het regeneratieve proces, het meest opvallend langs de randen van het defect. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het klinische potentieel van dit experiment bij het isoleren van patiëntspecifieke ASC's en het gebruik ervan voor het genezen van botdefecten.Vanuit deze methode kunnen veel vervolgexperimenten worden afgeleid om nog meer vragen over botgenezing te beantwoorden, zoals FACS voor de isolatie van ASC's met verschillende lineage-commitments, micro-CT om te analyseren hoe verschillende celtypen en weefsels in de loop van de tijd genezen, en het model van het schedeldefect in dit experiment om nieuwe ideeën op te doen voor verdere experimenten naar botgenezing. Vergeet niet dat werken met menselijk weefsel uiterst gevaarlijk kan zijn. Zorg ervoor dat u de juiste voorzorgsmaatregelen neemt, waaronder het dragen van handschoenen, het gebruik van oogbescherming en het op de juiste wijze afvoeren van alle gevaarlijke afvalstoffen.

rapid-isolation-bmpr-ib-adipose-derived-stromal-cells-for-use

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Menselijke perivasculaire stamcellen (PSC's) zijn een nieuwe stamcel klasse voor het skelet weefselregeneratie vergelijkbaar met mesenchymale stamcellen (MSC's). PSC's kunnen worden geïsoleerd door FACS (fluorescentie geactiveerde cel sortering) uit vetweefsel verkregen tijdens standaard liposuctie procedures, dan gecombineerd met een osteoinductief steiger om botvorming te...

Gebruik van de Mens Perivasculaire stamcellen voor botregeneratie

Dit protocol beschrijft de isolatie van vet-afgeleide stromale cellen van lipoaspirate en de oprichting van een 4 mm kritische grootte calvarial defect aan het skelet regeneratie te evalueren.

Reparatie van een kritische grootte Calvarial Defect Model Met behulp van Adipose-afgeleide stromale cellen geoogst uit Lipoaspirate

Bloedvaten in de menselijke skeletspier haven diverse multi-lineage voorloper populaties die ideaal is voor regeneratieve toepassingen zijn. Deze isolatie methode maakt gelijktijdige zuivering van drie multipotente precursor celpopulaties respectievelijk uit drie structurele lagen van de bloedvaten: myogene endotheelcellen van de intima, pericytes van media en adventitia cellen van adventitia.

Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle

De transcriptionele heterogeniteit binnen humane adipogeen-afgeleide stromale cellen kan op enkelcellig niveau worden gedefinieerd met behulp van celoppervlaktemarkers en osteogene genen. We beschrijven een protocol dat flowcytometrie gebruikt voor de isolatie van celsubpopulaties met verhoogd osteogeen potentieel, die kunnen worden gebruikt om craniofaciale skeletreconstructie te verbeteren.

Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren bloedvat vorming in vivo en in real-time in 3D steigers door multiphoton microscopie. Angiogenese in genetisch gemodificeerde steigers werd bestudeerd in een lymfkliertest calvarial kritische bot defect model. Meer nieuwe bloedvaten werden ontdekt in de behandelde groep dan in besturingselementen.

Visualiseren van angiogenese door Multiphoton microscopie In Vivo in genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor Calvarial kritische bot Defect reparatie

Wij presenteren een protocol voor vetweefsel afgeleide microvasculaire brokken belovend vascularisatie eenheden vertegenwoordigen isoleren. Ze kunnen snel worden geïsoleerd, vereisen geen in vitro verwerking en kunnen aldus worden gebruikt voor één-stap prevascularization op verschillende gebieden van weefselengineering.

Isolatie Murine vetweefsel afgeleide microvasculaire fragmenten als Vascularisatie eenheden voor Tissue Engineering

Wij stellen voor een cel expansie protocol betreffende macroporeuze microcarriers en hun gebruik als levering systeem in een bioreactor perfusie om het zonebeheer van een matrix decellularized weefsel. Wij omvatten ook verschillende technieken om te bepalen van celproliferatie en levensvatbaarheid van cellen gekweekt op microcarriers. Bovendien tonen we functionaliteit van cellen na bioreactor culturen.

Recombinante collageen ik Peptide Microcarriers voor cel expansie en hun mogelijke toepassing als cel levering systeem in een Bioreactor Model

Het aantal nieuwe biomaterialen ontworpen voor het herstellen van grote bot laesies groeit voortdurend met als doel het verbeteren bot genezing en het overwinnen van de complicaties geassocieerd met bot transplantatie. Hier presenteren we een multidisciplinaire strategie voor preklinische biocompatibiliteit testen van biomaterialen voor bot reparatie.

Biologische verenigbaarheid profiel op biomaterialen voor bot regeneratie

Dit artikel presenteert een methode die volledige beenmergaanhechting en flowcytometriesortering combineert voor het isoleren, cultiveren, sorteren en identificeren van beenmerg mesenchymale stamcellen uit rattenkaken.

Isolatie en teelt van mandibulaire beenmerg mesenchymale stamcellen bij ratten

Mesenchymale stamcellen uit het beenmerg van de kaak hebben belangrijke functies bij diverse differentiatie, zelfvernieuwing en immuunmodulatie. Ze zijn naar voren gekomen als een cruciaal reservoir van voorlopercellen in gentherapie, weefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde. Hier presenteren we een unieke methode voor het isoleren van mesenchymale stamcellen van kaakbeenmerg bij ratten.

Techniek voor isolatie en kweek van mesenchymale stamcellen van rattenkaakbeenmerg

De isolatie van BAMBIhogeMFGE8hoge MSC's, een van de drie belangrijkste subgroepen die heterogene menselijke UC-MSC's vormen, is nuttig voor een volledig begrip van de kenmerken en functies van dit subtype voor de toekomstige toepassing ervan om de klinische werkzaamheid bij specifieke ziekten te verbeteren. Hier presenteren we een methode voor het sorteren van BAMBIhogeMFGE8hoge UC-MSC's.

Isolatie van menselijke BAMBIhogeMFGE8hoge navelstreng-afgeleide mesenchymale stromale cellen

Leer de isolatie van BMPR-IB+ adipose-afgeleide stromacellen voor regeneratieve geneeskunde. Deze methode test osteogene activiteit in vivo in een calvariaal defectmodel voor craniofaciale biologie.

Rapid Isolatie van BMPR-IB + Adipose-afgeleide stromacellen voor gebruik in een calvarial Defect Healing Model

Meer video's verkennen