Induceerbaar T7 RNA Polymerase-gemedieerde Multigene Expression System, pMGX

Het algemene doel van deze procedure is het construeren van synthetische multigene operons onder controle van een induceerbare T7 RNA-polymerase voor de gelijktijdige expressie van meerdere eiwitten. Deze methode kan onderzoekers in de synthetische biologie en biochemie helpen bij het bouwen van multi-eiwitpaden of het bestuderen van eiwitcomplexen die afhankelijk zijn van co-expressie via meerdere benaderingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om meerdere genen gelijktijdig in Escherichia coli tot expressie te brengen vanuit een enkel plasmide.

De procedure uit mijn laboratorium zal worden gedemonstreerd door Mohamed Hassan, een PhD-student, en Angela Thompson, een Co-op-student. Nadat de genen van belang volgens het tekstprotocol zijn verkregen en geamplificeerd, bereidt u de digestiereacties voor het eerste gen van belang en de pMGX-factor. Gebruik hiervoor een reactie van 40 µL met 0,5 tot 1,5 µg DNA in het indel-enzym.

Incubeer de reacties gedurende één uur bij 37 °C. Voeg vervolgens EcoRI toe en laat de digestie nog een uur doorgaan. NdeI wordt vóór EcoRI toegevoegd om te garanderen dat het effectief divergeert.

NdeI is gevoelig voor de lengte van het dubbelstrengs DNA aan weerszijden van de restrictieplaats. Door het eerst toe te voegen, wordt gewaarborgd dat het het volledige circulaire plasmide knipt. Laad de digestiereacties op een 0,7% agarosegel en voer elektroforese uit op de monsters bij 100 volt gedurende 55 minuten.

Snij vervolgens met een schoon scalpel of scheermesje de insert- en vectorbanden uit en plaats de uitgesneden gelsegmenten in 1,5 milliliter buisjes. Gebruik een gel-extractiekit volgens het tekstprotocol om het DNA te zuiveren. Stel een ligatiereactie van 20 microliter samen met 0,15 tot 0,5 micrograms vector-DNA, een passende hoeveelheid insert afhankelijk van de grootte van het gen en één microliter T4 DNA ligase.

Ontdooi onder aseptische omstandigheden 100 µL aliquots van chemisch competente XL1-Blue E.coli cellen gedurende vijf minuten op ijs. Voeg vervolgens vijf µL van de ligatiereacties met het gen van belang toe aan de cellen. Incubeer de transformaties gedurende 30 minuten op ijs.

Hitte-shock daarna de cellen gedurende 45 seconden in een waterbad van 42 °C. Plaats vervolgens de transformaties op ijs en voeg 200 µL koud LB-medium toe. Laat de cellen twee minuten incuberen.

Incubeer de cellen bij 37 °C bij 220 rotaties per minuut gedurende één uur en verspreid 100 µL op LB-agarplaten die een passende selecteerbare marker bevatten. Om de kolonies te screenen op mogelijke transformanten, vergelijkt u het aantal kolonies op de negatieve controle met dat op de ligatieplaten. Een verhouding in het aantal kolonies van één op twee is gewenst.

Selecteer vier tot acht individuele kolonies van elke ligatiereactie om 4 milliliters LB met het juiste antibioticum te inoculeren. Incubeer de culturen gedurende de nacht bij 37 degree Celsius en 220 rotations per minute. Purificeer het plasmide-DNA met de plasmide-DNA-isolatiekit volgens het tekstprotocol en stel digestiereacties van 20 microliter op met 150 tot 500 nanograms DNA, gebruikmakend van telkens één microliter NdeI en EcoRI.

Incubeer de digestiereacties twee uur lang bij 37 °C. Om gen twee in de pMGX-vector die gen één bevat te ankeren, stelt u een digestiereactie van 40 µL samen met 0,5 tot 1,5 µg vector-DNA dat het eerste gen van belang bevat en 1 µL AVR2. Incubeer de reactie 1,5 uur bij 37 °C voordat u 1,5 µL kalf-darmfosfatase toevoegt.

Incubeer nogmaals 30 minuten. Stel vervolgens een digestiereactie van 40 µL op met 0,5 tot 1,5 µg van de pMGX-vector die het tweede gen van belang bevat. Gebruik hiervoor 1 µL AVR2 en xpol.

Incubeer de reactie gedurende twee uur bij 37 °C. Voer elektroforese uit van de restrictiefragmenten op een 0,7% agarosegel. Gebruik vervolgens een schoon scalpel om de banden van het insert en de vector uit te snijden, zoals eerder gedemonstreerd.

Nadat het plasmid-DNA is geëxtraheerd en de monsters volgens het tekstprotocol zijn gekwantificeerd, wordt een ligatiereactie opgezet met een insert-vectorratio van 3:1 van gen 2 en pMGX-yfg1. Voeg een negatieve controle toe met enkel pMGX-yfg1. Transformeer vijf µL van elke reactie in XL1-Blue cellen, zoals eerder gedemonstreerd.

Vergelijk vervolgens het aantal kolonies op de negatieve controleplaat en de ligatieplaten. Als er een groot aantal kolonies op de negatieve controleplaat aanwezig is, dien dan de CIP-behandeling te herzien. Selecteer vier tot acht individuele kolonies van de ligatiereactie en gebruik elke kolonie om 4 µL LB met het juiste antibioticum te inoculeren.

Kweek gedurende de nacht bij 37 graden Celsius en 220 omwentelingen per minuut. Nadat het plasmide-DNA zoals eerder beschreven is geïsoleerd en gekwantificeerd, wordt gecontroleerd op effectieve insertie van het tweede gen door een digestiereactie op te zetten met 150 tot 500 nanogram DNA en één microliter EcoRI. Incubeer de reacties gedurende twee uur bij 37 graden Celsius.

EcoRI wordt aanbevolen voor screeningsdoeleinden, maar in sommige gevallen kan EcoRI twee of meer inserten genereren die qua grootte vergelijkbaar zijn, waardoor ze op een gel moeilijk te onderscheiden zijn. Om succes te garanderen, dient een alternatief restrictie-enzym zoals NdeI te worden gebruikt. Scheid de digestiereacties op een agarosegel en zoek naar een band die overeenkomt met de grootte van het geïnserteerde gen 2.

Kloon aanvullende genen in het plasmide volgens het tekstprotocol. Om het polycistronische plasmide te genereren, werden de vijf genen eerst gekloond in een geschikt plasmide, pMGX A. Deze figuur toont pCR-Blunt-yfg1 en pCR-Blunt-yfg2 in het pMGX A-plasmide, evenals pMGX A gedigesteerd met indel en EcoRI. Om de eerste twee genen in pMGX A te klonen, werd het plasmide gedigesteerd met indel en EcoRI.

Na het kloneren werden pMGX-yfg1 en pMGX-yfg2 gedigesteerd met AVR2 en xpol om te bevestigen dat er succesvolle klonen waren verkregen. Deze figuur toont de pMGXyfg1-vector gedigesteerd met AVR2 en de pMGX-yfg2-vector gedigesteerd met AVR2 en xpol om het tweede gen van interesse te isoleren. Het resulterende insert werd gekloneerd in pMGX-yfg1 om de pMGX-yfg1 twee-vector te creëren.

Zoals hier te zien is, bevestigde digestie van pMGX-yfg1 twee met EcoRI de succesvolle klonering van gen van interesse nummer twee in pMGX-yfg1. Deze gelafbeelding demonstreert het verschil tussen gedigesteerde plasmiden die het insert in de juiste oriëntatie hadden of in een omgekeerde oriëntatie. Een insert in de omgekeerde oriëntatie zou twee EcoRI-sites in nauwe nabijheid hebben, waardoor de resulterende gedigesteerde fragmenten van 50 baseparen ondetecteerbaar op de gel zouden zijn en de backbone groter zou zijn.

Ten slotte, na het genereren van een polycistronische expressievector met vijf genen, bevestigt een western blot van de tot expressie gekomen eiwitten dat alle vijf de eiwitten vanuit een enkele vector zijn tot expressie gebracht. Let erop dat het eiwit dat door yfg5 wordt geproduceerd dezelfde grootte heeft als yfg1 en niet wordt gescheiden op de gel. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie of vier dagen worden voltooid voor elk gen dat correct in de pMGX-backbone is ingevoegd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken de vector te behandelen en te lineariseren met een fosfatase, zoals kalfdarmfosfatase, om de vector te defosforyleren. Na deze procedure kunnen verdere experimenten, zoals in vivo multigen-expressie, worden uitgevoerd om biosynthetische routes voor de productie van natuurproducten te karakteriseren en te benutten, of om eiwit-eiwitcomplexen te bestuderen. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de synthetische biologie om complexe koolhydraten en genetisch gemodificeerde E.Coli te produceren.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het multigene expressiesysteem in E.coli kunt implementeren.