Expressieprofilering met microarrays
DNA-microarrays zijn veelgebruikte hulpmiddelen om tegelijkertijd de expressie van veel verschillende genen te meten. Ze bestaan uit duizenden sondes—elke sonde vertegenwoordigt een ander gen—geïmmobiliseerd op “chips” of dia's, en zijn gebaseerd op complementaire hybridisatie om genexpressie in verschillende biologische omstandigheden te evalueren.
Deze video bespreekt de basisprincipes van microarray-technologie, een protocol voor genexpressieprofilering met behulp van microarrays, en enkele actuele toepassingen.
Laten we beginnen met de principes van genexpressieprofilering en microarray-technologie te bespreken.
Een van de vroegste methoden die zijn ontwikkeld om genexpressie in biologische monsters te beoordelen, is Northern blotting, waarbij specifieke RNA-moleculen worden “geprobeerd” die op membranen zijn geïmmobiliseerd. “Vrij zwevende” sondes herkennen complementaire RNA-sequenties in het monster, en worden meestal gelabeld met radioactieve of fluorescerende moleculen zodat ze kunnen worden gevisualiseerd.
Vooruitgang in microfabricage, genoomsequencing en andere technologieën heeft geleid tot de ontwikkeling van de microarray-biochip. Net als Northern blots zijn microarrays gebaseerd op het principe van complementaire binding tussen sonde- en monsternucleïnezuursequenties. In tegenstelling tot Northerns, zijn het echter de oligonucleotide sondes die op een glazen plaat of chip zijn geïmmobiliseerd. De “vrij zwevende” monsters worden gegenereerd uit RNA dat is geïsoleerd uit cellen of organismen van belang, die omgekeerd worden getranscribeerd tot complementair of “c”-DNA. Dit kan direct worden gelabeld met fluorescerende moleculen, of de hoeveelheden kunnen verder worden geamplificeerd door in vitro transcriptie in cRNA. Het monster wordt vervolgens gehybridiseerd met de chip. Omdat sondes op microarrays die voor verschillende toepassingen zijn ontworpen, “sense” kunnen zijn, wat betekent dat hun sequenties in dezelfde richting zijn als het geëxprimeerde RNA van een organisme, of “antisense”, moeten onderzoekers ervoor zorgen dat de streng-directionaliteit van het monster complementair is aan die van de sondes.
De “ruwe” fluorescentie-intensiteitgegevens voor elke gen-specifieke stip op de chip kunnen vervolgens worden gekwantificeerd en verwerkt. De gegevens kunnen worden onderworpen aan verdere statistische tests, zoals de Student's t-test, om te bepalen of de fluorescentiesignalen—en dus expressieniveaus—voor een gen van belang significant verschillend zijn tussen twee celtypen of experimentele omstandigheden.
Onderzoekers kunnen deze gegevens ook gebruiken om genen te “clusteren” of groepen te vormen op basis van vergelijkbare expressiepatronen. Bijvoorbeeld, bij het vergelijken van expressiepatronen tussen twee celpopulaties, kunnen bepaalde genen worden gevonden die expressieveranderingen vertonen met ongeveer gelijke hoeveelheden in dezelfde richting, en zouden dus samen worden gegroepeerd. Onderzoekers kunnen deze relaties weergeven in een soort boomdiagram of “dendrogram” waarbij de hoogtes en arrangementen van “takken” aangeven hoe vergelijkbaar—of ongelijksoortig—genexpressiepatronen zijn. Dit type analyse kan inzicht geven in genrelaties, aangezien “geclusterde” genen mogelijk deelnemen aan dezelfde biologische paden.
Nu we de principes van microarray-methodologie hebben besproken, laten we een typische microarray-experiment bekijken.
Om de kwaliteit van het geïsoleerde RNA te waarborgen, moeten werkruimten en apparatuur worden behandeld met chemicaliën die RNases inactiveren—enzymen die anders RNA zouden vernietigen. Het RNA wordt vervolgens geïsoleerd uit monsters van belang en gezuiverd, en de concentratie en integriteit ervan worden bepaald door spectrofotometrie.
Dit monster-RNA wordt omgezet in cDNA, en vervolgens in cRNA. Vervolgens wordt het monster gelabeld met fluorescerende moleculen en gefragmenteerd, en de kwaliteit en kwantiteit ervan kunnen opnieuw worden gecontroleerd, waarbij ook de mate van fluorescerende markering kan worden beoordeeld.
Het gelabelde cRNA wordt vervolgens gemengd met “hybridisatie-oplossing” voordat het op een microarray wordt geladen. Om succesvolle hybridisatie te bevorderen, wordt een “mixer” op de chip geplaatst om “hybridisatiekamers” te vormen. De hybridisatiemix wordt vervolgens langzaam op de array aangebracht. Er moet voor worden gezorgd dat er geen luchtbellen ontstaan, omdat deze de binding van het monster aan specifieke gebieden op de microarray kunnen verstoren en leiden tot een vals negatief signaal. Nadat het monster is toegevoegd, worden de chips gedurende maximaal 24 uur op de juiste temperatuur geïncubeerd.
Na hybridisatie wordt de mixer van de chip verwijderd, ongebonden monster wordt afgewassen en de array wordt grondig gedroogd door centrifugatie in een gespecialiseerde, dia-houdende centrifuge. De gedroogde chip wordt in een microarray-scanner geplaatst en de machine wordt zo aangepast dat de helderste signalen die op een chip worden waargenomen niet oververzadigd zijn. De microarray wordt vervolgens gescand en er wordt een afbeelding van de hele chip gemaakt.
Zodra de chip is gescand, wordt het afbeeldingsbestand geladen in software voor gegevensextractie en beoordeeld op eventuele signaalafwijkingen. De gegevens die uit de microarray-afbeelding zijn geëxtraheerd, worden onderworpen aan een aantal statistische manipulaties, waaronder log2 transformatie, waardoor onderzoekers gegevens numeriek kunnen weergeven in termen van voudverschilleningen of -verminderingen in genexpressie; evenals normalisatie, die rekening houdt met signaalverschillen tussen microarray-chips. Deze verwerkte gegevens kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd.
Nu
Microarrays zijn belangrijke hulpmiddelen voor het profileren van genexpressie, en zijn gebaseerd op complementaire binding tussen sondes die aan glaz…
DNA-microarrays zijn veelgebruikte hulpmiddelen om tegelijkertijd de expressie van veel verschillende genen te meten. Ze bestaan uit duizenden sondes—elke sonde vertegenwoordigt een ander gen—geïmmobiliseerd op “chips” of dia's, en zijn gebaseerd op complementaire hybridisatie om genexpressie in verschillende biologische omstandigheden te evalueren.
Deze video bespreekt de basisprincipes van microarray-technologie, een protocol voor genexpressieprofilering met behulp van microarrays, en enkele actuele toepassingen.
Laten we beginnen met de principes van genexpressieprofilering en microarray-technologie te bespreken.
Een van de vroegste methoden die zijn ontwikkeld om genexpressie in biologische monsters te beoordelen, is Northern blotting, waarbij specifieke RNA-moleculen worden “geprobeerd” die op membranen zijn geïmmobiliseerd. “Vrij zwevende” sondes herkennen complementaire RNA-sequenties in het monster, en worden meestal gelabeld met radioactieve of fluorescerende moleculen zodat ze kunnen worden gevisualiseerd.
Vooruitgang in microfabricage, genoomsequencing en andere technologieën heeft geleid tot de ontwikkeling van de microarray-biochip. Net als Northern blots zijn microarrays gebaseerd op het principe van complementaire binding tussen sonde- en monsternucleïnezuursequenties. In tegenstelling tot Northerns, zijn het echter de oligonucleotide sondes die op een glazen plaat of chip zijn geïmmobiliseerd. De “vrij zwevende” monsters worden gegenereerd uit RNA dat is geïsoleerd uit cellen of organismen van belang, die omgekeerd worden getranscribeerd tot complementair of “c”-DNA. Dit kan direct worden gelabeld met fluorescerende moleculen, of de hoeveelheden kunnen verder worden geamplificeerd door in vitro transcriptie in cRNA. Het monster wordt vervolgens gehybridiseerd met de chip. Omdat sondes op microarrays die voor verschillende toepassingen zijn ontworpen, “sense” kunnen zijn, wat betekent dat hun sequenties in dezelfde richting zijn als het geëxprimeerde RNA van een organisme, of “antisense”, moeten onderzoekers ervoor zorgen dat de streng-directionaliteit van het monster complementair is aan die van de sondes.
De “ruwe” fluorescentie-intensiteitgegevens voor elke gen-specifieke stip op de chip kunnen vervolgens worden gekwantificeerd en verwerkt. De gegevens kunnen worden onderworpen aan verdere statistische tests, zoals de Student's t-test, om te bepalen of de fluorescentiesignalen—en dus expressieniveaus—voor een gen van belang significant verschillend zijn tussen twee celtypen of experimentele omstandigheden.
Onderzoekers kunnen deze gegevens ook gebruiken om genen te “clusteren” of groepen te vormen op basis van vergelijkbare expressiepatronen. Bijvoorbeeld, bij het vergelijken van expressiepatronen tussen twee celpopulaties, kunnen bepaalde genen worden gevonden die expressieveranderingen vertonen met ongeveer gelijke hoeveelheden in dezelfde richting, en zouden dus samen worden gegroepeerd. Onderzoekers kunnen deze relaties weergeven in een soort boomdiagram of “dendrogram” waarbij de hoogtes en arrangementen van “takken” aangeven hoe vergelijkbaar—of ongelijksoortig—genexpressiepatronen zijn. Dit type analyse kan inzicht geven in genrelaties, aangezien “geclusterde” genen mogelijk deelnemen aan dezelfde biologische paden.
Nu we de principes van microarray-methodologie hebben besproken, laten we een typische microarray-experiment bekijken.
Om de kwaliteit van het geïsoleerde RNA te waarborgen, moeten werkruimten en apparatuur worden behandeld met chemicaliën die RNases inactiveren—enzymen die anders RNA zouden vernietigen. Het RNA wordt vervolgens geïsoleerd uit monsters van belang en gezuiverd, en de concentratie en integriteit ervan worden bepaald door spectrofotometrie.
Dit monster-RNA wordt omgezet in cDNA, en vervolgens in cRNA. Vervolgens wordt het monster gelabeld met fluorescerende moleculen en gefragmenteerd, en de kwaliteit en kwantiteit ervan kunnen opnieuw worden gecontroleerd, waarbij ook de mate van fluorescerende markering kan worden beoordeeld.
Het gelabelde cRNA wordt vervolgens gemengd met “hybridisatie-oplossing” voordat het op een microarray wordt geladen. Om succesvolle hybridisatie te bevorderen, wordt een “mixer” op de chip geplaatst om “hybridisatiekamers” te vormen. De hybridisatiemix wordt vervolgens langzaam op de array aangebracht. Er moet voor worden gezorgd dat er geen luchtbellen ontstaan, omdat deze de binding van het monster aan specifieke gebieden op de microarray kunnen verstoren en leiden tot een vals negatief signaal. Nadat het monster is toegevoegd, worden de chips gedurende maximaal 24 uur op de juiste temperatuur geïncubeerd.
Na hybridisatie wordt de mixer van de chip verwijderd, ongebonden monster wordt afgewassen en de array wordt grondig gedroogd door centrifugatie in een gespecialiseerde, dia-houdende centrifuge. De gedroogde chip wordt in een microarray-scanner geplaatst en de machine wordt zo aangepast dat de helderste signalen die op een chip worden waargenomen niet oververzadigd zijn. De microarray wordt vervolgens gescand en er wordt een afbeelding van de hele chip gemaakt.
Zodra de chip is gescand, wordt het afbeeldingsbestand geladen in software voor gegevensextractie en beoordeeld op eventuele signaalafwijkingen. De gegevens die uit de microarray-afbeelding zijn geëxtraheerd, worden onderworpen aan een aantal statistische manipulaties, waaronder log2 transformatie, waardoor onderzoekers gegevens numeriek kunnen weergeven in termen van voudverschilleningen of -verminderingen in genexpressie; evenals normalisatie, die rekening houdt met signaalverschillen tussen microarray-chips. Deze verwerkte gegevens kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd.
Nu
DNA-microarrays zijn veelgebruikte hulpmiddelen om tegelijkertijd de expressie van veel verschillende genen te meten. Ze bestaan uit duizenden sondes—elke sonde vertegenwoordigt een ander gen—geïmmobiliseerd op “chips” of dia's, en zijn gebaseerd op complementaire hybridisatie om genexpressie in verschillende biologische omstandigheden te evalueren.
Deze video bespreekt de basisprincipes van microarray-technologie, een protocol voor genexpressieprofilering met behulp van microarrays, en enkele actuele toepassingen.
Laten we beginnen met de principes van genexpressieprofilering en microarray-technologie te bespreken.
Een van de vroegste methoden die zijn ontwikkeld om genexpressie in biologische monsters te beoordelen, is Northern blotting, waarbij specifieke RNA-moleculen worden “geprobeerd” die op membranen zijn geïmmobiliseerd. “Vrij zwevende” sondes herkennen complementaire RNA-sequenties in het monster, en worden meestal gelabeld met radioactieve of fluorescerende moleculen zodat ze kunnen worden gevisualiseerd.
Vooruitgang in microfabricage, genoomsequencing en andere technologieën heeft geleid tot de ontwikkeling van de microarray-biochip. Net als Northern blots zijn microarrays gebaseerd op het principe van complementaire binding tussen sonde- en monsternucleïnezuursequenties. In tegenstelling tot Northerns, zijn het echter de oligonucleotide sondes die op een glazen plaat of chip zijn geïmmobiliseerd. De “vrij zwevende” monsters worden gegenereerd uit RNA dat is geïsoleerd uit cellen of organismen van belang, die omgekeerd worden getranscribeerd tot complementair of “c”-DNA. Dit kan direct worden gelabeld met fluorescerende moleculen, of de hoeveelheden kunnen verder worden geamplificeerd door in vitro transcriptie in cRNA. Het monster wordt vervolgens gehybridiseerd met de chip. Omdat sondes op microarrays die voor verschillende toepassingen zijn ontworpen, “sense” kunnen zijn, wat betekent dat hun sequenties in dezelfde richting zijn als het geëxprimeerde RNA van een organisme, of “antisense”, moeten onderzoekers ervoor zorgen dat de streng-directionaliteit van het monster complementair is aan die van de sondes.
De “ruwe” fluorescentie-intensiteitgegevens voor elke gen-specifieke stip op de chip kunnen vervolgens worden gekwantificeerd en verwerkt. De gegevens kunnen worden onderworpen aan verdere statistische tests, zoals de Student's t-test, om te bepalen of de fluorescentiesignalen—en dus expressieniveaus—voor een gen van belang significant verschillend zijn tussen twee celtypen of experimentele omstandigheden.
Onderzoekers kunnen deze gegevens ook gebruiken om genen te “clusteren” of groepen te vormen op basis van vergelijkbare expressiepatronen. Bijvoorbeeld, bij het vergelijken van expressiepatronen tussen twee celpopulaties, kunnen bepaalde genen worden gevonden die expressieveranderingen vertonen met ongeveer gelijke hoeveelheden in dezelfde richting, en zouden dus samen worden gegroepeerd. Onderzoekers kunnen deze relaties weergeven in een soort boomdiagram of “dendrogram” waarbij de hoogtes en arrangementen van “takken” aangeven hoe vergelijkbaar—of ongelijksoortig—genexpressiepatronen zijn. Dit type analyse kan inzicht geven in genrelaties, aangezien “geclusterde” genen mogelijk deelnemen aan dezelfde biologische paden.
Nu we de principes van microarray-methodologie hebben besproken, laten we een typische microarray-experiment bekijken.
Om de kwaliteit van het geïsoleerde RNA te waarborgen, moeten werkruimten en apparatuur worden behandeld met chemicaliën die RNases inactiveren—enzymen die anders RNA zouden vernietigen. Het RNA wordt vervolgens geïsoleerd uit monsters van belang en gezuiverd, en de concentratie en integriteit ervan worden bepaald door spectrofotometrie.
Dit monster-RNA wordt omgezet in cDNA, en vervolgens in cRNA. Vervolgens wordt het monster gelabeld met fluorescerende moleculen en gefragmenteerd, en de kwaliteit en kwantiteit ervan kunnen opnieuw worden gecontroleerd, waarbij ook de mate van fluorescerende markering kan worden beoordeeld.
Het gelabelde cRNA wordt vervolgens gemengd met “hybridisatie-oplossing” voordat het op een microarray wordt geladen. Om succesvolle hybridisatie te bevorderen, wordt een “mixer” op de chip geplaatst om “hybridisatiekamers” te vormen. De hybridisatiemix wordt vervolgens langzaam op de array aangebracht. Er moet voor worden gezorgd dat er geen luchtbellen ontstaan, omdat deze de binding van het monster aan specifieke gebieden op de microarray kunnen verstoren en leiden tot een vals negatief signaal. Nadat het monster is toegevoegd, worden de chips gedurende maximaal 24 uur op de juiste temperatuur geïncubeerd.
Na hybridisatie wordt de mixer van de chip verwijderd, ongebonden monster wordt afgewassen en de array wordt grondig gedroogd door centrifugatie in een gespecialiseerde, dia-houdende centrifuge. De gedroogde chip wordt in een microarray-scanner geplaatst en de machine wordt zo aangepast dat de helderste signalen die op een chip worden waargenomen niet oververzadigd zijn. De microarray wordt vervolgens gescand en er wordt een afbeelding van de hele chip gemaakt.
Zodra de chip is gescand, wordt het afbeeldingsbestand geladen in software voor gegevensextractie en beoordeeld op eventuele signaalafwijkingen. De gegevens die uit de microarray-afbeelding zijn geëxtraheerd, worden onderworpen aan een aantal statistische manipulaties, waaronder log2 transformatie, waardoor onderzoekers gegevens numeriek kunnen weergeven in termen van voudverschilleningen of -verminderingen in genexpressie; evenals normalisatie, die rekening houdt met signaalverschillen tussen microarray-chips. Deze verwerkte gegevens kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd.
Nu
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How do microarrays measure gene expression?
Microarrays measure gene expression through complementary hybridization between immobilized probes on glass chips and labeled sample nucleic acids. RNA from cells is reverse transcribed to cDNA, then converted to cRNA and labeled with fluorescent molecules. When the labeled sample hybridizes to matching probes on the chip, fluorescence intensity at each spot indicates expression levels for thousands of genes simultaneously.
Q2: What is the difference between microarrays and Northern blotting?
Northern blotting uses free-floating probes to detect RNA immobilized on membranes, while microarrays reverse this arrangement. In microarrays, oligonucleotide probes are immobilized on glass slides, and free-floating labeled cDNA or cRNA samples hybridize to them. This allows microarrays to simultaneously evaluate thousands of genes, whereas Northern blots typically assess one or a few genes at a time.
Q3: Why is RNA quality important before microarray analysis?
RNA quality is critical because RNases—enzymes that degrade RNA—can destroy samples during isolation and preparation. Workspaces and equipment are treated with RNase-inactivating chemicals to protect RNA integrity. Researchers verify RNA quality and concentration through spectrophotometry before converting it to cDNA, ensuring reliable downstream hybridization and accurate gene expression measurements.
Q4: How does microarray data analysis reveal gene relationships?
Microarray data undergoes statistical processing including log2 transformation and normalization to account for signal differences between chips. Researchers then cluster genes based on similar expression patterns across conditions. Dendrograms depict these relationships, showing how closely gene expression patterns match. Clustered genes often participate in the same biological pathways, providing insight into gene networks and functional associations.
Q5: What role do hybridization chambers play in microarray experiments?
Hybridization chambers are formed by placing a mixer onto the microarray chip to create isolated compartments for the hybridization mix. These chambers facilitate controlled binding between labeled sample and immobilized probes. Care must be taken to avoid air bubbles during sample loading, as they interfere with binding and produce false negative signals. Chips are then incubated at appropriate temperatures for up to 24 hours.
Q6: How are microarrays applied to cancer research?
Researchers use microarrays to compare gene expression between cancerous and normal tissues to identify disease biomarkers. For example, scientists compared endogenous retroviruses (ERVs)—viral sequences in human genomes—between prostate cancer and normal tissues. This identified ERVs upregulated in cancer, which can serve as diagnostic biomarkers. Microarrays enable simultaneous evaluation of thousands of genes to pinpoint expression differences associated with disease.
Q7: What does microarray scanning and image processing reveal?
After hybridization, the dried microarray is scanned to produce a digital image showing fluorescence intensity at each probe location. The scanner is adjusted to prevent signal over-saturation. Data-extraction software then analyzes the image for signal irregularities and processes the data through log2 transformation and normalization. This processed data quantifies fold changes in gene expression between experimental conditions.
Hoofdstukken in deze video
0:00
Overview
0:42
Principles of Microarray Technology
3:32
General Protocol for a Microarray Experiment
5:59
Applications
8:04
Summary