Name: Echografie-geleide Intracardiac injectie van menselijke mesenchymale stamcellen toe Homing aan de darm voor gebruik in lymfkliertest modellen van experimentele inflammatoire darmziekten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Leer echografie-geleide intracardiale injectie van menselijke mesenchymale stamcellen voor inflammatoire darmziekte-onderzoek bij muizen. Deze methode verbetert homing naar de darm met minimale mortaliteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Maneesh Dave wordt ondersteund door het ministerie van defensie grant PR141774 en de ziekte van Crohn en Colitis Foundation of America carrière ontwikkeling Award. Het laboratorium van Fabio Cominelli wordt ondersteund door de NIH grants DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (FC) en DK07948 (FC). Het laboratorium van Arnold Caplan wordt gedeeltelijk ondersteund door de L. David en E. Virginia Boudewijn Stichting. De financieringsinstanties had geen rol in de analyse van de studie of het schrijven van het manuscript. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs.

alle muizen experimenten en procedures in de studie werden goedgekeurd door de Case Western Reserve University &#39; s institutionele Animal Care en gebruik Comité. De procedures werden uitgevoerd in associatie voor beoordeling en erkenning van Laboratory Animal Care (AAALAC) geaccrediteerde faciliteit. De BM was aanzuiging onder een universitaire ziekenhuizen institutionele Review Board-goedgekeurde protocol op de cel van de stam kern faciliteit aan de Case Western Reserve University na de geïnformeerde toestemming.
 1. cultuur en transductie van menselijke beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (hMSCs) Opmerking: de isolatie van de hMSCs is in detail beschreven in eerdere publicaties 15 , 20.
<ol><li>Cultuur geïsoleerd hMSCs in Dulbecco &#39; s laag bewerkt Eagle glucose (DMEM-LG) medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS). Cultuur van de cellen bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO 2 in T175 flacons met 25 mL van groeimedium. Vervang het medium om 3-4 dagen. Op dag 14, de primaire passage van hMSCs uit te voeren.
	<ol><li>Wanneer de cellen bereiken 80% samenvloeiing, het oude medium volledig te verwijderen en voorzichtig wassen de cellen met 5 mL steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; voor 75 cm weefselkweek kolven).</li>
		<li>Verwijderen van de PBS uit de kolf en voeg 4 mL 0,25% trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA). Plaats de erlenmeyer terug in de incubator bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten de tijd van blootstelling zo kort mogelijk houden.</li>
		<li>Wanneer de meerderheid van de cellen goed-rond gemaakte zijn geworden of hebben losgemaakt van de cultuur-schotel, zet de reactie stop door het toevoegen van een volume van boviene kalfsserum gelijk is aan de helft van het volume van de trypsine.</li>
		<li>De celsuspensie overbrengen in een centrifugebuis nodig-grootte. Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder daarna voorzichtig het supernatant.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 5 mL medium (DMEM-LG + 10% FBS) en tellen van de cellen met een hemocytometer. 
		Opmerking: Op dit punt, de cellen worden overgeënt of getransduceerde met drievoudige verslaggever.</li>
	</ol></li> <li>Uitvoeren van de transductie van hMSCs met drievoudige verslaggever.
	<ol><li>Zaad 1.5 x 10 6 cellen in een T175 kolf. Cultuur van de cellen in 25 mL groeimedium bij 37 ° C, 95%, vochtigheid en 5% CO 2. Wacht 24 uur voor de cellen koppelen.</li>
		<li>Maken een virus cocktail in 15 mL buizen, zoals beschreven in referentie 18.
		<ol><li>Dooi lentivirus bij 37 ° C in een water bad. Voeg 160 µL van een oplossing van 5 mg/mL proteamine sulfaat in Dulbecco &#39; s gewijzigd Eagle Medium (DMEM) 8 ml gestolde voedingsbodem (DMEM-LG + 10% FBS) voor een definitieve concentratie van 100 µg/mL. Vortex voor 3 s. toevoegen de multipliciteit van een virus infectie (MOI) van 5 (1e keer ontdooid) .</li>
		</ol></li> <li>Het medium verwijderen uit de cel cultuur kolf (stap 1.2.1) en het virus cocktail aan de cellen toevoegen. Incubeer gedurende 10 uur bij 37 ° C, luchtvochtigheid van 95% en 5% CO 2.</li>
	</ol></li> <li>4 mL 100 µg/mL proteamine sulfaat toevoegen in 4 mL DMEM-LG + 10% FBS en incubeer gedurende een extra 14 h.</li>
	<li>De signaaltransductie na 24 h stoppen door te vervangen met 25 mL van medium (DMEM-LG + 10% FBS).</li>
	<li>Bevestigen transductie efficiëntie door evaluatie van mRFP expressie door stroom cytometry 18. 
	Opmerking: Hier, hMSCs die getransduceerde waren met meer dan 65% efficiëntie dienden.</li>
	<li>De cellen uit te breiden door te vervangen door 25 mL verse voedingsbodem (DMEM-LG + 10% FBS) tweemaal per week. Cultuur van de cellen bij 37 ° C, 95%, vochtigheid en 5% CO 2. Passage van de cellen nadat ze 80% samenvloeiing bereiken.</li>
	<li>Zodra het gewenste aantal cellen wordt bereikt, voeren trypsinebehandeling per stappen 1.1.2 - 1.1.4.</li>
	<li>Cellen tellen en ze op te schorten in steriele PBS (1 x) in de uiteindelijke concentratie van 1 x 10 6 cellen/75 µL. Houd de cellen op het ijs voor vervoer naar de echografie machine. Gebruik voor experimenten, hMSCs van passage nummers 2-5.</li>
</ol> 2. Echografie-geleide Intracardiac injectie van hMSCs in de linker ventrikel Opmerking: gebruik SAMP1/YitFc met gevestigde kleine-intestinale ontsteking en leeftijd - en gender-matched AKR/J muizen voor de experimenten. Onderhouden van de SAMP en AKR muizen onder de voorwaarden van specifieke pathogenen vrije, voeden ze standaard laboratorium chow en houd ze op 12 uur licht/donker cyclus. Hier, werden de echografie-geleide cardiale injecties uitgevoerd in een toegewijde pathogenen vrije cardiale echografie kamer gelegen in de CWRU dierlijke onderzoeksfaciliteit, die was ontsmet met een ontsmettingsmiddel en gespoeld met 70% alcohol. Laboratorium onderzoek personeel moeten het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, met inbegrip van toga's, gezichtsmaskers met oog schilden en steriele handschoenen tijdens de intracardiac injecties. De lichaamswarmte van de muis moet worden gehandhaafd voor de duur van de procedure.
<ol><li>Instellen in de echografie imaging systeem vóór de anesthetizing van de muis. Gebruik de echografie machine ontworpen voor muis echocardiogram voor dit protocol.
	<ol><li>Zet de macht en initialiseren de transducer (30 MHz) de nieuwe studie instellen.</li>
	</ol></li> <li>Anesthetize van de muis in een zaal van de inductie 3-4% Isofluraan met 100% zuurstof met een snelheid van 0,2 - 0,5 L/min. handhaven het dier voor de hele procedure met 2% Isofluraan in 100% zuurstof via een neus kegel. Bevestigen van juiste afstomping voordat u imaging rollen door te knijpen de teen, de muis, en gebrek aan beweging observeren. 
	Opmerking: Ophthalmic zalf moet worden toegepast op de ogen na de inductie van de anesthesie om te voorkomen dat het drogen van het hoornvlies. De narcose muizen aan de beeldvorming machines (d.w.z., bioluminescentie imaging systeem en echografie), overdragen, waar ze een onderhoudsdosis van verdoving Isofluraan ontvangt. Bepalen van de narcose start tijd en de diepte van de verdoving door het observeren van een gebrek aan reactie op snuifjes op de staart en voet pad elke 10 min voor de gehele duur van de verdoving.</li>
	<li>De temperatuur van de beeldvorming tabel en ultrageluid-gel ingesteld op 37 ° C.</li>
	<li>Volledig verwijderen van de vacht over het gebied van de thorax van de narcose muis gebruiken haar verwijdering room.</li>
	<li>Plaatst u de muisaanwijzer op de imaging tafel in liggende positie en beveiligen van zowel de bovenste en onderste ledematen met plakband om te voorkomen dat lichaamsbeweging tijdens de procedure. Een elektrocardiogram monitor gebruiken tijdens de procedure voor alle muizen.</li>
	<li>Reinigen van de huid van de borstkas gebied met behulp van een 10% Povidon/jodium doekje gevolgd door een doekje van 70% ethanol. Toepassing van een dikke laag gel op het gebied van de thorax van de muis.</li>
	<li>Monteren van de transducer in de houder en haar positie aanpassen totdat het linkerventrikel duidelijk zichtbaar zijn op het gezichtsveld is.</li>
	<li>Laden 150 µL celsuspensie getransduceerde hMSC (2 x 10 6 hMSCs in 150 µL van steriele PBS) in een injectiespuit 1 mL met een 28-G naald en de spuit om de juiste houder veilig. Om te visualiseren pulserende bloed, door een kleine lucht-kolom in de spuit te houden. Voorkom samendoen, schorten de cellen vóór de injectie.</li>
	<li>De spuit naar de muis thorax verder aanpassen van het traject van de naald met behulp van de echografie begeleiding en voer het linkerventrikel.</li>
	<li>De naald van de spuit via de intercostale ruimte en in het linkerventrikel van de muis na de begeleiding van de echografie beeldvorming, doordringen. 
	Opmerking: De spuit naald tip moet duidelijk zichtbaar in het linkerventrikel op de ultrasonographic afbeelding. Juiste plaatsing moet verder worden bevestigd door vers arteriële bloed uitstroom in de spuit. Dit zijn de tekenen van een succesvolle invoeging.</li>
	<li>Injecteren de celsuspensie hMSC heel langzaam meer dan 2 min, zachte pre toe te passenssure.</li>
	<li>Na de injectie van zwevende cellen, voorzichtig terugtrekken van de naald, schoon uit de ultrageluid-gel, en laat de muisknop los van de beperkingen van de tape.</li>
	<li>Plaats het dier in een nieuwe, schone kooi met een voorverwarmde zeem. 
	Opmerking: Na de voltooiing van de procedure, een warme omgeving moet worden gegeven aan de muizen tot herstel. Oververhit moet worden vermeden, omdat perifere vasodilatatie het herstel compromissen. De muizen moeten worden nauwlettend gevolgd en hield geïsoleerd van andere muizen tot hun volledige herstel, aangegeven door hun vermogen om sternale lighouding.</li>
	<li>Volgen het dier totdat zij volledig herstel van de narcose en dagelijks tot het einde van het experiment bereiken.</li>
</ol> 3. Bioluminescentie (BLI) beeldvorming van hMSCs <ol><li>Image de muizen 24u na de intracardiac injectie in de Bioluminescentie imaging systeem. Start de in vivo imaging-software. Initialiseren van de imaging systeem en open een nieuwe studie.
	<ol><li>In het Configuratiescherm van de imaging parameters instellen door te klikken op &#34; volgorde setup. &#34; In de grafische modus, selecteer &#34; luminescentie &#34; en &#34; foto. &#34; stelt u de blootstelling tijden van 0,5 s tot 10 min. de weggooien ingesteld op &#34; medium &#34; en de F / stop te &#34; 1. &#34; de excitatie-filter ingesteld op &#34; blok &#34; en het filter van de emissie naar &#34; open. &#34; het gezichtsveld ingesteld op &#34; C &#34; voor twee muizen. De reeks setup aan de wizard installatiekopie toevoegen door te klikken op het bedieningspaneel van de acquisitie.</li>
	</ol></li> <li>De luchtpomp en stelt de Isofluraan tot 2,5% in zowel de inductie-zaal en de neus kegel binnen de machine inschakelen.</li>
	<li>De muis i.p. injecteren met 300 µL van D-luciferine (12,5 mg/mL).</li>
	<li>Plaatst u de muisaanwijzer in de anesthesie-inductie-zaal.
	<ol><li>Na 2-3 min, breng de muis in de in vivo imaging kamer, met zijn hoofd in de neus op de variëteit van de verdoving. Toepassing van optische zalf ter bescherming van de ogen tijdens de beeldvorming. Naar image meerdere muizen, zwart licht klankbord te gebruiken om te voorkomen dat de weerkaatsing van het licht naar aangrenzende muizen.</li>
	</ol></li> <li>Klik op de &#34; verwerven &#34; knop voor voorsprong naar de Beeldacquisitie 10 min na injectie van de D-luciferine.</li>
	<li>Herhaal stap 3.3-3.5 naar image meer muizen.</li>
	<li>Na de in vivo image aquisition, euthanaseren de muizen bij CO 2 inademing gevolgd door cervicale dislocatie, ter bevestiging van de dood. De ex vivo-analyses uit te voeren.
	<ol><li>Als de analyse ex vivo wordt uitgevoerd na 20 min, herhaalt u de luciferine injectie (stap 3.3) voordat het opofferen van de muizen, het signaal BLI 20 min kan afnemen na de injectie luciferine.</li>
	</ol></li> <li>Ontleden de muizen om te verwijderen van de hele gastro-intestinale tractus (dat wil zeggen, van de maag tot en met het rectum), mesenterische lymfeklieren (MLN), longen, milt en lever. Plaats ze in petrischalen met behulp van Tang en schaar 2 , 4.</li>
	<li>Plaats de petrischaal met de transplanteren orgels in de beeldvorming kamer en verwerven BLI beelden per stappen 3.1-3.6.</li>
	<li>Na de overname beeld overbrengen in het transplanteren organen specimen mallen met optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde. Cryofreeze de mallen op-80 ° C, met behulp van droogijs. Uitvoeren van immunohistochemistry met behulp van anti-luciferase antilichaam op bevroren secties ter bevestiging van de aanwezigheid van hMSCs 16.</li>
	<li>Gebruiken voor de kwantificering van de lichtintensiteit, de regio van belang (ROI) instrument in het hulpprogramma palet 16 , 19. Selecteer het frame van de ROI en verplaatsen naar regio van belang op de afbeelding. Klik op &#34; ROI meting &#34; en sla de gegevens in SEQ-bestandsindeling. De gegevens exporteren als een txt-bestand en het gebruik van statistische software voor uit te voeren statistische basistests kwantificering 16.</li>
</ol>

<ol><li>Duijvestein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+with+interferon-gamma+enhances+the+therapeutic+activity+of+mesenchymal+stromal+cells+in+animal+models+of+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis.</a> Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).</li>
<li>Sala, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cells+Reduce+Colitis+in+Mice+via+Release+of+TSG6%2C+Independently+of+Their+Localization+to+the+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine.</a> Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).</li>
<li>Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+alleviate+experimental+colitis+by+inhibiting+inflammatory+and+autoimmune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses.</a> Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).</li>
<li>Dave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+for+murine+interstitial+cells+of+cajal+suppress+cellular+immunity+and+colitis+via+prostaglandin+e2+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion.</a> Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).</li>
<li>Manieri, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosally+transplanted+mesenchymal+stem+cells+stimulate+intestinal+healing+by+promoting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis.</a> J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).</li>
<li>Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+on%2Foff+regulation+of+TNF+biosynthesis+in+mice+lacking+TNF+AU-rich+elements%3A+implications+for+joint+and+gut-associated+immunopathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies.</a> Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).</li>
<li>Abraham, C., Cho, J. H. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra0804647">Inflammatory bowel disease.</a> N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).</li>
<li>Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+inflammatory+bowel+disease+and+molecular+targets+for+biologics%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics.</a> Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).</li>
<li>Dave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cell+Therapy+for+Inflammatory+Bowel+Disease%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).</li>
<li>Panes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+allogeneic+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+%28Cx601%29+for+complex+perianal+fistulas+in+Crohn%27s+disease%3A+a+phase+3+randomised%2C+double-blind+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial.</a> Lancet. 388 (10051), (2016).</li>
<li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+hMSCs+improve+myocardial+infarction+in+mice+because+cells+embolized+in+lung+are+activated+to+secrete+the+anti-inflammatory+protein+TSG-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6.</a> Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).</li>
<li>Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+in+vivo+distribution+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+after+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion.</a> Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).</li>
<li>English, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mesenchymal+stromal+cell+immunomodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation.</a> Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).</li>
<li>Pizarro, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMP1%2FYitFc+mouse+strain%3A+a+spontaneous+model+of+Crohn%27s+disease-like+ileitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis.</a> Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).</li>
<li>Lennon, D. P., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).</li>
<li>Lin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+transplantation+and+long-term+engraftment+of+intra-arterially+delivered+clonally+derived+mesenchymal+stem+cells+to+injured+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow.</a> Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).</li>
<li>Dennis, J. E., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+ceramic+vehicles+for+rat-marrow-derived+%28Rattus+norvegicus%29+osteogenic+cell+delivery%3A+effects+of+pre-treatment+with+fibronectin+or+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Implantol%22%5BJournal%5D)">Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin.</a> J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).</li>
<li>Lin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+lentiviral+transduction+of+human+mesenchymal+stem+cells+that+preserves+proliferation+and+differentiation+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities.</a> Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).</li>
<li>Love, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mesenchymal+stem+cell+transplant+by+bioluminescence+and+PET%5BTitle%5D)+AND+%22PET.+J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET.</a> PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).</li>
<li>Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cells+with+osteogenic+potential+from+human+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow.</a> Bone. 13 (1), 81-88 (1992).</li>
<li>Ishizaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-arterial+cell+transplantation+provides+timing-dependent+cell+distribution+and+functional+recovery+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke.</a> Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).</li>
<li>Schenk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+chemotactic+protein-3+is+a+myocardial+mesenchymal+stem+cell+homing+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor.</a> Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).</li>
<li>Hayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+implantation+of+mesenchymal+stem+cells+has+beneficial+effects+on+healing+of+experimental+colitis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).</li>
<li>Kodani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+colonoscopy+in+mice+to+evaluate+the+severity+of+colitis+and+colorectal+tumors+using+a+validated+endoscopic+scoring+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system.</a> J. Vis. Exp. (80), e50843(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze studie beschrijft een nieuwe techniek voor de echografie-geleide intracardiac injectie van hMSCs in een kleine-intestinale muismodel van experimentele CD. Deze techniek is zeer hoog tarief van overleving en succes, als het traject van de naald kan worden aangepast op basis van real-time, hoge resolutie beelden van de muis linker ventrikel, geboden door de echografie. Het voordeel van de levering aan het linkerventrikel is dat hMSCs worden vervolgens verdeeld tijdens arterially en veneuze circulatie, dus het vermijde...

Ziekte van Crohn (CD) is een gemeenschappelijk chronische ontstekingsziekte van de kleine en grote darmen en wordt beschouwd als het resultaat zijn van een ongepaste reactie van het immuunsysteem van de gastheer intestinale microben7,8. Recente studies hebben aangetoond dat zowel menselijke als lymfkliertest mesenchymale stamcellen (MSCs) ontsteking in muismodellen van darmontstekingen1,,3,,4,5kunt onderdrukken. Er zijn meerdere lopende klinische proeven die gebruikmaken van menselijke MSCs afgeleid van beenmerg of adipeus weefsel voor de behandeling van patiënten met inflammatoire darmziekte (IBD), waarin CD9. Twee routes voor MSC therapie zijn gebruikt in deze klinische tests: een gaat de systemische infusie (dat wil zeggen, intraveneus) van MSCs voor luminal IBD (inclusief CD), en anderzijds impliceert de gelokaliseerde toepassing/injectie van stamcellen in de fistel darmkanaal van patiënten met perianal CD. In een recente meta-analyse van MSC therapie voor IBD, systemische (dat wil zeggen, intraveneuze) MSC therapie voor luminal IBD (inclusief CD) is doeltreffend bij maximaal 40% (95% CI: 7-79%) van de patiënten, terwijl de werkzaamheid veel hoger, op 61 was % (95% CI: 36-85%), wanneer de MSCs lokaal waren in de zieke CD fistel9geïnjecteerd. Een recente fase III multicentrische gerandomiseerde placebo-gecontroleerde trial van allogene obesitas stamcellen geïnjecteerd rechtstreeks in de perianal fistel van CD patiënten toonde statistisch significante klinische en radiologische bewijs van perianal fistulae genezing, bevestigen de bevindingen van de meta-analyse-10. De redenen voor de lage werkzaamheid van MSC therapie intraveneus gegeven voor luminal CD onvoldoende is onderzocht kan, maar één reden de ontoereikende homing van MSCs op de site van ontsteking. Lymfkliertest studies in modellen van Colon ontsteking hebben aangetoond dat slechts een klein percentage van de MSCs (1-5%) intraveneus geïnjecteerd bereiken de ontstoken darm; de resterende MSCs worden gefilterd door de longen (first-pass effect)1,2 ,5,11,12. Meerdere lymfkliertest onderzoeken hebben daarom de intraperitoneaal route (i.p.) gebruikt voor MSC beheer in diermodellen voor colitis4. Zij hebben echter ook aangetoond dat slechts een klein deel van de cellen bereiken en engraft van de dikke darm en dat de werkzaamheid is gerelateerd aan de secretie van oplosbare paracrine factoren, zoals Tumornecrosefactor-afleidbare gene 6 protein (TSG-6)2. Het MSC-mechanisme van immuunsuppressie en genezing impliceert een meervoudige aanpak waarbij paracrine; cel nabijheid-onafhankelijke factoren, zoals de GTS-6; en cel nabijheid-afhankelijke factoren, zoals geprogrammeerd dood-ligand 1 (PD-L1); of gekartelde 1. Daarom, MSC lokalisatie naar de site van ontsteking kan resulteren in hogere werkzaamheid9,13. In feite, toonde een recente studie dat MSCs direct ingeplant op de site van Colon schade geleid tot genezing door afscheidende angiogenese-bevordering van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF). Aan de andere kant, is een minimale genezend effect na intraveneuze injectie5geconstateerd. Het vergroten van hun lokalisatie naar de site van ontsteking (dat wil zeggen, de dunne darm in SAMP muizen), werd deze echografie-geleide intracardiac injectietechniek voor MSC toediening in het linkerventrikel ontwikkeld. Image-guided injectie garandeert een nauwkeurige injectie, die leidt tot een hoger tarief van succes en daalde naar morbiditeit en mortaliteit. Bovendien, de injectie van MSCs in het linkerventrikel aflevert arteriële circulatie, waar ze de ontstoken dunne darm voordat steeds gevangen in de longen kunnen bereiken.
In deze studie, werden menselijke beenmerg-afgeleide MSCs (hMSCs) gebruikt voor injectie in het SAMP-1/YitFc (SAMP) lymfkliertest model van CD14. SAMP is een goed gekarakteriseerd spontane lymfkliertest model van chronische ontsteking die kleine-intestinale ontsteking met bijna 100% doordringendheid14ontwikkelt. De ontsteking ontwikkelt in reactie op de microflora in het ontbreken van elke chemische, immunologische en genetische manipulatie en veel overeenkomsten vertoont met menselijke CD11. Geslacht en leeftijd-zoekwoorden ontsteking-vrije AKR/J (AKR) muizen, de muizen ouderlijk toezicht voor SAMP, werden gebruikt in deze studie.
De hMSCs waren geïsoleerd en uitgebreid in het laboratorium van het beenmerg (BM) monsters van normale, niet-geïdentificeerde donors verlangde nadat geïnformeerde toestemming gebruik gevalideerd en eerder gepubliceerd protocollen15,16. Na isolatie en expansie, de mogelijkheid van de MSC in osteogenic, adipogenic, en chondrogenic differentiatie in het laboratorium door meerdere testen15werd geëvalueerd. De osteogenic functionele test werd uitgevoerd door het implanteren van keramische kubussen van hydroxyapatiet/tricalciumfosfaat fosfaat matrix met hMSCs subcutaan van immuungecompromitteerde CB17-Prkdc SCID muizen17. De kubus assay toont osteogenesis en potentiële chondrogenesis en wordt beschouwd als de ultieme test voor het beoordelen van individuele MSC preparaten17. Om te visualiseren hMSCs in vivo na injectie, was lentivirus gewend transduce hMSCs met drievoudige reporter gene constructie die uit de firefly luciferase (fl), monomere rood fluorescerende eiwitten (mRFP) en herpes simplex virale thymidinekinase (ttk bestaat ), aangedreven door een gewijzigde myeloproliferatieve Sarcoom virus (mnd) promotor18. De firefly luciferase in de triple verslaggever is een enzym dat luciferine zet ingespoten om oxyluciferine in hMSCs en fotonen/wit licht produceert. Dit wordt gedetecteerd door de gevoelige charge - coupled apparaat (CCD) camera (bioluminescentie) in een in vivo optisch imaging systeem, waardoor de visualisatie van levende hMSCs bij muizen. Bioluminescentie imaging (BLI) is een gevoelige techniek die serieel kan worden gebruikt voor het bijhouden van de cellen en voor ex vivo analyse. Het gebruik van een sterke mnd promotor rijdt de continue uitdrukking voor de triple fusion reporter gene construct en zorgt voor de beeldvorming van geïnjecteerd hMSCs voor meer dan 16 weken19. De hMSCs zijn moeilijk te transduce en hebben een lage transductie rendement. Met behulp van een geoptimaliseerde protocol, de efficiëntie van de transductie hMSCs werd verbeterd en de expressie transgenic verbeterde18was. Met behulp van mRFP expressie (een van de triple reporter genen) op stroom cytometry, werd de mogelijkheid om transduce van hMSCs met een hoge efficiëntie tot 83% aangetoond. Differentiatie testen en in vivo kubus vitrotests aangetoond dat het vermogen van de getransduceerde hMSCs om te differentiëren in de chondrocyten, adipocytes en osteocytes17.

<table><tbody><tr><td>DMEM-LG&nbsp;&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31600-091</td><td></td></tr><tr><td>0.25% trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Proteamine Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4020-1G</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Goldbio</td><td>luck-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bobine Serum</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>175 cm tissue cutlure flasks</td><td>Corning</td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>75 cm tissue cutlure flasks</td><td>Corning</td><td>430720</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes</td><td>Crysalgen</td><td>23-2265</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Plus O.C.T. compound</td><td>Fisher HealthCare</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold Standard</td><td>Tissue-Tek&nbsp;</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-Pac HIV Expression Packaging System</td><td>GeneCopoeia</td><td>HPK-LvTR-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Povidone Ionidine swabs</td><td>Medline</td><td>MDS093901</td><td></td></tr><tr><td>Hair removal cream</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane&nbsp;</td><td>Piramal Helathcare&nbsp;</td><td>NDC 66794 013 25</td><td></td></tr><tr><td>Forceps&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors (Wagner)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Wagner 14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Puralube vet ointment</td><td>Puralube</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Aquasonic 100 ultrasound transmission gel</td><td>Parker laboratories</td><td>01 08</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>SAMP muizen</td><td>Cleveland Digestive Disease Research Core Centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKR muizen</td><td>Cleveland Digestive Disease Research Core Centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 770 imaging system</td><td>&nbsp;Visual Sonics, Toronto, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;IVIS spectrum series system&nbsp;</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living image software&nbsp;</td><td>CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triple reporter</td><td>Vriendelijk verstrekt door Dr. Zheng- Hong Lee, CWRU, (citatie 19)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

echografie-geleide intracardiac injectie van menselijke mesenchymale stamcellen toe homing aan de darm voor gebruik in lymfkliertest modellen van experimentele inflammatoire darmziekten

Ultrasound-guided Intracardiac Injection of Human Mesenchymal Stem Cells to Increase Homing to the Intestine for Use in Murine Models of Experimental Inflammatory Bowel Diseases

Ziekte van Crohn (CD) is een gemeenschappelijk chronische ontstekingsziekte van de kleine en grote darmen. Lymfkliertest en menselijke mesenchymale stamcellen (MSCs) immunosuppressieve potentieel hebben en is aangetoond dat het onderdrukken van ontsteking in muismodellen van darmontstekingen, hoewel de wijze van toediening hun homing en effectiviteit 1 beperken kan , 3 , 4 , 5. lokale toepassing voor MSCs tot Colon schade modellen is gebleken dat grotere werkzaamheid bij de verbetering van de ontsteking in de dikke darm. Echter, er is schaarste van gegevens over technieken ter verbetering van de lokalisatie van menselijke beenmerg-afgeleide MSCs (hMSCs) naar de dunne darm, de site van ontsteking in het SAMP-1/YitFc (SAMP) model van experimentele Crohn's disease. Dit werk beschrijft een nieuwe techniek voor de echografie-geleide intracardiac injectie van hMSCs in SAMP muizen, een goed gekarakteriseerd spontane model van chronische darmontstekingen. Geslacht en leeftijd-zoekwoorden, ontsteking-vrije AKR/J (AKR) muizen werden gebruikt als besturingselementen. Als u wilt analyseren het ook en de lokalisatie, hMSCs waren getransduceerde met een lentivirus met een drievoudige reporter. De drievoudige verslaggever bestond uit firefly luciferase (fl), voor bioluminescente imaging; Monomere rood fluorescerende eiwit (mrfp), voor het sorteren van de cel; en afgekapte herpes simplex virus thymidinekinase (ttk), voor positron emissie tomografie (PET) imaging. De resultaten van deze studie tonen dat 24u na de intracardiac toediening, hMSCs lokaliseren in de dunne darm van SAMP muizen in tegenstelling tot ontsteking-vrije AKR muizen. Deze roman, echografie-geleide injectie van hMSCs in het linkerventrikel van SAMP muizen zorgt voor een hoog slagingspercentage van levering van de cel, waardoor voor het snelle herstel van muizen met minimale morbiditeit en mortaliteit. Deze techniek zou een handige methode voor de verbeterde lokalisatie van MSCs in andere modellen van kleine-darmontstekingen, zoals TNFΔRE,6. Toekomstige studies zal bepalen als de verhoogde lokalisatie van hMSCs door intra-arteriële levering tot verhoogde therapeutische werking leiden kan.

Figuur 1 toont dat de hMSCs kan worden transduced met de triple verslaggever bij een hoge efficiëntie, behoud van de eigenschappen van de cel van de stam. Getransduceerde hMSCs kunnen worden gevisualiseerd in real-time door BLI (Figuur 1 c, Figuur 3). Deze roman, echografie-geleide injectie van hMSCs in het linkerventrikel van SAMP muizen zorgt voor een zeer hoog slagingspercentage van injectie, waar...

Lymfkliertest studies in modellen van Colon ontsteking hebben aangetoond dat een klein percentage (1-5%) van mesenchymale stamcellen (MSC) intraveneus geïnjecteerd of intraperitoneally de thuisbasis van de ontstoken dubbele punt1,2. Deze studie toont aan dat echografie-geleide intracardiac injecties van MSCs in verhoogde localization voor de darm resulteren.

Echografie-geleide Intracardiac injectie van menselijke mesenchymale stamcellen toe Homing aan de darm voor gebruik in lymfkliertest modellen van experimentele inflammatoire darmziekten

Crohn&#39;s disease (CD) is a common chronic inflammatory disease of the small and large intestines. Murine and human mesenchymal stem cells (MSCs) have ...

Het algemene doel van deze procedure is om echogeleide intracardiale injectie van menselijke uit het beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (HMSC) in een muismodel van experimentele ziekte van Crohn te gebruiken, om de homing van HMSC naar de darm waar te nemen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van inflammatoire darmziekten over de noodzaak voor verhoogde lokalisatie van HMSC in de dunne darm tijdens inflammatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een hoge succesrate van HMSC-aflevering faciliteert met minimale mobiliteit en mortaliteit van de muizen.Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden omdat meerdere variabelen de uitkomst van de procedure kunnen beïnvloeden. Dit vereist een uitgebreid begrip van de biologie van menselijke mesenchymale stamcellen bij de cursist. De procedures zullen worden gedemonstreerd door Paola Menghini, een postdoc uit ons laboratorium.Stel in een specifieke pathogeenvrije faciliteit het protocol van het echocardiogram-ultrasone beeldvormingssysteem voor muizen in en initialiseer de 30 megahertz transducer. Bevestig vervolgens het juiste

ultrasound-guided-intracardiac-injection-human-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Intramyocardial cel levering in muriene modellen van cardiovasculaire ziekten, zoals hypertensie of myocardiaal infarct, wordt veel gebruikt om het therapeutisch potentieel van verschillende celtypes in regeneratieve studies testen. Daarom zal een gedetailleerde beschrijving en een duidelijke visualisatie van deze chirurgische procedure helpen om de beperkingen en voordelen van cardiovasculaire cel therapeutische analyses in kleine knaagdieren te definiëren.

Intramyocardiale Cell Levering: Waarnemingen in Muizen Harten

Echocardiografie-geleide percutane intramyocardiale injectie vertegenwoordigt een efficiënte, betrouwbare en richtbare modaliteit voor de levering van genoverdracht agentia of cellen in muizen hart. Naar aanleiding van de stappen in dit protocol, kan de operator snel bevoegd in deze veelzijdige, minimaal invasieve techniek geworden.

Echogeleide Transthoracale intramyocardiale Injectie in Muizen

Nieuwe therapeutische strategieën in cardiale regeneratieve geneeskunde vereisen uitgebreide en gedetailleerde studies in grote preklinische diermodellen voordat zij kunnen worden beschouwd voor gebruik bij de mens. We laten hier zien een percutane contrast echocardiografie geleide intramyocardial injectietechniek bij konijnen, die is waardevol voor de hypothese testen van de werkzaamheid van dergelijke nieuwe therapieën.

Percutane Contrast echocardiografie geleide Intramyocardial injectie en cel levering in een grote preklinische Model

We hebben getracht een varkensmodel van hartfalen op te stellen dat werd veroorzaakt door linker slagaderblokkades en snelle pacing om het effect en de veiligheid van intramyocardiale toediening van stamcellen voor celgebaseerde therapieën te testen.

Vaststelling van een varkensmodel van post-myocard hartinfarct voor stamcelbehandeling

Stamcellen worden voortdurend onderzocht als mogelijke behandelingen voor personen met myocardiale schade, maar hun verminderde levensvatbaarheid en retentie in gewond weefsel kan hun werkzaamheid op lange termijn beïnvloeden. In dit manuscript beschrijven we een alternatieve methode voor stamcellevering in een murinemodel van ischemie reperfusieletsel.

Vertraagde intramyocardial levering van stamcellen na Ischemie Reperfusie Letsel in een Murine Model

Stamcelgebaseerde therapie is naar voren gekomen als een efficiënte strategie om gewonde hartweefsels te herstellen na een myocardinfarct. Wij bieden een optimale in vivo toepassing voor stamceltransplantatie met behulp van gelatinehydrogels die enzymatisch met elkaar verbonden kunnen zijn.

Intramyocardtransplantatie van MSC-Loading Injecteerbare Hydrogels na myocardinfarct in een Murine-model

Echogeleide celafgifte rond de plaats van myocardinfarct bij muizen is een veilige, effectieve en handige manier van celtransplantatie.

Echogeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocytenimplantatie bij myocardinfarct muizen

Intrafemorale injecties maken de implantatie van een klein aantal hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) mogelijk door de cellen direct in de beenmergholte te plaatsen. Hier beschrijven we een experimenteel protocol van intrafemorale injectie van menselijke HSPC's in immunodeficiënte muizen.

Intrafemorale injectie van menselijke hematopoëtische stam- en voorlopercellen in immuungecompromitteerde muizen 

Dit artikel presenteert een protocol voor de nauwkeurige echogeleide afgifte van vasculaire stamcellen aan de aortavaatwand. De techniek richt zich effectief op de vaatwand en bevordert vasculair herstel bij aorta-aneurysma's en dissecties.

Precisie-echogeleide stamcelafgifte voor vasculair herstel bij aortaaandoeningen

Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor echocardiografie-geleide intramyocardiale injecties in rattenmodellen van een myocardinfarct met behulp van een naald van 29 G x 88 mm. Deze techniek zorgt voor een robuuste, nauwkeurige en reproduceerbare toediening van therapeutische middelen rechtstreeks in de peri-infarctzone.

Echocardiografiegeleide injectie voor gerichte en betrouwbare intramyocardiale stamcelafgifte in een rattenmodel van een myocardinfarct

Leer echografie-geleide intracardiale injectie van menselijke mesenchymale stamcellen voor inflammatoire darmziekte-onderzoek bij muizen. Deze methode verbetert homing naar de darm met minimale mortaliteit.

Echografie-geleide Intracardiac injectie van menselijke mesenchymale stamcellen toe Homing aan de darm voor gebruik in lymfkliertest modellen van experimentele inflammatoire darmziekten (Video) | JoVE Journal

Echografie-geleide Intracardiac injectie van menselijke mesenchymale stamcellen toe Homing aan de darm voor gebruik in lymfkliertest modellen van experimentele inflammatoire darmziekten

Meer video's verkennen