Expressieprofilering met microarrays

DNA-microarrays zijn veelgebruikte hulpmiddelen om tegelijkertijd de expressie van veel verschillende genen te meten. Ze bestaan uit duizenden sondes—elke sonde vertegenwoordigt een ander gen—geïmmobiliseerd op “chips” of dia's, en zijn gebaseerd op complementaire hybridisatie om genexpressie in verschillende biologische omstandigheden te evalueren.

Deze video bespreekt de basisprincipes van microarray-technologie, een protocol voor genexpressieprofilering met behulp van microarrays, en enkele actuele toepassingen.

Laten we beginnen met de principes van genexpressieprofilering en microarray-technologie te bespreken.

Een van de vroegste methoden die zijn ontwikkeld om genexpressie in biologische monsters te beoordelen, is Northern blotting, waarbij specifieke RNA-moleculen worden “geprobeerd” die op membranen zijn geïmmobiliseerd. “Vrij zwevende” sondes herkennen complementaire RNA-sequenties in het monster, en worden meestal gelabeld met radioactieve of fluorescerende moleculen zodat ze kunnen worden gevisualiseerd.

Vooruitgang in microfabricage, genoomsequencing en andere technologieën heeft geleid tot de ontwikkeling van de microarray-biochip. Net als Northern blots zijn microarrays gebaseerd op het principe van complementaire binding tussen sonde- en monsternucleïnezuursequenties. In tegenstelling tot Northerns, zijn het echter de oligonucleotide sondes die op een glazen plaat of chip zijn geïmmobiliseerd. De “vrij zwevende” monsters worden gegenereerd uit RNA dat is geïsoleerd uit cellen of organismen van belang, die omgekeerd worden getranscribeerd tot complementair of “c”-DNA. Dit kan direct worden gelabeld met fluorescerende moleculen, of de hoeveelheden kunnen verder worden geamplificeerd door in vitro transcriptie in cRNA. Het monster wordt vervolgens gehybridiseerd met de chip. Omdat sondes op microarrays die voor verschillende toepassingen zijn ontworpen, “sense” kunnen zijn, wat betekent dat hun sequenties in dezelfde richting zijn als het geëxprimeerde RNA van een organisme, of “antisense”, moeten onderzoekers ervoor zorgen dat de streng-directionaliteit van het monster complementair is aan die van de sondes.

De “ruwe” fluorescentie-intensiteitgegevens voor elke gen-specifieke stip op de chip kunnen vervolgens worden gekwantificeerd en verwerkt. De gegevens kunnen worden onderworpen aan verdere statistische tests, zoals de Student's t-test, om te bepalen of de fluorescentiesignalen—en dus expressieniveaus—voor een gen van belang significant verschillend zijn tussen twee celtypen of experimentele omstandigheden.

Onderzoekers kunnen deze gegevens ook gebruiken om genen te “clusteren” of groepen te vormen op basis van vergelijkbare expressiepatronen. Bijvoorbeeld, bij het vergelijken van expressiepatronen tussen twee celpopulaties, kunnen bepaalde genen worden gevonden die expressieveranderingen vertonen met ongeveer gelijke hoeveelheden in dezelfde richting, en zouden dus samen worden gegroepeerd. Onderzoekers kunnen deze relaties weergeven in een soort boomdiagram of “dendrogram” waarbij de hoogtes en arrangementen van “takken” aangeven hoe vergelijkbaar—of ongelijksoortig—genexpressiepatronen zijn. Dit type analyse kan inzicht geven in genrelaties, aangezien “geclusterde” genen mogelijk deelnemen aan dezelfde biologische paden.

Nu we de principes van microarray-methodologie hebben besproken, laten we een typische microarray-experiment bekijken.

Om de kwaliteit van het geïsoleerde RNA te waarborgen, moeten werkruimten en apparatuur worden behandeld met chemicaliën die RNases inactiveren—enzymen die anders RNA zouden vernietigen. Het RNA wordt vervolgens geïsoleerd uit monsters van belang en gezuiverd, en de concentratie en integriteit ervan worden bepaald door spectrofotometrie.

Dit monster-RNA wordt omgezet in cDNA, en vervolgens in cRNA. Vervolgens wordt het monster gelabeld met fluorescerende moleculen en gefragmenteerd, en de kwaliteit en kwantiteit ervan kunnen opnieuw worden gecontroleerd, waarbij ook de mate van fluorescerende markering kan worden beoordeeld.

Het gelabelde cRNA wordt vervolgens gemengd met “hybridisatie-oplossing” voordat het op een microarray wordt geladen. Om succesvolle hybridisatie te bevorderen, wordt een “mixer” op de chip geplaatst om “hybridisatiekamers” te vormen. De hybridisatiemix wordt vervolgens langzaam op de array aangebracht. Er moet voor worden gezorgd dat er geen luchtbellen ontstaan, omdat deze de binding van het monster aan specifieke gebieden op de microarray kunnen verstoren en leiden tot een vals negatief signaal. Nadat het monster is toegevoegd, worden de chips gedurende maximaal 24 uur op de juiste temperatuur geïncubeerd.

Na hybridisatie wordt de mixer van de chip verwijderd, ongebonden monster wordt afgewassen en de array wordt grondig gedroogd door centrifugatie in een gespecialiseerde, dia-houdende centrifuge. De gedroogde chip wordt in een microarray-scanner geplaatst en de machine wordt zo aangepast dat de helderste signalen die op een chip worden waargenomen niet oververzadigd zijn. De microarray wordt vervolgens gescand en er wordt een afbeelding van de hele chip gemaakt.

Zodra de chip is gescand, wordt het afbeeldingsbestand geladen in software voor gegevensextractie en beoordeeld op eventuele signaalafwijkingen. De gegevens die uit de microarray-afbeelding zijn geëxtraheerd, worden onderworpen aan een aantal statistische manipulaties, waaronder log₂ transformatie, waardoor onderzoekers gegevens numeriek kunnen weergeven in termen van voudverschilleningen of -verminderingen in genexpressie; evenals normalisatie, die rekening houdt met signaalverschillen tussen microarray-chips. Deze verwerkte gegevens kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd.

Nu