Name: Dissectie van larvale zebravis Gonadale Tissue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Leer gonadaal weefsel isoleren uit larven van Danio rerio voor moleculaire analyse. Deze techniek maakt onderzoek naar geslachtsdifferentiatie en genexpressie mogelijk vanaf 17 dagen na bevruchting.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken C Zhang voor vissen zorg. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31171074, 31371099 en 31571067 naar GP) en door de Pujiang Talent Project (09PJ1401900 aan GP).

Zebravis experimenten werden goedgekeurd door de Fudan University Institutional Animal Care en gebruik Comite. Zebravis zijn gerezen en gekweekt volgens standaardwerkwijzen 20. 1. Voorbereidingen <ol><li> Cultiveren 17 dpf en 25 dpf larvale zebravis <ol><li> Transfer 2 mannelijke en 2 vrouwelijke volwassen zebravissen (gezond, 3 tot 6 maanden oud, laboratorium AB-stam) tot een kruispunt tank in de late namiddag voor de kruising dag. Scheid de mannen en vrouwen met een slagboom. De volgende ochtend, vernieuwt u de tank water en verwijder de barrière voor hen in staat stellen om te paren. Eieren verzamelen in 100 mm petrischalen 1-2 uur na de bevruchting. </li><li> Blijf ongeveer 40 embryo&#39;s in een 100 mm plaat met 40 mL embryo medium (EM) bij 28,5 ° C gedurende de vroege ontwikkelingsperiode (4 dagen) en ververs de EM tweemaal per dag. Transfer larven 1 L tanks (40 larven 300 ml systeemwater) en voer met levende raderdiertjes (volledige voeding, tweemaal daags) na 5 dpf.Feed voor live pekelgarnalen plaats van rotifer dieet na 10 dpf. Breng de vis in recirculerende watersysteem bij 14 dpf 21. </li><li> Verhogen larvale zebravis in het recirculerende watersysteem tot 17 dpf en 25 dpf. Zorgen de licht / donker cyclus 14/10 h en pH systeemwater ongeveer 7,2. Meet de lichaamslengte van 17 dpf (5,5-6,8 mm) en 25 dpf (8-11 mm) 22 larven. </li></ol></li><li> Bereid 2% agar platen voor de dissectie. <ol><li> Voeg 4 g agar met 200 ml steriel water. Verwarm het mengsel in een magnetron totdat deze transparant wordt. </li><li> Koel de agar gedurende ongeveer 15 minuten, giet het in 60 mm petrischalen (ongeveer 1/3 volume van de plaat). Bewaar het gestolde agar platen bij 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Protocol 1: Ontleden de Gonadale Tissue van 17 en 25 dpf Larven <ol><li> Voeg crushed ijs in de tank te verdoven 17 dpf larven. Breng deverdoofd larven in een 100 mm petrischaal met gekoelde oplossing van 30 ml koude Ringer&#39;s. Houd de vis geïncubeerd in de oplossing van de gekoeld Ringer&#39;s gedurende ten minste 15 minuten om volledig te verdoven de larven. </li><li> Breng de larven naar een voorgekoeld agar plaat met een kleine plastic lepel. Dompel het gehele vislichaam in 10 ml gekoeld Ringer&#39;s oplossing en voorzichtig leg het op zijn kant. </li><li> Doe de volgende handelingen onder het veld visie van 25X stereo microscoop. Klem de vis stam met een pincet om te stabiliseren. Rip de buik lengterichting van de anus naar het hart met een pincet. Verwijder voorzichtig de huid en spieren aan één kant van het lichaam om de interne organen bloot te leggen. </li><li> Verwijder het gewicht van organen ventraal van de zwemblaas goed. Voorkom beschadiging van de gonade verbonden aan de zwemblaas. </li><li> Snijd de verbinding tussen de zwemblaas en de voorste lichaam. Trek de gehele zwemblaas en gonade weefsels voorzichtig. LET OP: In de meeste gevallenTussen de gonadale weefsel 17 dpf bevat omringende epitheelweefsel en protonephridium. Ze zijn niet gemakkelijk van elkaar gescheiden, maar op 25 dpf kan het gemakkelijk worden gescheiden. De gonaden is eveneens verbonden met de anus. Een kruising met linker en rechter gonade met elkaar verbonden bij de anus duidelijk zichtbaar zijn. </li><li> Met een pincet de gonaden weefsel zorgvuldig gescheiden van de zwemblaas en het schoonmaken van het omringende vetweefsel. </li><li> Geeft de geïsoleerde gonadale weefsel overbrengen naar een voorgekoelde 1,5 ml centrifugebuis bevattende oplossing 200 ui Ringer&#39;s. Houd de buis op ijs tot alle gonadale weefsels worden gescheiden van de larven. </li><li> Ontleden de geslachtsklieren 25 dpf larven volgens de beschrijving bij 2,1-2,7. </li></ol> 3. Protocol 2: Analyse genexpressie van de geïsoleerde Gonadale Tissues <ol><li> Extract totaal RNA uit de larvale gonadale weefsels. <ol><li> Breng de geïsoleerde gonadale weefsels naar een nieuwe RNase-free 1.5 mL buis en verwijder Ringer&#39;s. Voeg 100 ul lyseoplossing. Vortex totdat de weefsels zijn volledig vernietigd. </li><li> Voer de totale RNA-extractiewerkwijze volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Voeg 1/10 volume 10x DNase I-buffer en 1 pi DNase I bij de RNA-oplossing en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 1/10 volume DNase inactivatie reagens om het RNA-oplossing. Incubeer gedurende 10 minuten bij 70 ° C. Meet de concentratie van het totale RNA met behulp van een spectrofotometer. Bewaar bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Uitvoeren van eerste streng cDNA synthese <ol><li> Gebruik een oligo (dT) primer-linker eerste streng cDNA-synthese uit te voeren volgens het protocol van de fabrikant. Voeg 1-2 ug RNA tot een totaal reactievolume op 20 ui. </li><li> Incubeer de reactieoplossing gedurende 90 minuten bij 45 ° C. Beëindig de reactie door verwarmen bij 70 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 1 pl RNase H om het cDNA zodatlutie om de resterende RNA te verwijderen. Meng voorzichtig en centrifugeer gedurende 10 seconden bij 13.000 x g ~. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Voeg 20 ul nuclease vrij water. Bewaar bij -70 ° C. </li></ol></li><li> Voer fluorescerende kwantitatieve PCR <ol><li> Uitvoeren qPCR cycler op een systeem met een fluorescerende kleurstof. Gebruik de volgende PCR-cycling condities: 35 cycli bij 95 ° C gedurende 15 s, Tm-5 ° C gedurende 15 s, 68 ° C gedurende 30 s. Gebruik primersequenties als volgt: AMH (fwd: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; rev: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG), cyp19a1a (fwd: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; rev: CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), nanos3 (fwd: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), vasa (fwd: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; rev: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) en β-actine (fwd: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rev: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) 19. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild+sex+in+zebrafish%3A+loss+of+the+natural+sex+determinant+in+domesticated+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains.</a> Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).</li>
<li>Liew, W. C., Orban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+sex%3A+a+complicated+affair%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish sex: a complicated affair.</a> Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).</li>
<li>Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+and+winding+roads%3A+Testis+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).</li>
<li>Blaser, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+non-motile+behaviour+to+directed+migration+during+early+PGC+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish.</a> J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).</li>
<li>Wang, X. G., Orban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-M%C3%BCllerian+hormone+and+11+%CE%B2-hydroxylase+show+reciprocal+expression+to+that+of+aromatase+in+the+transforming+gonad+of+zebrafish+males%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dynam%22%5BJournal%5D)">Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males.</a> Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).</li>
<li>Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+control+of+female+sex+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line control of female sex determination in zebrafish.</a> Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).</li>
<li>Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+apoptosis+during+the+transition+from+ovary-like+tissue+to+testes+during+sex+differentiation+of+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish.</a> J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).</li>
<li>Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+expression+in+zebrafish+during+gonad+differentiation+by+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocr%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics.</a> Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).</li>
<li>Siegfried, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+determinants%3A+gene+expression+during+gonadal+sex+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation.</a> J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).</li>
<li>Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microarray+analysis+of+sex-+and+gonad-biased+gene+expression+in+the+zebrafish%3A+evidence+for+masculinization+of+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome.</a> BMC Genomics. 10, 579(2009).</li>
<li>Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11264405">Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain.</a> Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).</li>
<li>Kishida, M., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cytochrome+P450+aromatase+isoforms+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+brain+and+ovary+are+differentially+programmed+and+estrogen+regulated+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development.</a> Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).</li>
<li>Rodríguez-Marí, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+expression+pattern+of+zebrafish+anti-M%C3%BCllerian+hormone+%28amh%29+relative+to+sox9a%2C+sox9b%2C+and+cyp19a1a%2C+during+gonad+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.Patterns%22%5BJournal%5D)">Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development.</a> Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).</li>
<li>Krovel, A. V., Olsen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+vas%3A%3AEGFP+transgene+in+primordial+germ+cells+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish.</a> Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).</li>
<li>Krovel, A. V., Olsen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphic+expression+pattern+of+a+splice+variant+of+zebrafish+vasa+during+gonadal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development.</a> Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).</li>
<li>Tzung, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+depletion+of+primordial+germ+cells+in+zebrafish+promotes+testis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).</li>
<li>Hsiao, C., Tsai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+with+fluorescent+germ+cell%3A+a+useful+tool+to+visualize+germ+cell+proliferation+and+juvenile+hermaphroditism+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo.</a> Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).</li>
<li>Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+gonads+from+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish.</a> Reprod Biol Endocrinol. 7, 97(2009).</li>
<li>Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nr0b1+%28DAX1%29+mutation+in+zebrafish+causes+female-to-male+sex+reversal+through+abnormal+gonadal+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+The+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , Eugene: University of Oregon Press. University of Oregon. (2000).</li>
<li>Liew, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polygenic+sex+determination+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Polygenic sex determination system in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (4), e34397(2012).</li>
<li>Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development%3A+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Organs+from+the+Adult+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Organs from the Adult Zebrafish.</a> J. Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+Adult+Zebrafish+Hearts+for+High-throughput+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications.</a> J. Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+Adult+Zebrafish+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).</li>
<li>Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+development+in+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line development in fishes.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).</li>
<li>Huang, H. Y., Ketting, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+zebrafish+gonads+for+RNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation.</a> Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De zebravis is uitgegroeid tot een krachtig model en wordt veelvuldig gebruikt in de ontwikkeling en ziekte-gerelateerd onderzoek. De methoden voor het isoleren van organen bij volwassen zebravis, zoals hersenen, hart, gonade, en nieren, zijn goed gedocumenteerd 23, 24, 25. Als gevolg van de kleine omvang en dynamische herinrichting van de gonadale weefsels in het larvale zebravis, isolatie van gonadale weefsel is een uitdagend...

De belangrijkste vrouwelijke geslacht determinant in het wild levende zebravis chromosoom 4 is verloren of gewijzigd in de gedomesticeerde zebravis (dwz gemeenschappelijke lab stammen) 1. In plaats daarvan hebben ze een polygene geslachtsbepaling systeem vergezeld door omgevingsfactoren zoals temperatuur, hypoxie, voedselbeschikbaarheid en bevolkingsdichtheid. De gedetailleerde mechanismen van de zebravis sex ontwikkeling worden niet volledig begrepen. Fundamentele vragen zoals wanneer zebravis geslachtsbepaling optreedt, wat de primaire geslachtsbepaling signaal (s) is / zijn, en welke genen reguleren de eerste stap van gonade omzetting nog worden beantwoord 2, 3. In het proces van zebravis seks ontwikkeling, hebben een aantal belangrijke stadia erkend. In de vroege fase van ontwikkeling, uitgaande van 4 HPF (uur na bevruchting) primordiale kiemcellen (PGC) ondergaan specificatie, migratie en genitale ridgeproliferatie. PGC aantallen en onderlinge interacties tussen kiemcellen en somatische cellen zijn belangrijk voor differentiatie 4 gonaden. Op 13 dpf (dagen na de bevruchting), de geslachtsklieren zijn in de ongedifferentieerde fase. Uiterlijk op 17 dpf, de geslachtsklieren zich ontwikkelen tot bi-potentieel eierstokken in zowel de toekomstige vrouwen en mannen. De apoptose-afhankelijke overgang van de eierstok naar de testis beginnen bij 21 tot 25 dpf en kunnen gedurende een aantal weken. Met 35 dpf, heeft het geslacht van de gonaden bepaald en geslacht-specifieke productie van gameten gang in beide eierstokken en testes 5, 6, 7. Tot op heden hebben diverse kandidaat-genen en mechanismen van geslachtsbepaling voorgesteld. Proteoomanalyse en transcriptoom analyse hebben veel genen die seksueel dimorfe expressie en deze genen zijn gebruikt om geslachtsdifferentiatie studie in zebravis 8, </sup&gt; 9, 10. Bijvoorbeeld, in larvale zebravis, de cyp19a1a gen specifiek tot expressie gebracht in de eierstok maar niet in de testis 11, 12. Bovendien wordt AMH gen zwak tot expressie gebracht in de follikel granulosa cellen, maar sterk testis Sertoli cellen 13. Daarentegen wordt vasa gen continu tot expressie gebracht in de geslachtscellen van zowel vrouwelijke als mannelijke zebravis, waardoor het een geschikte gonade marker 14, 15. Onderzoeken gonadale genexpressieniveaus is cruciaal voor het moleculaire mechanisme van de geslachtsbepaling en differentiatie begrijpen name de bi-potentiaal eierstok fase 3, 9. De geringe omvang van larvale zebravis en dienovereenkomstig kleine gonaden compliceren de isolatie van gonadal weefsel voor verdere moleculaire analyse. Eerdere studies gebruikt ontleed gehele heupgebied tussen opercula en anale poriën 16. Dit preparaat hoewel bevattende geslachtsklieren, bestaat uit meerdere weefsels en organen. Als alternatief kunnen transgene dieren met gonaden-specifiek GFP expressie zoals vasa: EGFP werden voor gonaden weefsel isoleren door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) en laser capture microdissectie 17, 18. Maar hun wijdverbreide toepassing is beperkt. We beschrijven hier een eenvoudige procedure om gonaden weefsel te isoleren van larvale zebravis 17 dpf en 25 dpf. We tonen de positie van de geslachtsklieren met betrekking tot andere organen en isoleer de morfologisch intact geslachtsklieren uit de omliggende weefsels. We de gonaden-specifieke genen zoals vasa en cyp19a1a tonen verder zijn sterk tot expressie gebracht in de geïsoleerde geslachtsklieren opzichte van de romp weefsel door kwantitatieve PCR (qPCR) analyse. Het huidige protocol maakt de identificatie, isolatie, zuivering en RNA-amplificatie van specifieke gonadale genen van larvale zebravis, waardoor verdere moleculaire analyse gonadale weefsel 19 mogelijk.

<table><tbody><tr><td>Cell culture dish 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Voor embryo-incubatie</td></tr><tr><td>20x EM</td><td></td><td></td><td>Voor een 1 L nodig: voeg 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl en 2,9 g CaCl&#183;2H2O toe; voeg vervolgens 0,41 g KH2PO4, 0,412 g Na2HPO4 anhydrous en 4,9 g MgSO4&#183;7H2O toe.</td></tr><tr><td>1x EM</td><td></td><td></td><td>Verdun 20x EM in gedistilleerd water</td></tr><tr><td>AGAROSE G-10</td><td>Gene</td><td>121985</td><td>Voor het bereiden van de 2% agar platen</td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Voor RNA-isolatie</td></tr><tr><td>Meter glass</td><td>Shen Bo</td><td>250 ml</td><td>Voor het bereiden van de 2% agar platen</td></tr><tr><td>Microwave Oven</td><td>Midea</td><td>M1-211A</td><td>Voor het verwarmen van de AGAR</td></tr><tr><td>Tweezer DUMONT#5INOX</td><td>World Precision Instrument</td><td>500341</td><td>Voor dissectie</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Motic</td><td>SMZ168</td><td>Voor dissectie</td></tr><tr><td>Pure water equipment</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ringer&rsquo;s solution</td><td></td><td></td><td>Voor een 1 L nodig: voeg 6,78 g NaCl, 0,22 g KCl, 0,26 g CaCl2 en 1,19 g Hepes toe; vul vervolgens aan tot 1 L; pas de pH aan tot 7,2. Steriliseer door middel van filtratie en bewaar in een geautoclaveerde doorzichtige polycarbonaat container.</td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Metal bath</td><td>QiLinbeier</td><td></td><td>Model GL-150</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica&nbsp;</td><td>M205 FA</td><td>Voor fotomicrografie</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Micro Scale RNA Isolation Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Voor RNA-isolatie van gonad-weefsels</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td>Voor DNA-digestie in de RNA-oplossing</td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>#K1631</td><td>Voor de synthese van eerste-strengs cDNA</td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EN0202</td><td>Voor het verteren van de resterende RNA in de cDNA-oplossing.</td></tr><tr><td>SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>QPK-201</td><td>Dit product is een op Taq DNA polymerase gebaseerde 2x mastermix voor real-time PCR en&nbsp; toepasbaar voor intercalatie-assay met SYBR Green I.</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Ne Drop</td><td>OD-2000+</td><td>Meten van de concentratie van het totale RNA</td></tr><tr><td>Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td>AG 22331 Hamburg</td><td>genexpressieprofilering</td></tr></tbody></table>

dissectie van larvale zebravis gonadale tissue

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Hoewel wild zebravis hebben een ZZ / ZW sex-bepalingssysteem werden geacclimatiseerd zebravis het geslacht chromosoom verloren. Ze maken gebruik van een polygene geslachtsbepaling systeem, waarbij meerdere genen verspreid over het genoom gezamenlijk het geslacht identiteit exemplaren bepalen. Momenteel is de genen die betrokken zijn bij het reguleren van gonade ontwikkeling en hoe ze werken blijven ongrijpbaar. Normaal gesproken, het isoleren van gonadale weefsel is de eerste stap om het geslacht ontwikkelingsprocessen te onderzoeken. Hier presenteren we een procedure om gonadale weefsel te isoleren van 17 dpf (dagen na de bevruchting) en 25 dpf zebravis larven. De geïsoleerde gonadale weefsel kan vervolgens worden onderzocht door morfologie en genexpressie profilering.

Dissecties van de geslachtsklieren werden uitgevoerd op AB stam larvale zebravis. Figuur 1 toont typische gonadale weefsel van larvale zebravis 17 dpf en 25 dpf. Eerst wordt de huid en de spieren van een zijde van de buik gesneden om de interne organen bloot. Na verwijdering van de massa van inwendige organen, de zwemblaas met de gonaden blijven in de kofferbak. De gonaden werd aan de ventrale zijde van zwemblaas (pijl in figuur ...

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren gonadale weefsel van larvale zebravis, die onderzoeken zebravis geslachtsdifferentiatie en het onderhoud vergemakkelijkt.

Dissectie van larvale zebravis Gonadale Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Het algemene doel van deze procedure is om gonadaal weefsel te isoleren uit zebravislarven en de moleculaire eigenschappen van het geïsoleerde weefsel te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de geslachtsorgaanontwikkeling bij de zebravis, zoals de conservering van genen bij de regulatie van de gonadenontwikkeling en de moleculaire basis van de seksuele ontwikkeling van de zebravis. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat gonadaal weefsel van zebravislarven vanaf 17 dagen na bevruchting kan worden gedisseceerd voor onderzoek naar de cellulaire en moleculair-biologische status.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de geringe omvang en de dynamische remodellering van het gonadale weefsel bij larvale zebravissen. Ter voorbereiding op de dissectie van de gonaden worden twee mannelijke en twee vrouwelijke volwassen zebravissen naar beide zijden van een verdeelde kruisingstank overgebracht. De volgende ochtend wordt het tankwater ververst en de barrière verwijderd om de paring te initiëren.Verzamel één tot twee uur na de bevruchting ongeveer veertig eitjes en breng deze over naar een plaat van 100 millimeter met 40 milliliter embryo-medium, of EM. Incubeer de embryo's vier dagen lang bij 28,5 graden Celsius en ververs het EM tweemaal per dag. Breng na de incubatie de larven over naar tanks van één liter. Voer de vissen vijf dagen na de bevruchting, of DPF, levende rotiferen.Wanneer de larven tien DPF bereiken, worden de vissen gevoed met levende peilartemia. Plaats de vissen vervolgens op 14 DPF in een recirculerend watersysteem. Kweek de zebravislarven verder tot 17 of 25 DPF.Meet vervolgens de lichaamslengte van de larven op 17 en 25 DPF. Bereid twee procent agarplaten voor dissectie door vier gram agar aan 200 milliliters steriel water toe te voegen. Verhit het mengsel in een magnetron tot het transparant wordt.Koel de agar gedurende 15 minuten af en giet deze vervolgens in petrischalen met een diameter van 60 millimeter. Bewaar de gestolde agarplaten bij vier graden Celsius. Voeg voor het anestheseren van larven van 17 DPF geplet ijs toe aan het aquarium.Breng de genarceerde larven over naar een gekoelde petrischaal van 100 millimeter met 30 milliliters koude Ringer-oplossing. Incubeer de vissen in de gekoelde Ringer-oplossing gedurende ten minste 15 minuten om de larven volledig te narcotiseren. Breng de larven met een plastic lepel over naar een vooraf gekoelde agarplaat.Dompel het gehele lichaam van de vis onder in tien milliliters gekoelde Ringers-oplossing en leg deze voorzichtig op zijn zij. Gebruik onder een stereomicroscoop, bij een vergroting van 25x, een pincet om de romp van de vis te klemmen ter stabilisatie. Scheur vervolgens met een ander pincet de buikholte longitudinaal open, van de anus tot aan het hart.Verwijder vervolgens voorzichtig de huid en spieren aan één zijde van het lichaam om de inwendige organen bloot te leggen. Verwijder daarna zorgvuldig de grote organen ventraal van de zwemblaas. Voorkom beschadiging van de gonade die aan de zwemblaas vastzit.Verbreek de verbinding tussen de zwemblaas en de lichaamsholte. Trek vervolgens voorzichtig de gehele zwemblaas en het gonadaal weefsel eruit. Scheid met een pincet voorzichtig het gonadaal weefsel van de zwemblaas.En verwijder het omliggende vetweefsel. Breng het geïsoleerde gonadaal weefsel onmiddellijk over naar een vooraf gekoelde centrifugebuis van 1,5 milliliters, die 200 microliters Ringer's Solution bevat. Bewaar de buis op ijs totdat alle gonadale weefsels van de larven zijn gescheiden.Om totaal RNA uit gonadaal weefsel van larven te extraheren, brengt u de geïsoleerde gonaden over naar een nieuwe RNase-vrije buis van 1,5 milliliter en verwijdert u de Ringer-oplossing. Voeg vervolgens 100 microliters lyssolution toe. Vortex de buis vervolgens totdat het weefsel volledig is gelyseerd.Voer een totale RNA-extractie uit volgens de instructies van de fabrikant, voeg vervolgens een tiende van het volume DNase I-buffer en één microliter DNase I toe aan de RNA-oplossing en meng de inhoud van de buis voorzichtig. Incubeer het monster 20 minuten bij 37 degrees Celsius. Voeg daarna een tiende van het volume DNase-inactiveringsreagens toe aan de RNA-oplossing.Incubeer het monster bij 70 °C gedurende tien minuten. Gebruik vervolgens een spectrofotometer om de concentratie van het totale RNA te meten. Voor de synthese van het eerste cDNA-streng worden een oligo-dT linker primer en één tot twee µg RNA gebruikt, volgens het protocol van de fabrikant.Incubeer de reactie bij 45 °C gedurende 90 minuten. Beëindig vervolgens de reactie door het monster vijf minuten lang te verhitten bij 70 °C. Voeg 1 µL RNase H toe aan de cDNA-oplossing om het resterende RNA te verwijderen.Meng de inhoud van de buis voorzichtig en centrifugeer het monster bij ongeveer 13.000 ×g gedurende tien seconden. Incubeer de buis 20 minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens 20 µL nucleasevrij water toe aan het monster.Bewaar het cDNA bij -70 °C. Gebruik tot slot een fluorescerende kleurstof om qPCR uit te voeren volgens de condities en primers die in het tekstprotocol worden vermeld. Deze figuur toont typisch gonadeweefsel van larvale zebravis op 17 DPF.De gonade is bevestigd aan de ventrale zijde van de zwemblaas, zoals hier te zien is. Op 17 DPF bevatten de larven de linker- en de rechtergonade, welke transparant zijn. In de meeste gevallen zijn de gonaden omgeven door epitheelweefsel en protonefridium.Op 25 DPF is de gonade vaak omgeven door vetweefsel, en kunnen er grote of kleine gonaden worden waargenomen. Tot slot werden, om de moleculaire eigenschappen van het geïsoleerde gonadale weefsel te analyseren, de expressieniveaus van de gonadale markers amh, cyp19a1a, nanos3 en vasa onderzocht via QPCR. De resultaten tonen significante stijgingen van markergenen in gonadeweefsel in vergelijking met controleweefsel.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in een uur worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast. Tijdens deze procedure is het belangrijk om consistent te blijven in de opkweekcondities van de zebravislarven, aangezien dit cruciaal is voor het verkrijgen van de verwachte resultaten. Na de ontwikkeling van deze techniek werd de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van geslachtsorganisatie om de geslachtsbepalende mechanismen van de zebravis te onderzoeken.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe gonadale weefsels uit zebravislarven te isoleren.

dissection-of-larval-zebrafish-gonadal-tissue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft een procedure voor het identificeren en ontleden van organen van de volwassen zebravissen.

Dissectie van organen van de Adult zebravis

Dit artikel beschrijft een aanpak voor zebravis netvliezen microdissect met en zonder retinale pigmentepitheel bevestigd, van een tot drie dagen postfertilization embryo's.

Microdissectie van de zebravis embryonale oogweefsels

Een duidelijke, gestandaardiseerde methode voor dissectie en isolatie van de zebravis hart op meerdere ontwikkelingsstadia worden beschreven. Annotatie en kwantificatie technieken worden ook besproken.

Hart Dissection in larvale, jeugdige en volwassen zebravis, Danio rerio</em

Wij presenteren een nieuwe methode voor microgavage van zebravislarven met gebruik van standaardapparatuur voor embryo-microinjectie en stereomicroscopie. We tonen aan dat microgavage een veilige en efficiënte techniek is die nuttig is voor het toedienen van gecontroleerde hoeveelheden uiteenlopende materialen specifiek in het lumen van de darm van de zebravislarve.

Microgavage van zebravis Larven

Na spinale doorsnijding, volwassen zebravissen hebben functioneel herstel van zes weken na het letsel. Om te profiteren van larvale transparantie en sneller herstel nemen, presenteren we een methode voor het doorsnijden van de larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, zien we zintuiglijke herstel vanaf 2 dagen na het letsel, en C-bocht beweging door 3 dagen na het letsel.

Spinal Cord doorsnijding in het larvale zebravis

Hier presenteren we een gestandaardiseerde reeks protocollen bij het observeren van de superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie), een onlangs geïdentificeerd, evolutionair geconserveerd structuur in de gewervelde ogen. Met behulp van zebravis larven, aantonen we technieken die nodig zijn ter specificatie van de factoren die aan de vorming en de sluiting van de superieure oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie bijdragen).

Visualisatie van de Superior oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie) tijdens Danio rerio embryogenese

Hier bieden we een dissectieprotocol dat nodig is om de late embryonale Drosophila mannelijke geslachtsklier live in beeld te brengen. Dit protocol zal observatie van dynamische cellulaire processen onder normale omstandigheden of na transgene of farmacologische manipulatie mogelijk maken.

Dissectie en live-imaging van de late embryonale drosophila gonad

Dit protocol beschrijft de procedure voor het verwijderen van de ventrale kwab van de lever bij volwassen zebravissen om de studie van leverregeneratie mogelijk te maken.

Gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen

Het artikel legt uit hoe de ogen chirurgisch kunnen worden verwijderd van levende zebravislarven als de eerste stap om te onderzoeken hoe retinale input de groei en ontwikkeling van het optische tectum beïnvloedt. Daarnaast biedt het artikel informatie over larvale anesthesie, fixatie en hersendissectie, gevolgd door immunohistochemie en confocale beeldvorming.

Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken

Dit is een veelgebruikte methode voor C. elegans gonad-dissectie gevolgd door vriesscheur, die kiembaanmonsters produceert voor immunofluorescentie via antilichaamkleuring, of voor eenvoudige DAPI-kleuring om DNA te visualiseren. Dit protocol is succesvol geweest voor studenten in een onderzoekslaboratorium en in een op cursussen gebaseerde niet-gegradueerde onderzoekservaring.

C. elegans Gonad dissectie en freeze crack voor immunofluorescentie en DAPI-kleuring

Hier beschrijven we een methode voor darmisolatie van zebravislarven 5 dagen na de bevruchting, voor single-cell RNA sequencing analyse.

Darmisolatie van zebravislarven voor eencellige RNA-sequencing

Leer gonadaal weefsel isoleren uit larven van Danio rerio voor moleculaire analyse. Deze techniek maakt onderzoek naar geslachtsdifferentiatie en genexpressie mogelijk vanaf 17 dagen na bevruchting.

Dissectie van larvale zebravis Gonadale Tissue

Meer video's verkennen