Name: En Voorbereiding van Muis Bloedvaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Leer en face-immunofluorescentie van muizenbloedvaten voor vasculaire biologie. Deze methode maakt proteïnelokalisatie en celtype-identificatie mogelijk met confocale microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De onderzoeksactiviteiten van de auteurs worden ondersteund door subsidies van het Nationaal Instituut voor Gezondheid aan Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).

De protocollen voor de muizen gedeeltelijke halsslagaderatie en isolatie van de muis aorta en halsslagader voor gezicht immunostaining worden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IBT 2014-9231). 1. Linker Partieel Carotide Arterie Ligging <ol><li> Bereid de chirurgische ruimte door een 12 inch x 14 inch verwarmingsblok op de tafel te plaatsen en bedek het paneel en de tafelblad met een grote schone chirurgische drape. Stel de arm van de boomstand aan, zodat het stereomicroscoop zichtbaar is in het midden van het verwarmingspaneel. </li><li> Zet het verwarmingspaneel op de tafel aan en stel de 3-instelknop in op het gemiddelde warmtepeil. Bij deze temperatuurinstelling zal het oppervlak van de chirurgische plank (zie 1.6.1) 38-40 ° C zijn. <ol><li> Plaats een schone kooi op een ander verwarmingskussen. Zet het verwarmingspaneel aan zoals hierboven aangegeven. Deze kooi wordt gebruikt voor herstel na de operatie (zie 1.16) en huisvesting. </li></ol></li&gt; <li> Plaats op de chirurgische tafel een geautoclaveerd sterilisatiezakje met iris schaar (1 paar), weefselpincet (1 paar), supergreeppincet (2 paar), veerschaar (1 paar), stompe retractor (1 paar, 2,5 mm breed) , Ronde behandelde naaldhouder (1), gesteriliseerde 6-0 zijde hechting, katoenstippen applicators, mini katoen tipped applicators, chirurgische gordijnen en 2 &quot;x 2&quot; gaas sponzen. Plaats ook een squeeze fles met 70% ethanol en een andere chloorhexidine chirurgische scrubon, de chirurgische tafel. </li><li> Weeg een muis. Het lichaamsgewicht is nodig om de juiste hoeveelheid analgesie te bepalen, die direct voor de operatie wordt toegediend. </li><li> Plaats een muis in de inductiekamer. </li><li> Zet de zuurstoftank en de verdovingsverstuiver in om de muis in de inductiekamer te verdoving. Behoud het isofluraan niveau bij 2%. Het duurt 3-5 minuten voordat de muis stilstaat. <ol><li> Terwijl de muis anestheertGemonteerd, plaats een kleinere steriele chirurgische draperie (24 inch x 24 inch) onder de stereomicroscoop om een ​​chirurgisch oppervlak te creëren. Plaats dan een acrylchirurgisch bord (dat met 70% alcohol is gereinigd) op het gedrapeerde oppervlak. De chirurgische raad moet daarom op het verwarmingspaneel zijn, maar gescheiden door twee lagen chirurgische gordijnen. </li></ol></li><li> Wanneer de muis in de inductiekamer gaat verhuizen, overstappen de muis naar een pre-chirurgische voorbereidingsruimte en zet de neus in de neuskegel die verbonden is met de verdamper (2% isofluraan). Verwijder het haar rond het cervicale gebied met behulp van een elektrische trimmer of haarverwijderingslotion. We raden aan het verwijderen van lotion, omdat deze methode geen losse haarstukken produceert, die moeilijk uit het chirurgische gebied kunnen worden verwijderd. </li><li> Met de neuskegel op zijn plaats, beweeg de muis naar het chirurgische bord. <ol><li> Tape de rechter en linker voorpoten naar de chirurgische raad. Tape aan beide achterpoten touwtDaar aan de rechterkant van de muis. Dit veroorzaakt een lichte rotatie van het muislichaam, zodat de linkerzijde van het nekgebied van de muis beter wordt geplaatst voor de operatie. </li></ol></li><li> Desinfecteer het snijgebied met 70% alcohol, chloorhexidine chirurgische scrub, en opnieuw met 70% alcohol. Bedek de muis met een gesteriliseerde chirurgische drape, behalve het cervicale snijgebied. </li><li> Bevestig met de toon dat de muis volledig verdoofd is en analgesie (Caprofen 3-5 mg / kg) via intraperitoneale of subcutane injectie geeft. </li><li> Onder de dissectiemicroscoop maakt u een ventrale middenlijn incisie rondom het baarmoederhalsgebied met behulp van een scalpel of iris schaar. OPMERKING: we gebruiken een schaar omdat de werkafstand van de stereomicroscoop beperkt is, waardoor het moeilijk is om een ​​scalpel te gebruiken. </li><li> Ontsteek de linker gemeenschappelijke halsslagader (LCCA) door opzij te drukken en de speekselklieren die de bloedvaten aan de linkerkant van denimal. </li><li> Identificeer alle bloedvaten in het chirurgische veld ( Figuur 1 ). De LCCA bifurcates in de linker interne halsslagader (ICA) en de linker externe halsslagader (ECA). De oppervlakkige schildklierslagader (STA) komt voort uit de ECA aan de mediale kant. De oksipitale arterie (OA) komt meestal voort uit de ECA, maar bij sommige muizen komt het uit het ICA. </li><li> Lig alle arterie takken behalve de OA met behulp van gesteriliseerde 6-0 zijden hechting. Om dit te bereiken, maak de volgende twee ligaties. <ol><li> Verwijder het bindweefsel voor en onder de linker interne halsslagader (ICA) voorzichtig. Pak een stuk van precieze 6-0 zijden hechting (~ 2,5 cm) met tang en passeer het onder de slagader. Gebruik nog een paar tangjes, trek de hechting ongeveer 1/3 van de lengte en lig de slagader. </li><li> Verwijder het bindweefsel rond de linker externe halsslagader (ECA) op dezelfde manier als hierboven beschreven en maak een ligatie proximaal aan de linker superieure thyroïD slagader (STA) ( Figuur 1 ). Wees voorzichtig om geen zenuwvezels te beschadigen die binnen het chirurgische veld lopen. </li></ol></li><li> Wanneer deze ligaties zijn gemaakt, ga de speekselklieren terug naar de oorspronkelijke positie en hydrateer het chirurgische veld door 2-3 druppels steriele zoutoplossing te plaatsen. Sluit de huid met 6-0 gecoate vicryl suturen. </li><li> Plaats na de operatie de muis in de voorverwarmde kooi (zie 1.2.1). De muis moet binnen 5 minuten wakker worden en beginnen rond te lopen. Zodra bevestigd dat de muis normaal gesproken optreedt, breng de kooi naar de dierenhuis. </li><li> Let op de muis dagelijks voor de eerste 3 dagen van herstel. De muis kan worden gehouden zolang het experiment vereist onder de verschillende omstandigheden waarvoor het experimentele protocol vereist is. Een gezichtspreparaat kan op elk moment na de operatie worden gemaakt. </li></ol> 2. En Face Immunostaining Face <ol><li> Euthaniseer een muis met CO 2 door inademing overdosis. </li><li>Tape de muis in een rugkant (buikzijde omhoog) positie op een dissectenbord. </li><li> Ontsteek de buikholte door middel van een middelste snede met behulp van een iris schaar. </li><li> Ontsteek de thoracale holte door de ribben lateraal in de sternum te snijden. </li><li> Maak een nick in de vena cava of snijd een van de femorale slagaders voor het aftappen van bloed. </li><li> Voeg een 26 G-naald in aan de zwaartekracht van de zwaartekracht (120 cm waterdruk) in de top van de linker ventrikel en vul het circulatiesysteem met zoutoplossing met heparine (40 U / mL) in. Ga door met de perfusie totdat de zout die uit de snede stroomt, wordt duidelijk. </li><li> Schakel het perfusiesysteem van zoutoplossing over naar de fixatieoplossing die 4% paraformaldehyde bevat in PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) en vervolg nog 5 minuten meer perfusie. </li><li> Oog de aorta en beide linker en rechter halsslagaders door middel van stompe scharen en tangjes, en plaats in een 50 ml conische buis die het fixatief op ijs bevat. </li><li&gt; Breng het vat in een Petri-schotel met PBS onder een dissectiemicroscoop, en verwijder de vet- en bindweefsels die aan de aorta- en carotisaderaders zijn gehecht. Scheid de aorta en halsslagader in de lengterichting en verdeel het endotheel ( Figuur 2 ). </li><li> Verplaats elk vaartuig afzonderlijk naar een putje van een 12-putjesplaat die 0,5 ml van een permeabiliserende oplossing (0,1% Triton X-100 in PBS) per put bevat. Permeabiliseer de bloedvaten gedurende 10 minuten met roeren bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Wassen kort met PBS. </li><li> Om niet-specifieke antilichaambindingsplaatsen te blokkeren, incubatie bloedvaten in 10% normaal serum uit de diersoorten waarin de secundaire antilichamen zijn gemaakt, gedurende 30 minuten in TTBS (Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 2,5% Tween 20) Rocking bij RT. </li><li> Incubeer vaten met de primaire antilichamen die geschikt zijn in TTBS met 10% normaal serum (zoals hierboven beschreven), gedurende de nacht, met een schommeling bij 4 ° C. Het niveauVerdunning moet worden bepaald voor elk antilichaam. </li><li> Voer de volgende controle-kleuring uit. <ol><li> Incubeer vaten met TTBS in plaats van een primair antilichaam gevolgd door incubatie met een secundair antilichaam. </li><li> Incubeer vaten met TTBS die niet-immuunsysteem (of voorimmuun) serum of Ig van hetzelfde dier (soorten) bevatten waarin primaire antilichamen zijn gemaakt, gevolgd door incubatie met een secundair antilichaam. </li><li> Verwijder de incubatie met een secundair antilichaam. Deze controle-monsters moeten op dezelfde manier worden behandeld en tegelijkertijd wanneer het vlek met specifieke antilichamen wordt uitgevoerd. </li></ol></li><li> Was de bloedvaten 3 keer met TTBS gedurende 10 minuten elk met rocking bij RT. </li><li> Incuberen met fluorescent gelabelde secundaire antilichamen die geschikt zijn in TTBS met 10% normaal serum (zoals hierboven beschreven) gedurende 1 uur bij roeren bij RT. Nucleaire kleuring met DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool) kan tegelijkertijd eenT in dit stadium door 1/5000 volumes van een DAPI voorraadoplossing toe te voegen die 5 mg / ml DAPI in H20 bevat. </li><li> Was 10 keer met TTBS gedurende 10 minuten elk met rocking bij RT. </li><li> Spoel kort in PBS. </li><li> Plaats een druppel van het anti-vervagen reagens op een afdekglas (22 mm x 50 mm) en plaats een bloedvat op het afdekglas met het endotheel naar beneden gericht. </li><li> Plaats een glijglas (22 mm x 75 mm) op het bloedvat terwijl er geen bubbels worden gevangen. </li><li> Plaats de glijbaan op een schoon laboratoriumdoekje ( bijv. Kimwipe) en bedek de glijbaan met twee stukken laboratoriumafval. Plaats voorzichtig 3,5 kg gewicht ( bv. Gebruik een fles water op een dik boek.) Op de glijbaan voor maximaal 5 minuten om het monster van het bloedvaatje te platen. </li><li> Verwijder het gewicht en veeg de overtollige oplossing van de deklaag af. </li><li> Breng nagellak aan op de 4 hoeken van de deklaag, plaats de glijbanen in een glijbaan, bedek de zijde omhoog en blijf in het donker bij RT(Of 4 ° C) &#39;s nachts. Dit proces fladder het weefsel verder en maakt het makkelijker om microscopie te maken bij hoge vergrotingen. </li><li> Verzegel de deklaag volledig met nagellak. </li><li> Voer de microscopie uit zodra de nagellak droog is. </li><li> Sla indien nodig glijbanen op -20 ° C. </li></ol>

<ol><li>Jelev, L., Surchev, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+simple+technique+for+en+face+endothelial+observations+using+water-soluble+media+-%27thinned-wall%27+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations.</a> J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).</li>
<li>Neill, J. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1803374/">The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis.</a> Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).</li>
<li>Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+examining+the+endothelial+cytoskeleton+in+situ+using+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence.</a> J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).</li>
<li>Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13576293">The regeneration of aortic endothelium.</a> J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).</li>
<li>Sade, R. M., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((En+face+stripping+of+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">En face stripping of vascular endothelium.</a> Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).</li>
<li>White, G. E., Gimbrone, M. A. Jr, Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+expression+of+stress+fibers+in+vascular+endothelial+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ.</a> J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).</li>
<li>Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+modulation+of+endothelial+F-actin+microfilaments+by+experimental+alterations+in+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclero%22%5BJournal%5D)">In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress.</a> Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).</li>
<li>Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+monocyte+subpopulations+in+murine+atherosclerotic+plaques+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy.</a> Plos ONE. 7 (9), 244823e(2012).</li>
<li>Chèvre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+imaging+of+intravascular+atherogenic+inflammation+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice.</a> Circ Res. 114, 770-779 (2014).</li>
<li>Heo, K. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+flow-activated+p90RSK+kinase+accelerates+atherosclerosis+by+inhibiting+SENP2+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).</li>
<li>Le, N. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crucial+role+for+p90RSK-mediated+reduction+of+ERK5+transcriptional+activity+in+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ%22%5BJournal%5D)">A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> Circ. 127, 486-499 (2013).</li>
<li>Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+composition+of+stress+fiber-plasma+membrane+attachment+sites+in+endothelial+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ.</a> Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).</li>
<li>Nigro, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21173104">Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice.</a> J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).</li>
<li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).</li>
<li>Jinguji, Y., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.3109/10623329409024632">Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery.</a> Endothelium. 2, 35-47 (1994).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/srep34331">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331(2016).</li>
</ol>

Bij het hanteren van muisbloedvaten is het belangrijk om te onthouden dat het endothelium breekbaar is en dat een overmatige mechanische kracht endothelcellen zal beschadigen. Bijvoorbeeld, de endotheelcellen breken of losmaken van de vaatwand als het vat te krachtig wordt geperfueerd, wat gemakkelijk kan gebeuren wanneer de vaatwasser wordt geperfuseerd met een handbediende spuit. Om constante perfusiedruk te verkrijgen, gebruiken we een zwaartekracht perfusie systeem met een druk van 120 c...

Voor histopathologische studies door middel van lichtmicroscopie worden drie-dimensionale stukjes biologische weefsels routinematig verwerkt voor paraffine-inbedding, gevolgd door doorsneden en kleuring. Een weefselmonster die paraffine-ingebed is, kan in alle drie de afmetingen meerdere millimeter zijn. Voor de lichtmicroscopie moet het eerst eerst worden gesneden zodat het licht door kan gaan en vervolgens wordt gekleurd zodat het dunne gedeelte voldoende contrast biedt voor afbeelden. Omdat gesneden specimens meestal 5-10 μm dik zijn, ziet men slechts een kleine deel van het hele monster in twee dimensies tegelijk. Het is mogelijk om opeenvolgende secties te verzamelen en, na het afbeelden van elke sectie afzonderlijk, computerondersteunde reconstructie van de 3D-beelden uit te voeren, maar dit is inderdaad een vervelende baan. Histopathologie van bloedvaten, vooral voor het bestuderen van de pathogenese van atherosclerose, biedt unieke problemen. Atherosclerose is een geconcentreerde ziekte die zich ontwikkeltLokaal in gebieden waar verstoorde bloedstroom optreedt. Bovendien wordt de ziekte geïnitieerd binnen de intima, een dun weefsel dat bestaat uit een monolaag van endotheelcellen en extracellulaire matrix, van grote slagaders. Om deze redenen is het een uitdaging om vroege letsels te lokaliseren en te bestuderen met behulp van doorsnede bloedvaten, omdat men de lesion gemakkelijk kan missen. Zelfs als een sectie een ziek gebied omvat, ziet men slechts een 5-10 μm portie dat endotheelcellen en andere vaatwandcellen bevat in de media en adventitia. Met complete voorbereiding van een gezicht (uitgesproken en fäs) kunnen we een breed oppervlak van het bloedvatoppervlak onderzoeken, zoals de hele aorta van de aortische wortel helemaal naar beneden naar de gewone hartslagaders. Door gebruik te maken van een dergelijk specimen gebleekt met specifieke antilichamen en andere specifieke probes, kan men de locatie van letsels bepalen en ook waar verschillende moleculaire gebeurtenissen zich voordoen in endotheelcellen in combinatie met wiDe atherogenese zoals veranderingen in de expressie, lokalisatie en posttranslational modificaties van eiwitten. Naast het bestuderen van atherogenese wordt de endotheliale celvorm waargenomen in een gezichtspreparatie gebruikt als een indicator van het regionale tijdgemiddelde bloedstroompatroon. Dergelijke gegevens zijn belangrijk voor het bestuderen van mechanische signalering van endotheelcellen in situ. Voor dit doel zijn routine histologische dwarsdoorsnede bloedvaten niet bruikbaar. Zo is het voor vasculaire geneeskunde en biologie bijzonder belangrijk om een ​​techniek te verkrijgen voor het maken van een gezichtspreparatie van bloedvaten waarmee men een breed gebied van het vaatoppervlak evenals de diepere ondergronds van het vat kan waarnemen. Zoals door Jelev en Surchev 1 beoordeeld, hebben vasculaire biologen verschillende methoden ontwikkeld om de voering van bloedvaten en gezicht te waarnemen. Enkele ingenieuze methoden werden ontwikkeld in de jaren 1940 en 1950. Met behulp van deze methoden waren ze<html> In staat zijn om de fundamentele organisatie van endotheelcellen die het inwendige oppervlak van de bloedvaten regelen te bestuderen. Vanwege de wijze waarop deze en-gezichtspreparaten worden voorbereid (de zogenaamde Hautchen methode 2 , 3 , 4 of afscheiding van het vaatoppervlak 5 ) en de manier waarop het monster werd gekleurd, was het niet altijd mogelijk om ononderbroken morfologische Informatie van het vaartuigoppervlak in de dieper gebieden van de bloedvatmuur. Voorbereiding van de volledige berg- en gezichtsbehandeling gecombineerd met immunofluorescentievervuiling liet ons toe om niet alleen de endotheliale celmorfologie en eiwituitdrukking en lokalisatie in deze cellen te bestuderen, maar ook dergelijke studies uit te breiden naar het subendotheliale gebied van de vatwand. Vroege studies met behulp van bloedvaten en gezichtspreparaten werden in de jaren &#39;80 van 6 tot en met 19 gebleken immunoflures verschenen .F &quot;&gt; 7. Met de komst van laserscanning-confocale microscopie en recentere multiphoton-microscopie, kan men nu in-focusbeelden van de bloedvatwandstructuur verkrijgen in immunofluorescent gekleurde en gezichtsvatenmonsters, evenals het vaatnetwerk in levende dieren 8 , 9 , 10 , 11. Deze computergebaseerde beeldtechnieken creëren optische doorsnedebeelden in focus, en bij het opmaken van dergelijke beelden kan men gereconstrueerde 3D-beelden van de vaatwand en het vaatnetwerk in weefsels verkrijgen. Kan beelden genereren van een sectie die langs de Z-as van de gereconstrueerde afbeelding 12 , 13 is gemaakt . In dit artikel zullen we een methode illustreren voor het voorbereiden van gezichtspreparaten van de muis aorta en de halsslagader voor immunofluorescente kleuring. En gezichtspreparatenKan worden gemaakt, zelfs nadat deze vaten experimenteel zijn gemanipuleerd. Bijvoorbeeld kan een carotis-arterie gedeeltelijk geligeerd worden en dan een een-gezichtsbereiding gemaakt na een dergelijke operatie. Om deze reden zullen we in dit artikel ook beschrijven hoe we een gedeeltelijke ligatie op de halsslagader doen. Vergeleken met het maken van soortgelijke preparaten van grotere dieren, zoals ratten, konijnen en mensen, zijn muisvaten klein van grootte en fragiel, waardoor er extra zorg nodig is om te behandelen tijdens chirurgische isolatie van vaten en ze voor te bereiden op antilichamen kleuring en microscopie. Omdat het meest gebruikte diermodel voor genetische modificatie de muis is, wordt het van groot belang dat veel onderzoekers muisvaten hanteren zonder ze te beschadigen. In dit manuscript beschrijven we hoe u de bloedvaten van de muis moet behandelen bij het maken van een gezichtspreparatie van de aorta en de hartslagader. Voor de demonstratie zullen we wildtype C57 / b6 muizen gebruiken.

<table><tbody><tr><td>0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500 mL bag</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9788429</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>12556005</td><td></td></tr><tr><td>6-0 coated vicryl suture</td><td>Ethicon</td><td>J833G</td><td></td></tr><tr><td>AF488 goat anti-rat IgG&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11006</td><td></td></tr><tr><td>AF546 goat anti-rabbit IgG&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD144 (Ve-Cad)</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG</td><td>Santa Cruze Biotechnology</td><td>Sc-8304</td><td></td></tr><tr><td>Aoto Flow System</td><td>Braintree Scientific</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Wrap. 24 inch x 24 inch</td><td>Cardinal Health</td><td>4024</td><td></td></tr><tr><td>Blunt retractors, 2.5 mm wide</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-10</td><td></td></tr><tr><td>Caprofen (Rimadyl)&nbsp;</td><td>zoetis</td><td>NADA#141-199</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine Scrub, 2%</td><td>Med-Vet International</td><td>RXCHLOR2-PC</td><td></td></tr><tr><td>Curity gauze sponges 2 x 2</td><td>Cardinal Health</td><td>KC2146</td><td></td></tr><tr><td>Electric heating pad, 12 x 14</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0667724</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass 22 mm x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393059</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-18</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Equitech-Bio</td><td>GS05</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td><td>Santa Cruze Biotechnology</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade mountant with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P-36935</td><td></td></tr><tr><td>Puritan cortton swabs</td><td>VWR</td><td>10806-005</td><td></td></tr><tr><td>Puritan Mini cotton tipped aplicators</td><td>VWR</td><td>82004-050</td><td></td></tr><tr><td>Round handled Needle Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>Silk Suture 6/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5601</td><td></td></tr><tr><td>Strabismus Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14075-09</td><td></td></tr><tr><td>Super Grip Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>Transparent Dressing</td><td>Cardinal Health</td><td>TD-26C</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC327371000</td><td></td></tr></tbody></table>

en voorbereiding van muis bloedvaten

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Afdelingen van paraffine ingebedde weefsels worden routinematig gebruikt voor het bestuderen van weefselhistologie en histopathologie. Het is echter moeilijk om te bepalen wat de driedimensionale weefselmorfologie uit dergelijke secties is. Daarnaast kunnen de onderzochte secties van de weefsels niet het gebied bevatten in het weefsel dat nodig is voor het lopende onderzoek. Deze laatste beperking belemmert histopathologische studies van bloedvaten, aangezien vasculaire laesies op een gefocuste manier ontwikkelen. Dit vereist een methode waarmee we een breed gebied van de bloedvatmuur kunnen onderzoeken, van het oppervlak naar de diepe gebieden. Een volledige voorbereiding van de bloedvaten voldoet aan deze eis. In dit artikel zullen we aantonen hoe u een gezichtspreparatie van de muis aorta en halsslagader maakt en immunofluorescente ze voor confocale microscopie en andere soorten fluorescentie gebaseerde beeldvorming kunt vinken.

Een typisch en gezicht immunofluorescentiebeeld van het endothelium is getoond in figuur 3 . Dit beeld toont een enkele optische sectie van een aorta van de muis die dichtbij de opening van een intercostale slagader (het grote donkere ei-vormige gebied) wordt geplaatst. De aorta was dubbelkleurig met anti-VE-cadherine (groen) en anti-VCAM-1 (vasculaire celadhesiemolecule-1) (rood). Elke endotheliale cel wordt geschetst met een groene lineaire kleuring bij de linker hecht...

Een procedure voor het maken van een gezichtspreparatie van de muizencarotisarterie en aorta wordt beschreven. Dergelijke preparaten, wanneer immunofluorescent gekleurd met specifieke antilichamen, ons in staat stellen om lokalisatie van eiwitten en identificatie van celtypen in de gehele vaatwand door confocale microscopie te bestuderen.

En Voorbereiding van Muis Bloedvaten

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van de aorta en de halsslagader van de muis voor en face immunokleuring na ligatie van de linker halsslagader. Deze methode stelt ons in staat om de organisatie, de expressie van individuele eiwitten en de mogelijke toestand van antrale cellen en andere vasculaire cellen te bestuderen met immunokleuringsmethoden. En face preparaten maken de analyse van grote gebieden over bloedvaten mogelijk voor de beoordeling van regionale verschillen in de expressie van diverse normale en mogelijke celparameters.De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Quaico, een microchirurg in onze groep. Begin met het plaatsen van de geanestheseerde muis in rugligging op een chirurgische plank. Na bevestiging van het uitblijven van een reactie op een knijptest in de teen, worden de voorpoten in uitgestrekte positie aan de plank taped en beide achterpoten naar de rechterzijde van de muis, om de linkerzijde van de nek vrij te maken.Verwijder het haar rond het cervicale gebied en desinfecteer de blootgestelde huid. Bedek de muis met een gesteriliseerd chirurgisch laken met een opening over het operatiegebied en breng zalf aan op de ogen van het dier.

en-face-preparation-of-mouse-blood-vessels

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een methode voor het labelen van embryonale huid en thymus bloedvaten.

Een methode voor het labelen van bloedvaten in Embryonic Muizen

This video demonstrates a method for isolating the endothelial tubes from mouse cerebral parenchyma. Through a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation, the process yields an intact tube with endothelial cells.

Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles

Een<em&gt; In vivo</em&gt; Assay naar Blood Vessel Permeabiliteit Test

We beschrijven een matrigel-plugtest om het angiogeen potentieel van een pool van factoren te illustreren die worden afgescheiden door kankercellen, met behulp van twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten, echografie en endomicroscopie. De matrigel, een buitencelmatrix (ECM)-nabootsende gel, wordt gebruikt om de gastheer (muis) te introduceren met angiogeen factoren die worden afgescheiden naar het geconditioneerde medium...

Monitoring Functionaliteit en morfologie van vaatstelsel aangeworven door gesekreteerd door Snelgroeiende Tumor genererende cellen

We beschrijven de isolatie van de extracellulaire matrix van het hart van C57Bl/6J controlemuizen, muizen met een strakke huid en muizen met een strakke huid behandeld met het IRF5 remmende peptide. We beschrijven ook de vasodilatatiestudies op de geïsoleerde vaten van C57Bl/6J, muizen met een strakke huid en muizen met een strakke huid behandeld met het IRF5 remmende peptide.

Vasodilatatie van geïsoleerde Schepen en de isolatie van de extracellulaire matrix van Tight-skin Muizen

Veel visie-bedreigende oogbeschadigingen en/of ziekten worden geassocieerd met disfunctionele retinale microvessels. De meting van de retinale arteriole reacties is daarom belangrijk om te onderzoeken van de onderliggende pathofysiologische mechanismen. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor muis retinale arteriole isolatie en voorbereiding te beoordelen van de effecten van vasoactieve stoffen op vasculaire diameter.

Voorbereiding stappen voor meting van reactiviteit in muis retinale arteriolen Ex Vivo

Hier presenteren we een protocol voor immunofluorescentie kleuring om de endotheliale cellen van de muis aorta direct te observeren. Deze techniek is nuttig bij het bestuderen van het cellulaire en moleculaire fenotype van endotheel cellen in verschillende stromingspatronen en in de ontwikkeling van atherosclerose.

Met en gezichts immunofluorescentie kleuring om vasculaire endotheel cellen direct te observeren

Dit protocol presenteert stappen om fluorescerende calciumbeelden van hersenverwarmende pericyten en bloedstroomgegevens van nabijgelegen bloedvaten in verdoofde muizen te verkrijgen en te analyseren. Deze technieken zijn nuttig voor studies van de fysiologie van muurschilderingscellen en kunnen worden aangepast om calciumtransiënten in elk celtype te onderzoeken.

Pericytencalcium en hemodynamische beeldvorming in de hersenen bij transgene muizen in vivo

Klassiek is het endocardium van de embryonale klep primordium van de muis geanalyseerd met behulp van transversale, coronale of sagittale secties. Onze nieuwe benadering voor en face, tweedimensionale beeldvorming van het endocardium in valvulogene gebieden maakt planaire polariteit en celherschikkingsanalyse van het endocardium mogelijk tijdens de ontwikkeling van de klep.

En Gezicht Endocardiale kussenvoorbereiding voor planaire morfogeneseanalyse bij muizenembryo's

We demonstreren chemisch inducerende grote bloedvatverwijding bij muizen als een model voor het onderzoeken van cerebrovasculaire disfunctie, dat kan worden gebruikt voor modellering van vasculaire dementie en de ziekte van Alzheimer. We demonstreren ook het visualiseren van het vaatstelsel door het injecteren van een siliconenrubbersamenstelling en het bieden van duidelijke visuele richtlijnen voor het meten van veranderingen in de grootte van bloedvaten.

Een visuele benadering voor het induceren van dolichoectasia bij muizen om door grote bloedvaten gemedieerde cerebrovasculaire disfunctie te modelleren

De pericyten in het retinale vaatstelsel werden onderzocht door middel van immunofluorescerende kleuring met van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β na retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine. Het gelabelde netvlies werd verder behandeld met de weefselopruimingsmethode en in zijn geheel gemonteerd voor het visualiseren van de driedimensionale beelden van pericyten rond het netvliesvaatstelsel onder een confocale microscoop.

3D-visualisatie van retinale vasculaire pericyten bij muizen door immunokleuring 

Leer en face-immunofluorescentie van muizenbloedvaten voor vasculaire biologie. Deze methode maakt proteïnelokalisatie en celtype-identificatie mogelijk met confocale microscopie.

En Voorbereiding van Muis Bloedvaten

Meer video's verkennen