Name: Induceerbaar T7 RNA Polymerase-gemedieerde Multigene Expression System, pMGX (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Leer het pMGX-systeem voor multigenexpressie met induceerbare T7 RNA-polymerase in Escherichia coli. Deze methode maakt gelijktijdige expressie van meerdere eiwitten mogelijk voor synthetische biologie en eiwitcomplexonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Raad voor Natuurwetenschappen en Engineering van Canada.

1. Het verkrijgen van genen van belangstelling <ol><li> Ontwerp synthetische genen. <ol><li> Optimaliseer een gensequentie voor E. coli expressie. </li><li> Verwijder eventuele problematische restrictieplaatsen uit de sequentie (AvrII, Ndel, EcoRI en XbaI). </li><li> Inclusief beperkingsplaatsen voor klonen; Een 5&#39;-NdeI-plaats en een 3&#39;-EcoRI-plaats worden aanbevolen. Andere plaatsen kunnen eventueel gebruikt worden; Verwijzen naar het multicloninggebied van het geselecteerde plasmide ( Figuur S1- S4 ). Indien gewenst, voeg een 5 &#39;of 3&#39; coderingscode in voor Western blot detectie. </li><li> Commercieel bestel het ontworpen gen. </li><li> Ofwel klont het gen in een stompe vector met een stompe kloneringsset, volgens de instructies van de fabrikant; Ontwerp primers om het gen te amplificeren (ga dan verder met stap 1.2.2); Of voeg extra 5&#39;- en 3&#39;-uiteinden toe voor directe klonen in een pMGX-plasmide en ga verder naar stap 2. Hier, thE representatieve resultaten zijn van stompe cloning van de genen van belang. </li></ol></li><li> Versterk het gewenste gen (uit een ontworpen en geoptimaliseerd synthetisch gen of uit sjabloon DNA dat het gewenste gen bevat) 15 . <ol><li> Ontwerp primers met restrictieplaatsen voor klonen; Een 5&#39;-NdeI-plaats en een 3&#39;-EcoRI-plaats worden aanbevolen. Andere plaatsen kunnen eventueel gebruikt worden; Verwijzen naar het multicloninggebied van het geselecteerde plasmide ( Figuur S1- S4 ). Voeg desgewenst een 5 &#39;of 3&#39; coderingscode toe voor Western blot detectie. </li><li> PCR amplificeer het gewenste gen 15 . </li><li> Analyseer de PCR met agarosegel-elektroforese 16 . </li><li> Als er geen specifieke amplificatie is, reinig het geamplificeerde gen door gel-extractie. Zo niet, gebruik een schoonmaakpakket voor enzymen. </li><li> Kwantificeer het DNA met behulp van een spectrofotometer door de absorptie te controlerenE bij 260 nm; Leeg met elutiebuffer 17 . </li></ol></li></ol> 2. Klonen van geïnteresseerden in een multigene expressiesysteem Vector, pMGX 18 <ol><li> Beperking verteert het verkregen gen van belang en de gewenste vector, pMGX, met Ndel en EcoRI. OPMERKING: Als een grote hoeveelheid recircularized plasmiden verkregen worden, laat de Ndel-reactie toe gedurende 1 uur voordat EcoRI wordt toegevoegd. <ol><li> Gebruik een 40 μL digest reactie die 0,5-1,5 μg DNA en 1 μl van elk enzym bevat met 4 μl van de geschikte 10x buffer. </li><li> Voor een NdeI- en EcoRI-digestie, gebruik EcoRI-buffer en voeg eerst NdeI-endonuclease toe. Verteer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Voeg dan EcoRI endonuclease toe, en laat het verteren doorgaan voor een extra uur. NdeI is gevoelig voor splitsingen dicht bij het einde van DNA, dus de eerste vertering door EcoRI kan effectieve vertering door NdeI voorkomen. </li></ol></li><li> electrOphorese de restrictie verteren op agarosegel (voor een 1 kb gen, gebruik een 0,7% agarosegel bij 110 V gedurende 55 minuten; selecteer het percentage agarosegel voor verschillende gengroottes, zie verwijzing 16 . </li><li> Accijnsinzet en vectorbanden met een schoon scalpel of scheermesje en plaats het gesneden gelegment in een 1,5 ml buis. </li><li> Extract DNA uit de agarosegel met behulp van een gel-extractie kit volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Lig het gen van belang in de pMGX vector met behulp van een 3: 1 insert-to-vector ratio; Opzetten van een negatieve ligatie van verteerde pMGX zonder de insert. <ol><li> Stel een 20 μl ligeringsreactie op die 1 μl T4 DNA-ligase bevat, 0,15-0,5 μg vector DNA (~ 5 μl) en een geschikte hoeveelheid insert gebaseerd op een 3: 1 insert-to-vector verhouding en de grootte van Het gen wordt ingevoegd; De pMGX backbones zijn tussen 5,312 en 5,504 bp in grootte. Inclusief een negatieve controle reactie die alles bu bevatHet gen wordt ingebracht. Zorg ervoor dat de hoeveelheid vector DNA equivalent is in de negatieve controle ligatie en de vector plus insert ligatie reacties. </li></ol></li><li> Transformeer ligatie reacties in XL1-Blauwe chemisch bevoegde E. coli cellen en geligeerde plasmiden pMGX- yfg1 (bevattende gen van belang 1), pMGX- yfg2 (bevattende gen van belang 2) ... pMGX- yfgn (bevattende gen van belang n). Gebruik aseptische techniek (in een bioveiligheidskast of onder een vlam). <ol><li> Gooi 100 μl alikvoten van chemisch bevoegde XL1-Blue E. coli op ijs gedurende 5 minuten en voeg vervolgens 5 μl van de ligatie-reacties toe. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs. </li><li> Verwarm de cellen gedurende 45 seconden in een waterbad dat bij 42 ° C wordt gehouden en voeg vervolgens 200 μL koud LB toe. Incubeer ze gedurende 2 minuten op ijs. </li><li> Schud de cellen bij 37 ° C, 220 rpm gedurende 1 uur en verspreid vervolgens plaat 100 μL op een LB-agarplaat die een passendePriate selecteerbare marker (ofwel ampicilline of kanamycine). </li></ol></li><li> Scherm de klonen voor positieve transformanten. <ol><li> Vergelijk de kolonietellingen op de negatieve controle- en ligatieplaten. Een kolonietellingverhouding groter dan 1: 2 is gewenst. Als er een groot aantal kolonies op het negatieve controleplaatje is, ga terug naar stap 2.1 en controleer de notitie. </li><li> Selecteer 4-8 afzonderlijke kolonies (afhankelijk van de negatieve controle: ligatieverhouding) van elke ligatie-reactie van de verschillende genen die voor screening worden geïntroduceerd (1 n) en een 4 ml LB en de passende antibiotica overnightkweek / individuele kolonie inoculeren. Kweek culturen &#39;s nachts met schudden bij 37 ° C en 220 rpm. </li><li> Isolatie van plasmide-DNA met behulp van een plasmide-DNA-isolatie kit volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Stel een 20 μL NdeI + EcoRI digestreactie op die 150-500 ng DNA en 1 μl van elk enzym bevat met 2 μl van de geschikte 10x buffer. In thIs het geval, voeg NdeI en EcoRI toe op hetzelfde moment dat het gen van belang tussen de restrictieplaatsen zal zijn. Een negatieve controle met de lege pMGX vector wordt aanbevolen. Verteer gedurende 2 uur bij 37 ° C in een waterbad. </li></ol></li></ol> 3. Genen 2 inbrengen in het pMGX vectorbevattende gen 1, pMGX- yfg1 <ol><li> Beperking verteren pMGX- yfg1 met AvrII en behandelt met kalfdarmfosfatase (CIP). <ol><li> Gebruik een 40 μL digest reactie die 0,5-1,5 μg vector DNA bevat (~ 5-10 μl geïsoleerd DNA) en 1 μl AvrII met 4 μl van de geschikte 10x buffer. Verteer gedurende 1,5 uur bij 37 ° C en voeg vervolgens 1,5 μl CIP toe. Laat het nog eens 30 minuten bij 37 ° C liggen. </li></ol></li><li> Beperking verteren pMGX- yfg2 met AvrII en XbaI om het gen van belang te bevrijden. <ol><li> Gebruik een 40 μL digest reactie die 0,5-1,5 μg DNA en 1 μ bevat; L van elk enzym met 4 μl van de passende 10x buffer Verteer gedurende 2 uur bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Elektroforese beperking verteert op een geschikte procent (0,7%) agarosegel en accijnst de inzet- en vectorbanden met behulp van een schoon scalpel / scheermesje (zie stap 2.2-2.3). </li><li> Extract het DNA met behulp van een gel-extractie kit volgens het protocol van de fabrikant en kwantificeer het DNA 17 . </li><li> Ligeer gen 2 in pMGX- yfg1 met behulp van een 3: 1 insert-to-vector ratio. Stel een negatieve ligatie van verteerde pMGX- yfg1 op zonder de aanvullende insert. Installeer zoals hierboven in stap 2.5. </li><li> Transformeer 5 μL van de ligatie reacties in XL1-Blue chemisch bevoegde E. coli cellen, geligeerde plasmiden pMGX- yfg1,2 (bevattende gen van belang 1 en 2) en negatieve pMGX- yfg1 controle, zoals gezien in stap 2.6. </li><li> Vergelijk de kolonietelling op de negatieve controle- en ligatieplaten. Een kolonie telling ratio gReater dan 1: 2 is gewenst. Als er een groot aantal kolonies op het negatieve controleplaatje is, ga terug naar stap 3.1 en controleer de CIP-behandeling. </li><li> Selecteer 4-8 afzonderlijke kolonies (afhankelijk van de negatieve controle: ligatieverhouding) van de ligatie-reactie en inoculeer 4 ml LB plus het geschikte antibiotica per individuele kolonie en groei overnacht bij 37 ° C en 220 rpm. </li><li> Isolatie van plasmide-DNA met behulp van een plasmide-DNA-isolatie kit volgens het protocol van de fabrikant en het DNA 17 kwantificeren. </li><li> Scherm de effectieve invoeging van het tweede gen door een restrictie vertering van pMGX- yfg1,2 met EcoRI uit te voeren. <ol><li> Gebruik een 20 μL digest reactie die 150-500 ng DNA en 1 μl EcoRI enzym bevat met 2 μL EcoRI 10x buffer. Verteer gedurende 2 uur bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Elektroforese de restrictie verteren op een geschikte procent agarosegel; Zoek een band die overeenkomtS aan de grootte van gen 2 (zie stap 2.2). Een gen kan in de ongewenste, omgekeerde oriëntatie in de vector invoegen. </li></ol> 4. Het toevoegen van een derde gen in de pMGX vector bevattende genen 1 en 2, pMGX- yfg1,2 <ol><li> Beperking verteren pMGX- yfg1,2 met AvrII en behandel met CIP, zoals gezien in stap 3.1. </li><li> Beperking verteren pMGX- yfg3 met AvrII en XbaI, zoals gezien in stap 3.2. </li><li> Elektroforese verdeelt de restrictie op een geschikte percentage agarosegel en accijnsinzet en vectorbanden met behulp van een schoon scalpel / scheermesje; Verwijzen naar stappen 2.2-2.3. </li><li> Extract het DNA uit de agarosegel met behulp van een gel-extractie kit en kwantificeer het DNA 17 . </li><li> Ligeer gen 3 in pMGX- yfg1,2 met behulp van een 3: 1 insert-to-vector ratio en stel een negatieve ligatie van verteerde pMGX- yfg1,2 in zonder een extra insert, zoals gezien in stap 3.5. </li><li> Transformeer 5 μL van de ligatie reacties in XL1-Blauwe chemisch bevoegde E. coli cellen, geligeerde plasmide pMGX- yfg1,2,3 (bevattende genen van interest 1, 2 en 3) en negatieve pMGX- yfg1,2 controle, zoals gezien in stap 2.6. </li><li> Vergelijk de kolonietelling op de negatieve controle- en ligatieplaten. Als er een groot aantal kolonies op het negatieve controleplaatje is, ga terug naar stap 4.1 en controleer de CIP-behandeling. </li><li> Selecteer 4-8 individuele kolonies (afhankelijk van de negatieve controle: ligatieverhouding) van de ligatie-reactie en inoculeer 4 ml LB plus het geschikte antibiotica per individuele kolonie; Groeien overnacht bij 37 ° C en 220 rpm. </li><li> Isolatie van het plasmide-DNA met behulp van een plasmide-DNA isolatie kit volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Scherm de effectieve invoeging van het derde gen door het uitvoeren van een restrictie vertering van pMGX- yfg1,2,3 met EcoRI, zoals gezien in stap 3.10. </li><li> Elektroforese de restrictie verteren op een geschikte procent agarosegel; kijkenVoor banden die overeenkomen met de maten van gen 2 en gen 3 (zie stap 2.2). Opmerking: gen 3 kan in de vector in de ongewenste omgekeerde oriëntatie invoegen. Als genen 2 en 3 dezelfde grootte hebben, moet een andere geschikte restrictie verteerplaats geselecteerd worden voor screening. OPMERKING: Herhaal als nodig voor elk nieuw gen. </li></ol> 5. Het produceren van eiwitten van belang met behulp van een multigene expressiesysteem en het beoordelen van productie door Western Blotting <ol><li> Transformeer de positieve kloon die alle genen van belang bevat in chemisch bevoegde eiwitproductie E. coli , zoals BL21- (DEDE3). <ol><li> Doe 100 μl alikvoten van chemisch bevoegde BL21- (DEDE3) E. coli op ijs gedurende 5 minuten en voeg vervolgens 1 μL van het positief gekloneerde plasmide-DNA toe; Incubeer gedurende 30 minuten op ijs. </li><li> Warmte schok de cellen gedurende 45 seconden in een waterbad dat bij 42 ° C wordt gehouden en voeg vervolgens 200 μL koude LB toe. Incubeer op ijs gedurende 2 minuten. </li><li>Schud de cellen bij 37 ° C en 220 rpm gedurende 1 uur en verspreid vervolgens plaat 100 μL op een LB-agarplaat die de geschikte selecteerbare marker bevat (ofwel ampicilline of kanamycine). </li></ol></li><li> Express het eiwit door isopropyl-ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inductie. <ol><li> Selecteer een geïsoleerde kolonie uit de transformatorplaat B21- (λDE3) en geef 4 ml LB plus het juiste antibioticum in inoculatie; Groeien overnacht, schudden bij 37 ° C en 220 rpm. </li><li> Inoculeer een 100 ml LB plus de geschikte antibiotica kweek door gebruik te maken van 1 ml nachtcultuur. </li><li> Groeien bij 37 ° C met schudden bij 220 rpm tot een OD 600 van 0,6. </li><li> Inducteer de cultuur met 100 μM IPTG en groei gedurende 15 uur bij 25 ° C en 220 rpm. </li><li> Verwijder 1 ml van de kweek en centrifugeer deze gedurende 1 min bij 13.000 xg; Weggooi de supernatant. </li></ol></li><li> Licht de cellen volgens lysisoplossing volgens de instructies van de fabrikantEn preform een ​​Western blot van het oplosbare cellysaat om te bepalen of alle eiwitten succesvol zijn geproduceerd 19 . </li></ol>

<ol><li>Purnick, P. E. M., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+wave+of+synthetic+biology%3A+from+modules+to+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The second wave of synthetic biology: from modules to systems.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).</li>
<li>Bieniossek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li>
<li>Jochimsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+phosphonate+operon+gene+products+as+components+of+a+multi-subunit+complex+of+the+carbon-phosphorus+lyase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).</li>
<li>Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+mevalonate+pathway+in+Escherichia+coli+for+production+of+terpenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids.</a> Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).</li>
<li>Ajikumar, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoprenoid+pathway+optimization+for+Taxol+precursor+overproduction+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli.</a> Science. 330 (6000), 70-74 (2010).</li>
<li>Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursor-directed+biosynthesis+of+epothilone+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).</li>
<li>Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acid+and+N-acyl+sialic+acid+analog+production+by+fermentation+of+metabolically+and+genetically+engineered+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli.</a> Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).</li>
<li>Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/303559323_N-Acetylneuraminic_Acid_Production_in_Escherichia_coli_Lacking_N-Acetylglucosamine_Catabolic_Machinery">N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery.</a> Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).</li>
<li>Romier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-expression+of+protein+complexes+in+prokaryotic+and+eukaryotic+hosts%3A+experimental+procedures%2C+database+tracking+and+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%2C+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies.</a> Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).</li>
<li>Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+protein+coexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Strategies for protein coexpression in Escherichia coli.</a> Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).</li>
<li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li>
<li>Kim, K. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-promoter+vector+is+highly+efficient+for+overproduction+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes.</a> Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).</li>
<li>Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pST44+polycistronic+expression+system+for+producing+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).</li>
<li>Chen, X., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEV+protease-facilitated+stoichiometric+delivery+of+multiple+genes+using+a+single+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector.</a> Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), (2012).</li>
<li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning">https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning</a> (2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot</a> (2016).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Co-expressie van meerdere genen is steeds belangrijker, met name bij het karakteriseren en reconstituteren van complexe, multigene metabolische pathways 3 , 4 , 5 . Het pMGX-systeem maakt multigene co-expressie in E. coli routine 6 , 7 , 8 en toegankelijk voor diverse onderzoekers. In deze studie bleek dat vijf eiwitten van be...

Co-expressie van meerdere eiwitten is steeds belangrijker, met name bij toepassingen in synthetische biologie, waar meerdere functionele modules uitgedrukt moeten worden 1 ; Bij het bestuderen van eiwit-eiwit complexen, waarbij expressie en functie vaak co-expressie 2 , 3 vereisen; En bij het karakteriseren en gebruik maken van biosynthetische trajecten, waarbij elk gen in het traject 4 , 5 , 6 , 7 , 8 moet worden uitgedrukt. Er zijn een aantal systemen ontwikkeld voor co-expressie, in het bijzonder in het gastheerorganisme Escherichia coli , het werkpaard voor recombinant eiwituitdrukking 9 van het laboratorium. Bijvoorbeeld, meerdere plasmiden met verschillende selecteerbare markers kunnen worden gebruikt om individuele eiwitten uit te drukken met behulp van een rijkdom van verschillende ex<html> Drukvectoren 10 , 11 . Enkele plasmidesystemen voor meerdere eiwituitdrukking hebben ofwel meerdere promotors gebruikt om de expressie van elk gen 10 , 12 te regelen; Synthetische operonen, waarbij meerdere genen gecodeerd zijn op een enkel transcript 2 , 13 ; Of in sommige gevallen een enkel gen dat codeert voor een polypeptide dat uiteindelijk proteolytisch wordt verwerkt, waardoor de gewenste eiwitten van belang 14 worden verkregen . <img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> Figuur 1: pMGX workflow met de constructie van een polycistrische vector. Het pMGX systeem biedt een flexibele, makkelijk te gebruiken strategie voor de constructie van synthetische operonen onder controle van een induceerbare T7 promotor.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien. In dit manuscript wordt het gebruik van een zeer effectief systeem voor de constructie van multigeen synthetische operonen onder de controle van een induceerbaar T7 RNA polymerase ( Figuur 1 ) beschreven. Met dit systeem kunnen veel genen tegelijkertijd uit één plasmide worden uitgedrukt. Het is gebaseerd op een plasmide systeem, oorspronkelijk genaamd pKH22, die succesvol is gebruikt voor een aantal verschillende toepassingen 6 , 7 , 8 . Hier wordt deze plasmide set uitgebreid om vier gerelateerde vectoren te omvatten: pMGX-A, een expressievector die geen C- of N-terminale labels en met de ampicilline resistentie merker ontbreekt; PMGX-hisA, een expressievector die codeert voor een N-terminale hexahistidine tag en met de ampicilline resistentie marker; PMGX-K, een expressievector lC-of N-terminale tags en met de kanamycine resistentie marker; En pMGX-hisK, een expressievector die codeert voor een N-terminale hexahistidine tag en met de kanamycine resistentie marker. In deze studie wordt de werkwijze voor het genereren van een polycistrische vector die vijf genen bevat die het pMGX-systeem gebruiken, in het bijzonder pMGX-A, aangetoond, samen met de succesvolle productie van elk afzonderlijk eiwit in Escherichia coli .

<table><tbody><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Fosfatase, Calf Intestinaal (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1332-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Alrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) chemisch competente cellen</td><td></td><td></td><td>Competente cel bereid in huis</td></tr><tr><td>B-PER Bacteriële Eiwit Extractie Reagens</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>PI78243</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Meegeleverd met polymerase</td></tr><tr><td>Gel Extractie Kit</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td>E.Z.N.A Gel Extractie, geleverd door VWR Cat 3: CA101318-972</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>His Tag Antilichaam [HRP], mAb, Muis</td><td>GenScript</td><td>A00612</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substraat</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKLS0100</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Alrich</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>A411-20</td><td></td></tr><tr><td>Gepasteuriseerd volle melkpoeder</td><td>Lokaal supermarkt</td><td></td><td>Merkloze supermarkt melk is voldoende</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membraan</td><td>Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td><td>10600007</td><td>Membraan PT 0.45 &micro;m 200 mm x 4 m, geleverd door VWR Cat #: CA10061-086</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Isolatiekit</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, geleverd door VWR Cat #: CA101318-898</td></tr><tr><td>pMGX</td><td>Boddy Lab</td><td></td><td>Vraag aan de Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Intergrated DNA Technologies</td><td></td><td>Ontwerp primers zoals nodig voor gewenst gen</td></tr><tr><td>Synthetisch Gen</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Ontwerp en optimaliseer zoals nodig</td></tr><tr><td>Thick Blot Filter Paper</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>BioShop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Alrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue chemisch competente cellen</td><td></td><td></td><td>Competente cel bereid in huis</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>RK-83600-07</td><td></td></tr><tr><td>Gel box - PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td>Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td></tr><tr><td>Gel Imager</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>AlphaImager EC</td></tr><tr><td>Incubator-oven</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>11-690-650D</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Incubator-shaker</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td>MaxQ 6000</td></tr><tr><td>Personna Schermessen</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>S04615</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>S65533Q</td><td>FB300</td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>VWR International</td><td>M-10E,6W</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>Z316091</td><td>Mastercycler Personal, geleverd door Sigma</td></tr><tr><td>UV Gezichtsbescherming</td><td></td><td>18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>15-460-2SQ</td><td></td></tr><tr><td>Western Transfer Apparaat</td><td>Bio-Rad</td><td>1703935</td><td>Mini-Trans Blot Cell</td></tr></tbody></table>

induceerbaar t7 rna polymerase-gemedieerde multigene expression system, pmgx

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Co-expressie van meerdere eiwitten is steeds meer essentieel voor synthetische biologie, het bestuderen van proteïne-eiwit complexen en het karakteriseren en toepassen van biosynthetische pathways. In dit manuscript wordt het gebruik van een zeer effectief systeem voor de constructie van multigene synthetische operonen onder de controle van een induceerbaar T7-RNA-polymerase beschreven. Met dit systeem kunnen veel genen tegelijkertijd uit één plasmide worden uitgedrukt. Hierin is een reeks van vier gerelateerde vectoren, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K en pMGX-hisK, met ofwel de ampicilline of kanamycine resistentie selecteerbare merker (A en K) en ofwel een N-terminale hexahistidine Tag (zijn) worden bekendgemaakt. Gedetailleerde protocollen voor de constructie van synthetische operonen die dit vectorsysteem gebruiken, worden samen met de bijbehorende gegevens verschaft, waaruit blijkt dat een pMGX-gebaseerd systeem dat vijf genen bevat, gemakkelijk kan worden geconstrueerd en gebruikt om alle vijf gecodeerde eiwitten in Escherichia coli te produceren. Deze systEm en protocol kunnen onderzoekers routinematig complexe multifunctionele modules en pathways uitdrukken in E. coli .

In deze studie was het doel om vijf eiwitten uit één enkel plasmide te co-expresseren. De vijf-codon geoptimaliseerde synthetische genfragmenten die coderen voor N- of C-terminale hexahistidine tags werden commercieel gekocht. De synthetische genen werden geamplificeerd door PCR en individueel gekloneerd in een PCR-stompe vector en sequenced. Om het polycistronische plasmide te genereren werden de vijf genen die van belang zijn eerst gekloneerd in een geschikt pMGX plasmide, pMGX-A. <str...

Deze studie beschrijft methoden voor de T7-gemedieerde co-expressie van meerdere genen uit een enkel plasmide in Escherichia coli met behulp van het pMGX plasmide systeem.

Induceerbaar T7 RNA Polymerase-gemedieerde Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Het algemene doel van deze procedure is het construeren van synthetische multigene operons onder controle van een induceerbare T7 RNA-polymerase voor de gelijktijdige expressie van meerdere eiwitten. Deze methode kan onderzoekers in de synthetische biologie en biochemie helpen bij het bouwen van multi-eiwitpaden of het bestuderen van eiwitcomplexen die afhankelijk zijn van co-expressie via meerdere benaderingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om meerdere genen gelijktijdig in Escherichia coli tot expressie te brengen vanuit een enkel plasmide.De procedure uit mijn laboratorium zal worden gedemonstreerd door Mohamed Hassan, een PhD-student, en Angela Thompson, een Co-op-student. Nadat de genen van belang volgens het tekstprotocol zijn verkregen en geamplificeerd, bereidt u de digestiereacties voor het eerste gen van belang en de pMGX-factor. Gebruik hiervoor een reactie van 40 µL met 0,5 tot 1,5 µg DNA in het indel-enzym.Incubeer de reacties gedurende één uur bij 37 °C. Voeg vervolgens EcoRI toe en laat de digestie nog een uur doorgaan. NdeI wordt vóór EcoRI toegevoegd om te garanderen dat het effectief divergeert.NdeI is gevoelig voor de leng

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of an inducible expression system to identify where the bacterial effector protein CaeB disrupts the host apoptotic cascade. It outlines the steps for transfecting CaeB-expressing cells with a tetracycline-responsive system to induce pro-apoptotic gene expression in order to identify the point of...

Transfection of an Inducible Gene Expression System into Cells Expressing a Bacterial Effector Protein

This video demonstrates the tetracycline, or Tet-On, gene expression system in a mouse model. In the presence of doxycycline, a tetracycline derivative, the Tet-On system consisting of reverse tetracycline-controlled transactivator protein becomes activated and expresses the gene of interest.

Inducible Tet-On Regulatable System-Based Gene Expression In Vivo: A Tetracycline-Induced Gene Expression System for Target Gene Transcription Activation in Mouse Model

Hier beschrijven we een werkwijze voor het gebruik van type I en type...

Genetische Manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen voor Functionele genomische analyse van<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Deze vijfdaagse protocol beschrijft alle stappen, apparatuur en aanvullende software voor het maken en uitvoeren van een efficiënte endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem vanaf nul. Met reagentia, het protocol duurt 8 uur of minder voor het inrichten van een reactie, verzamelen en verwerken van gegevens.

Protocollen voor implementatie van een Escherichia coli Op basis TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

De hier beschreven methode wordt gebruikt om de apoptotische signaleringskaskade te induceren in gedefinieerde stappen om de activiteit van een anti-apoptotisch bacterieel effector-eiwit te onderzoeken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor inductieve expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten, of voor het onderzoeken van interferentie met andere signaalwegen.

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

Hydrodynamische staart veneuze injectie van transposon gebaseerde integratie vectoren kan stabiele transfectie van lymfkliertest hepatocyten in vivo. Hier presenteren we een praktische protocol voor Transfectie systemen waarmee de langdurige constitutieve uitdrukking van een enkele transgenic of gecombineerde constitutieve en doxycycline-afleidbare expressie van een transgenic of miR-shRNA in de lever.

Constitutieve en afleidbare systemen voor genetische In Vivo wijziging van muis hepatocyten gebruik hydrodynamische staart veneuze injectie

Hier presenteren we een protocol voor de modulatie van transgenic expressie pEUI(+) enkelvoud gene schakeloptie door tebufenozide behandeling.

Een Ecdysone Receptor gebaseerde enkelvoud Gene schakelaar voor bewuste expressie van transgenic met te verwaarlozen Leakiness, robuustheid en reversibiliteit

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het genereren van een modelsysteem waarin de transcriptie van een endogene gen van belang voorwaardelijk kan worden gecontroleerd in de levende dieren of cellen met behulp van verbeterde lac -onderdrukker en/of tet activator systemen.

In vivo toepassing van het systeem van de afstandsbediening voor de manipulatie van de endogene genexpressie

Hier beschrijven we de generatie en toepassing van een geheel van transgene Arabidopsis thaliana lijnen inschakelen afleidbare, weefsel-specifieke expressie in de drie belangrijkste meristems, het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en het cambium.

Afleidbare, cel Type-specifieke uiting in Arabidopsis thaliana via LhGR-gemedieerde Trans-activering

Deze studie beschrijft een methode voor experimenten met hoge doorvoer met behulp van een 3D-geprinte LED-array om licht-induceerbare genexpressie in HEK293T cellen te optimaliseren.

Snelle optimalisatie van een licht-induceerbaar systeem om de genexpressie van zoogdieren te beheersen

Leer het pMGX-systeem voor multigenexpressie met induceerbare T7 RNA-polymerase in Escherichia coli. Deze methode maakt gelijktijdige expressie van meerdere eiwitten mogelijk voor synthetische biologie en eiwitcomplexonderzoek.

Induceerbaar T7 RNA Polymerase-gemedieerde Multigene Expression System, pMGX

Meer video's verkennen