DNA-methylatie-analyse

DNA-methylatie is een chemische modificatie van DNA die de genexpressie beïnvloedt onder verschillende cellulaire contexten. Veel onderzoekers zijn geïnteresseerd in het mechanisme en de functies van dit proces, omdat afwijkende DNA-methylatie is geassocieerd met ziekten zoals kanker.

In deze video zullen we de principes achter DNA-methylatie en methoden om deze te detecteren behandelen. Vervolgens zullen we een algemeen protocol voor een van deze methoden, bisulfietanalyse, en enkele toepassingen van deze techniek verkennen.

Eerst bekijken we wat DNA-methylatie is en hoe het kan worden gedetecteerd.

Tijdens dit biochemische proces voegt een cel een chemische tag, bekend als een methylgroep, toe aan cytosinebasen in zijn DNA. De meeste gemethyleerde cytosines komen voor naast guaninebasen in dezelfde DNA-streng, en deze aangrenzende nucleotiden - en de fosfodiësterbinding die ze verbindt - worden "CpG's" genoemd. Hoewel de meeste CpG's bij gewervelde dieren gemethyleerd zijn, zijn degenen die niet gemethyleerd zijn, meestal dicht bij elkaar in CpG "eilanden" nabij de promotors van actief geëxprimeerde genen, en verschillende andere regulerende sequentie-elementen.

Hoe veranderingen in DNA-methylatie bijdragen aan genreguleringsprocessen is nog steeds onderwerp van intens onderzoek. Methylering van CpG-eilanden lijkt belangrijk te zijn voor de stabiele, langetermijnige gensilencing die wordt gezien in epigenetische processen zoals genomische imprinting, dat is de specifieke expressie van bepaalde genen op basis van de ouder van oorsprong, evenals X-chromosoom-inactivatie, de silencing van een van de twee X-chromosomen in elke cel van vrouwelijke zoogdieren. De onderdrukking van cruciale genen door afwijkende methylering van CpG-eilanden is ook gebleken bij te dragen aan ongecontroleerde celgroei, wat kan leiden tot kanker. Mechanistisch kan DNA-methylatie bijdragen aan gensilencing door het voorkomen van transcriptiefactoren die zich met promotors associëren, of door het werven van eiwitten die histonen modificeren en chromatine omvormen tot een transcriptioneel niet-toelaatbare toestand.

Er zijn verschillende methoden om de methyleringstoestand van DNA te detecteren.

Eén techniek, de HELP-assay, omvat twee restrictie-endonucleasen genaamd HpaII en MspI, die respectievelijk alleen ongemethyleerde, of zowel gemethyleerde als ongemethyleerde, CCGG-sequenties kleden. Door de verteringspatronen te vergelijken die door deze twee enzymen worden geproduceerd, kan de methyleringsstatus van DNA worden afgeleid.

Een andere methode, genaamd gemethyleerd DNA immunoprecipitatie of "MeDIP," gebruikt antilichamen die zich binden aan gemethyleerde cytosines om gemethyleerde DNA-sequenties te verrijken.

Ten slotte wordt bisulfietanalyse gebruikt om gemethyleerde van ongemethyleerde cytosine in DNA te onderscheiden, door een chemische reactie uit te voeren die ongemethyleerde cytosine omzet in uracil. Na deze omzetting kan bisulfiet-behandeld DNA worden onderworpen aan PCR, gesequenced en vergeleken met een referentie-genoom. Ongemethyleerde cytosines zijn die welke aanwezig zijn in de referentie, maar worden vervangen door thyminen na bisulfietanalyse en PCR. Door bisulfiet-behandeld DNA te onderwerpen aan massaspectrometrie, kunnen onderzoekers ook "methyleringsepigrammen" maken, die lineair verschillende CpG's in het genoom vertegenwoordigen en de mate van methylering bij elk ervan weergeven. Dergelijke epigrammen zijn bijzonder nuttig als onderzoekers methyleringspatronen tussen verschillende celtypen willen vergelijken.

Laten we nu een diepgaand kijken op het protocol voor bisulfietanalyse.

Om te beginnen wordt natriumhydroxide toegevoegd aan preparaten van genomisch DNA, die vervolgens worden geïncubeerd bij 95°C. Dit denatureert het DNA en maakt de basen ervan toegankelijk voor volgende chemische reacties. Natriummetabisulfiet wordt vervolgens geïntroduceerd in het gedenatureerde DNA-mengsel, en er zullen twee chemische reactiestappen plaatsvinden. Tijdens de eerste stap, sulfonatie, wordt een sulfongroep toegevoegd aan een ongemethyleerde cytosine om cytosinesulfonaat te vormen. Vervolgens wordt tijdens hydrolytische deaminering een aminogroep verwijderd uit cytosinesulfonaat om uracilsulfonaat te genereren.

Om deze eerste stadia van de chemische reactie te vergemakkelijken, wordt de DNA-voorbereiding bedekt met minerale olie, wat verdamping voorkomt en helpt de concentratie natriummetabisulfiet te handhaven. De reactie wordt vervolgens geïncubeerd bij 55°C in het donker. Tijdens deze stap wordt ook een middel om oxidatie te voorkomen, zoals chinol, aan het mengsel toegevoegd.

Om gemodificeerd DNA met uracilsulfonaat, en geen minerale olie, te verzamelen, wordt het mengsel gecentrifugeerd en de onderste vloeistoflaag wordt teruggewonnen. Het DNA in deze oplossing wordt vervolgens gezuiverd.

Vervolgens wordt natriumhydroxide toegevoegd aan het DNA-mengsel, dat vervolgens wordt geïncubeerd bij 37°C. Dit wordt gedaan om desulfonatie te induceren, wat - zoals je misschien al geraden hebt - de sulfongroep van uracilsulfonaat verwijdert, waardoor uracil wordt gevormd en de chemische reactie wordt voltooid.

Ten slotte wordt het mengsel geneutraliseerd met de toevoeging van ammoniumacetaat, en het DNA wordt verzameld door ethanolprecipitatie. Zodra het bisulfiet-geconverteerde DNA is gezuiverd, wordt het onderworpen aan PCR en sequencing.

Nu we de basistechniek voor bisulfietanalyse hebben besproken, laten we eens kijken naar enkele experimentele toepassingen.

Sommige onderzoekers gebruiken bisulfietanalyse om genomisch imprinting te onderzoeken. Hier kruisten onderzoekers twee stammen van Arabidopsis met genetische verschillen, zodat maternale en vaderlijke DNA konden worden onderscheiden. Methyleringspatronen in de resulterende embryo's en bijbehorend end