Genoom-brede analyse van zoogdieren Replication Timing door DNA Content Measurement

Het algemene doel van deze procedure is het in kaart brengen van het genoombrede replicatietijdprogramma van een gekozen cel. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de replicatie, zoals de wijze waarop het genomische replicatieprogramma verandert bij gezondheid en ziekte.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snelle en eenvoudige manier is om de replicatietiming in diverse cellen en condities in kaart te brengen. De persoon die de FACS-procedure beschrijft is Dan Lehmann, een FACS-expert aan de Faculteit Geneeskunde. Deze procedure begint gewoonlijk met ten minste één tot twee keer 10⁶ snelgroeiende, niet-gesynchroniseerde cellen.

Zuig voor adherente cellen het medium af en was elke plaat met drie milliliters PBS zonder calcium of magnesium. Verwijder de PBS en voeg één milliliter commerciële Trypsin-EDTA toe aan elke plaat. Incubeer de cellen vijf minuten lang bij 37 °C, totdat ze loslaten.

Voeg drie milliliters kweekmedium toe om de Trypsine te neutraliseren en verzamel de cellen in een 15 milliliter conische buis of een vijf milliliter polystyreen buis. Bewaar de cellen op ijs. Om met deze procedure te beginnen, centrifugeer de cellen bij 300 x G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.

Aspireer en was de cellen met één milliliter koud PBS. Centrifugeer vervolgens de cellen. Verwijder na de tweede wasbeurt het PBS en resuspendeer de cellen in 250 microliters koud PBS.

Voeg terwijl u de buis voorzichtig vortexet langzaam druppelsgewijs 800 µL van -20 °C, 100% ethanol van hoge zuiverheid toe. Dit leidt tot onze uiteindelijke ethanolconcentratie van 70 tot 80%. Incubeer de cellen 30 minuten op ijs.

Begin deze procedure door de gefixeerde cellen tien minuten lang te centrifugeren bij 500 x G bij 4 °C. Aspireer het supernatant voorzichtig en was de cellen twee keer met één milliliter koude PBS. Centrifugeer na elke wasbeurt.

Zuig na de tweede wasbeurt het supernatant af en resuspendeer elke cel met het volgende PI-mengsel. Eén milliliter PBS met vijf microliter RNAase van tien milligram per milliliter, en 50 microliter propidiumjodide van één milligram per milliliter. Filtreer het monster door een 35 micrometer mesh in een polystyreen buis van 5 milliliter.

Sluit de buis af met parafilm. Incubeer gedurende 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Bewaar de monsters in het donker, aangezien propidiumjodide lichtgevoelig is.

De cellen worden gesorteerd met een FACS-apparaat. Gebruik de 561 nanometer laser om cellen te differentiëren op basis van hun propidiumjodide-intensiteit. Gebruik voor optimale resultaten de kleinste nozzle die wordt aanbevolen voor de specifieke celgrootte.

Voor de meeste cellen is dit 85 micrometers. Gebruik een gestage, langzame flow. Meestal tot 300 tot 500 events per seconde.

Gebruik gating om dode cellen en subcellulair debris te onderscheiden door FCS tegenover SSC uit te zetten. Selecteer uit de levensvatbare cellen de doubletten door SSC-breedte tegenover SSC-hoogte uit te zetten, gevolgd door een plot van FFC-breedte tegenover FFC-hoogte en een plot van propidiumjodide-breedte tegenover propidiumjodide-hoogte. Maak voor de levensvatbare signaalcellen een histogram van de propidiumjodide-oppervlakte-intensiteit, wat de DNA-inhoud van de cellen vertegenwoordigt.

Sorteer cellen onder koude omstandigheden in G1- en S-fasen. De gating voor S moet breed zijn en in de G1- en G2-fasen overlappen. De gating voor G1 moet daarentegen nauw zijn en zo ver mogelijk van S afliggen.

Voor sommige celtypen kan het lastig zijn om een goede celcyclusdistributie te verkrijgen. Het is van cruciaal belang om de G1-fase te isoleren zonder S-fase-cellen. Verwijder de buisjes met gesorteerde cellen uit de faxmachine.

Houd de buisjes na de sortering op ijs. Na de cel sortering wordt het DNA van elk monster gezuiverd met een commerciële DNA-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant. Scheer vervolgens het DNA met een gefocuste ultrasonicator tot een gemiddelde streefpiekgrootte van 250 base pairs.

Verifieer de grootte van het gefragmenteerde DNA via elektroforese. De aanbevolen grootteverdeling is 200 tot 700 basenparen met een piek rond de 250 basenparen. Vervolgens wordt de library klaargemaakt, gesequenced en geanalyseerd zoals beschreven in het tekstprotocol.

Een replicatietijdkaart voor het gehele chromosoom één van embryonale fibroblasten van de muis wordt getoond. Hierbij wordt ingezoomd op een regio van ongeveer 50 megabasen. De stippen vertegenwoordigen de genormaliseerde S/G1-ratio voor individuele vensters, en de doorlopende lijn vertegenwoordigt de resultaten van de kubische vloeiende interpolatie.

Hoge S/G1-waarden komen overeen met vroege replicatie, terwijl lage waarden overeenkomen met late replicatie. De rode pijlen wijzen naar voorbeelden van regio's met een constante replicatietijd, en de groene pijlen wijzen naar temporele transitiegebieden. Deze figuur toont de reproduceerbaarheid van replicatietijdkaarten tussen triplicaten van embryonale fibroblasten van muizen, vergeleken met triplicaten van pre-B-cellen van muizen in dezelfde regio van 18 megabasen op muizenchromosoom één.

De oranje pijlen wijzen naar voorbeelden van differentiële regio's tussen de cellijnen. Een heat map van de Spearman-correlaties tussen de zes monsters bevestigt de resultaten verder. Eenmaal beheerst, kan deze techniek, van het verzamelen van cellen tot het genereren van kaarten, in één week worden voltooid indien correct uitgevoerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u genomische replicatietijdkaarten kunt genereren voor groeiende cellen.