Immunohistochemie op paraffine secties van Mouse Opperhuid gebruik van fluorescerende antilichamen

In de epidermis. Immunohistochemische analyse is een efficiënte manier om specifieke eiwitten te lokaliseren in hun expressiecompartiment. In deze video demonstreren we een betrouwbare methode voor immunolokalisatie van eiwitten in de epidermis, die we routinematig gebruiken in ons laboratorium.

Hallo, ik ben Tammy van het laboratorium van Dr. Turin hier in het lage gebouw van het Ottawa Health Research Institute in het chronische ziekteprogramma. Vandaag laten we u een procedure zien voor immunohistochemie met behulp van fluorescente antilichamen op in paraffine ingebedde weefselsecties van muizenepidermis. In ons laboratorium hebben we protocollen geoptimaliseerd voor immunolokalisatie van differentiatiemarkers van de epidermis met behulp van BO'S gefixeerd weefsel.

Als onderdeel van de optimalisatie houden we de huid plat door hem op een papieren handdoek te leggen voordat we hem fixeren. Deze procedure omvat dissectie van de epidermis, fixatie, dehydratie, paraffine-inbedding, en sectiesnijden, ontwassing, rehydratie, onthullen van antigeen, antilichaamlabeling en ten slotte montage en visualisatie met epi-fluorescentie. Dus laten we beginnen.

Bij het gebruik van neonatale muizen, is er geen noodzaak om de rug te scheren. Als je echter oudere muizen hebt die vacht hebben, moet je de rug beharen om te voorkomen dat deze in de weg zit bij het snijden van de secties. Wanneer je je dissectie doet, wil je heel voorzichtig zijn om je forceps niet in de delen van de huid te steken die je voor je test wilt gebruiken.

Dus wat we doen is we leggen de forceps rond de rand van waar we gaan snijden, en dan til je heel voorzichtig op, snij de epidermis, onthoud niet om het gebied aan te raken dat je voor je experiment wilt gebruiken. Wanneer we de huid fixeren, willen we niet dat de huid oprolt en in de buis komt. We willen dat het mooi en plat is.

Dus wat we doen om dat te helpen is we leggen de huid op een papieren handdoek zodat deze plat blijft tijdens het fixeren. Nu dat we de huid mooi en plat op de papieren handdoek hebben, snijden we de randen af of trimmen ze om de delen te verwijderen die we mogelijk hebben beschadigd met de forceps. En dan snijd je de huid in heel kleine stukjes van ongeveer twee millimeter bij twee millimeter.

Nu gaat het weefsel worden gefixeerd. Nadat je de huid in beheersbare stukken hebt gesneden, dompel je het in de boin-oplossing. Sluit de buisjes, wikkel de buisjes in perfil en zet ze op een rocker.

Voor een nachtelijke incubatie is het belangrijk om alleen 16 tot 18 uur in de boin-oplossing te incuberen. Kortere of langere fixatieperioden zullen je weefsel beschadigen. De incubatie is voorbij.

Je spoelt je weefsel met PBS en vervolgens door een reeks ethanolwassingen met 30% 50% en 70% alcohol. Je kunt zien dat de BO geel van kleur is en dat naarmate je de wassingen doet, naarmate de boons wordt verdund, de kleur van de wassing steeds minder geel wordt. Je wast twee keer 30 minuten per keer.

Na de laatste wassing in ethanol worden monsters geplaatst in een verse 70% ethanol en kunnen ze worden bewaard bij vier graden Celsius tot verdere verwerking een paar ventielen van paraffine.Inbedding. Over het gebruik van bevroren weefsels is dat de weefselintegriteit superieur is en dat monsters voor langere tijd kunnen worden bewaard. Over het algemeen genereren corefaciliteiten meer reproduceerbare resultaten.

Als je echter de faciliteit en een toegewijde operator hebt die over de expertise beschikt, kunnen secties worden gesneden in-house. Het leren snijden van goede secties is eerder een kunstvorm. Daarom gebruiken we een corefaciliteit.

Nadat je de dia's van de corefaciliteit hebt ontvangen, kun je zien dat er paraffine op de dia's aanwezig is. Als een dunne film worden de dia's op een rek geplaatst, omwikkeld met aluminiumfolie, net als een gebakken aardappel, en gedurende vijf minuten bij 55 graden geïncubeerd. Nadat je incubatie voorbij is, pak je snel de dia's uit en plaats je de dia's voor drie wasbeurten van vijf minuten in tolueen.

Het is erg belangrijk om te onthouden dat deze vijf minuten wasbeurten goed getimed moeten zijn, te lang incuberen en tolueen zal niet goed zijn voor je monsters. Na je drie wasbeurten en tolueen, doe je een snelle spoeling in honderd procent ethanol. Omdat ethanol en tolueen een neerslag vormen die je experiment zal verstoren, is dit een zeer belangrijke stap om te onthouden.

Vervolgens worden de monsters gerehydrateerd door de dia's vijf minuten in 95% ethanol te incuberen, vijf minuten in 70% ethanol, en vervolgens twee keer vijf minuten in water. Op dit punt kunnen weefsels worden verwerkt voor kleuring met h en e. We gebruiken ook de corefaciliteit voor dit doel.

Voor het onthullen van antigeen giet je 500 ml van eenmaal citraatbuffer in een plastic beker van één liter en dompel je je dia's erin. Vergeet niet om de metalen handgreep te verwijderen en zet je beker in de magnetron. Magnetron op hoog vermogen gedurende twee keer vijf minuten.

Onthoud om de deur te openen om de magnetron af te koelen tussen je twee incubaties. Nadat je met magnetronnen klaar bent, verwijder je de dia's uit de kokende citraatbuffer en plaats je ze in een kleurinschaal met warm water. We gebruiken gewoon warm kraanwater en het doel hiervan is om je dia's langzaam af te koelen van kokend naar kamertemperatuur.

Nu kun je de dia's drie keer vijf minuten in PBS wassen en we zijn klaar om te beginnen met immunohistochemie. Het eerste wat we moeten doen om te beginnen met immunokleuring is het gebied rond onze monsters te drogen met een stukje tissuepapier. Om antilichaamkruisingsbesmetting te voorkomen, markeren we het gebied rond onze monsters met een vloeibare blocker.

Maak een bevochtigde kamer klaar door een filterpapier in een petrischaal te leggen. Week het met water, verwijder het overtollige water en plaats je dia's. De reden waarom we een bevochtigde kamer gebruiken, is om ervoor te zorgen dat tijdens onze incubatieperioden onze dia's niet uitdrogen.

Het is erg belangrijk dat de dia's niet uitdrogen omdat het trekken uw achtergrond zal verhogen. De dia