Name: Inductie van mesenchymale-epitheliale Transities sarcoomcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Leer een celkweekmethode om mesenchymale-epitheliale transities in sarcoomcellen te induceren met microRNA-200 en GRHL2. Deze techniek helpt onderzoekers fenotypische plasticiteit en kankeragressiviteit beter te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JAS erkent steun van het Duke Cancer Institute, The Duke University Genitourinary Oncology Laboratory, en de Duke University Afdeling Orthopedie. HL werd gesteund door de National Science Foundation (NSF) Centrum voor Theoretische Biological Physics (NSF PHY-1.427.654) en NSF DMS-1.361.411, en als een CPRIT (Cancer Prevention and Research Institute of Texas) Scholar in Cancer Research van de staat Texas aan de Rice University. KEW werd ondersteund door NIH F32 CA192630 MKJ en HL geprofiteerd van nuttige besprekingen met Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta en Donald S. Coffey.

1. Bereiding van reagentia <ol><li> Bereid DMEM gedurende celkweek door toevoeging van 50 ml foetaal runderserum (FBS) en 5 ml penicilline-streptomycine (5000 U / ml) en 500 ml DMEM. Dit medium kan voor maximaal zes maanden worden bewaard bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer gevriesdroogde primers in nuclease-vrij water tot een eindconcentratie van 10 uM. WINKEL hersuspendeerd primers bij -20 ° C. </li><li> Bereid radioimmunoprecipitatietest (RIPA) buffer (150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0). Aanvullen met proteaseremmer cocktail voor het gebruik en bewaar buffer op ijs tijdens het gebruik. Bewaren bij 4 ° C. </li><li> Bereid 10 mg / ml polybreen (hexadimethrinebromide) in water en spuitfilter te steriliseren met behulp van een 0,45 um filter polyethersulfon. Oplossing kan voor maximaal zes maanden worden bewaard bij 4 ° C. </li><li> Maak een 1 mg / ml werkoplossing uit nitro blue tetrazolium chloride door oplossen van 10 mg in 10 ml PBS. Bewaren bij 4 ° C.</li></ol> 2. Lentiviral Transductie van GRHL2 Dag 1 <ol><li> Plaat 3 x 10 5 HEK293T-cellen per putje van een 6-well plaat in 2 ml DMEM aangevuld. Kwantificeren cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller. 60% confluent na overnacht kweken bij 37 ° C met 5% CO2 - cellen moeten 40 zijn. </li></ol> Dag 2 <ol start="2"><li> Verdun 2 ug lege vector (pCMV-UBC-EGFP) of 2 ug pCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24, 25 in 200 ul serumvrij medium met 1,8 ug pΔ8.9 en 0,2 ug pCMV-VSV G helper plasmiden. In een afzonderlijke buis, verdunde 4 pi van een lipide-gebaseerde transfectie reagens in 200 ul serumvrij medium per transfectie (8 pl in 400 pl van twee monsters). Voeg 200 ul van transfectiereagens mengsel aan elk plasmide-oplossing en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Tijdens de incubatie, wassen HEK293T-cellen door het verwijderen van het medium door afzuigen in vacuo en spoelen cellen met 1 ml PBS. Vervang de PBS met 800 pl van serum-vrije media. Na 20 minuten, voeg 200 ul transfectiereagens: plasmide mengsel van stap 2.2 druppelsgewijs aan elk putje en incubeer cellen gedurende 2 uur bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Verwijder voorzichtig transfectie medium door afzuigen in vacuo en vervangen door 2 ml DMEM aangevuld. Terugkeer van de cellen naar de incubator voor overnachting cultuur. LET OP: HEK293T cellen zijn losjes aanhanger. Medium vervangen dient voorzichtig te gebeuren om het verwijderen van cellen beperken van de bodem van de schaal of kolf. </li></ol> Dag 3 <ol start="5"><li> Refresh media getransfecteerde HEK293T-cellen en de plaat 3 x 10 5 RD-cellen per putje van een 6-well plaat in 2 ml DMEM aangevuld. Kweekcellen &#39;s nachts. RD-cellen zijn een in de handel verkrijgbare humane rhabdomyosarcoom cellijn. </li></ol> dag 4 </p&gt; <ol start="6"><li> Verzamelen viraal materiaal uit HEK293T-cellen. Pipetteer de DMEM medium van HEK293T-cellen en plaats in een nieuwe 15 ml conische. Plaats voorzichtig met nieuwe DMEM media en plaats HEK293T cellen terug in de incubator voor de volgende dag. </li><li> Voeg 2 pi van 10 mg / ml polybreen per ml virale media in twee nieuwe 50 ml conische buizen (een voor de lege vector transfectie en andere voor het GRHL2 transfectie). Spuitfilter virale media door verwijdering van de plunjer van een 3 ml spuit en bevestig een 0,45 urn filter om polyethersulfon de punt. <ol><li> Voeg de virale media verzameld in stap 2.6 in de cilinder van de injectiespuit, en duik media in de nieuwe 50 ml conische buisjes met polybreen. Verwijder media uit RD-cellen door vacuümaspiratie toevoegen gefiltreerd virale media RD-cellen. </li></ol></li></ol> dag 5 <ol start="8"><li> Herhaal Dag 4. HEK293T cellen kunnen worden weggegooid na de virale media is verzameld. </li></ol> dag 7 </strong&gt; <ol start="9"><li> RD wassen cellen met 1 ml PBS en voeg 200 ul van 0,05% trypsine per putje. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min, voeg 2 ml aangevulde media en verplaatsen celsuspensie om een ​​nieuwe 15 ml conische. Centrifugeer cellen bij 250 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuig media. Resuspendeer in 1 ml DMEM (aangevuld met 5% FBS en 1% penicilline-streptomycine). LET OP: Het gebruik van een hoger percentage van FBS kan verstopping tijdens flowcytometrie veroorzaken <ol><li> Filter cellen voor flowcytometrie. Gebruik een pipet om de RD 1 ml celsuspensie toepassing door een 30 urn filter in flowcytometrie buizen en pijpen plaats op ijs. </li><li> Sorteren EGFP + cellen 26 in 1,5 ml microcentrifuge buisjes die 0,5 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine en plaats op ijs. Plaat EGFP + gesorteerde cellen in totaal van 1 ml DMEM aangevuld in een enkel putje van een 12 putjesplaat en plaats in de incubator gedurende kweek. Noot: De opbrengst van EGFP + cellen van stromingscytometrie daarna transductie gewoonlijk laag (50.000-100.000 cellen). Cellen moeten worden gekweekt gedurende 10-14 dagen alvorens tot stap 3. </li></ol></li></ol> 3. Reverse Transfectie van miR-200s <ol><li> Bereid 50 uM voorraden miR-200 bootst behulp nuclease-vrij H2O Aliquot bestanden en bewaar bij -20 ° C om herhaalde vries / ontdooi cycli te voorkomen. </li><li> Voeg 3 ul van elk 50 uM miR-200 mimic (miR-200a, miR-200b en miR-200c) aan 300 ui serumvrije media of 9 pl 50 pM negatieve controle miRNA 300 ul serumvrij medium. </li><li> Voeg 6 ul van siRNA-specifieke transfectiereagens tot 600 gl serumvrij medium en verdeel 300 pi van dit mengsel in twee buizen, één voor elk van de twee miR mengsels uit stap 3.2. Combineer de 300 pi van elk miR mengsel van stap 3.2 met een mengsel van 300 gl transfectiereagens. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur temperature. </li><li> Gedurende incubatie Bereid een celsuspensie van 600.000 EGFP + RD-cellen die LW of GRHL2 die in paragraaf 2 in 2,4 ml (250 cellen / pl) serum-vrij medium per behandeling. </li><li> In een plaat met 24 putjes, 100 ul per putje van miR-200 mix of negatieve controle mengsel uit stap 3.3 in zes putjes en voeg 400 ul van elke celsuspensie in drie putjes van elke miR mix. </li><li> Incubeer cellen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende de nacht en materiaaltype volledig DMEM gesupplementeerd de volgende dag. Verzamel cellen 2 dagen later te analyseren met de geschikte buffer (zie hieronder). Time-lapse imaging van RD sarcoma cellen die BMO is beschikbaar als aanvullend materiaal. Afbeelding elk putje om de 2 uur met een 10x objectief met behulp van een geautomatiseerd levende cellen imager 27. </li></ol> 4. RNA-extractie, reverse transcriptie en qPCR <ol><li> Extract RNA volgens de instructies van de fabrikant onder gebruikmaking van een standaard-RNAextractiekit 24. Geëxtraheerd RNA kan worden opgeslagen bij -80 ° C. </li><li> Kwantificeren RNA-concentratie. Ontdooien en werken met RNA op ijs. RNA concentraties kwantificeren meten UV absorptie bij 260 nm met een plaatlezer spectrofotometer volgens het protocol van de fabrikant. Alle monsters verdund tot de laagste concentratie met nuclease-vrij water. </li><li> Voeren reverse transcriptie van totaal RNA in complementair DNA (cDNA). Combineer liefst 100 ng totaal RNA met PCR buffer, dNTP mix (100 mM), willekeurig hexameer primers, reverse transcriptase en nuclease-vrij water in een 20 gl reactievolume 24. RT werking cycli volgens het protocol van de fabrikant. cDNA kan worden opgeslagen op lange termijn bij -20 ° C. </li><li> Verdun 20 pi reacties 100 ul 80 ul nuclease-vrij H2O </li><li> Meng 5 pi van een op fluorescentie gebaseerde intercalerende kleurstof 2x qPCR hoofdmengsel, 0,06 pl van elk 10 uM primer, eennd 2 pl verdunde RT-reactie per monster. </li><li> Run qPCR volgens het protocol van de fabrikant voor de op fluorescentie gebaseerde master mix. </li><li> Kwantificeren relatieve hoeveelheden van mRNA door delta CT methode en normaliseren GAPDH. Plot van de gemiddelde mRNA-expressie van biologische replica ± standaardafwijking voor elke behandelingsgroep. LET OP: Speciale voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het werken met RNA om contact met RNases, zoals het gebruik van RNasevrije kunststoffen en reagentia te voorkomen. Non-wegwerpmateriaal moeten worden behandeld voor gebruik om RNases verwijderen. </li></ol> 5. Immunofluorescentie kleuring <ol><li> Na stap 3.6, afgezogen medium door afzuigen in vacuo uit RD-cellen in 24 putjes format. </li><li> Fix cellen door toevoeging van 500 pl 4% paraformaldehyde (PFA) per putje en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT). Na het fixeren plaats cellen in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en bewaar bij 4 ° C gedurende de nacht indien nodig. </li><li> permeabilizecellen door toevoeging van 500 pi PBS + 0,2% Triton-X100 en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur. Door vacuümaspiratie, verwijdert permeabilisatie buffer en was driemaal met PBS. </li><li> Blok in 500 ui 5% runderserumalbumine (BSA) / PBS en incubeer cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Cellen kunnen een nacht eventueel worden bewaard bij 4 ° C. </li><li> Bereid primaire antilichaam verdunning. Pipetteer 200 ul 5% BSA / PBS per putje in een 15 ml conische (12 wells = 2,4 ml) en voeg 1 ul van primair antilichaam per ml 5% BSA / PBS nodig. Verwijderen blokkerende buffer door afzuigen in vacuo en afzien 200 pl verdund primair antilichaam aan elk putje. <ol><li> Incubeer cellen in 1: 1000 verdunde primaire antilichamen in 5% BSA / PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Na incubatie tweemaal wassen cellen met PBS. </li></ol></li><li> Bereid het secundaire antilichaam verdunning in hetzelfde volume van 5% BSA / PBS zoals hierboven. Voeg de ver-rode kleurstof-geconjugeerd secundair antilichaam met behulp van een 1: 2000 verdunning. Bovendien voegen1 ug / ml Hoechst kleurstof aan de mix. Verwijder de PBS en voeg 200 ul van het mengsel aan elk putje. <ol><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 h in het donker. Was 3 maal met PBS, laat cellen in PBS en cellen tegen licht met behulp folie. De cellen kunnen worden bewaard bij 4 ° C indien noodzakelijk. </li></ol></li><li> Afbeeldingscellen bij 400X totale vergroting op een omgekeerde epifluorescentie microscoop met excitatie golflengte 594-650 nm. </li></ol> 6. Western Blotting <ol><li> Was de cellen tweemaal met 3,6 ijskoude PBS. Op ijs, cellen lyseren met 50 pl 1x RIPA buffer aangevuld met 1 x proteaseremmercocktail. </li><li> Rots lysaten bij 4 ° C gedurende 15 min, verzamel lysaten in 1,5 ml buisjes en centrifugeer bij hoge snelheid (20.000 x g) gedurende 5 minuten om monsters te verduidelijken. Cellysaten worden opgeslagen op lange termijn bij -80 ° C indien nodig. </li><li> Kwantificeren totaal eiwit onder toepassing van een Bradford-bepaling en aliquot een gelijke hoeveelheid eiwit in nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuizen. Bring monsters gelijk volume met RIPA buffer en 3 x Laemmli beladingsbuffer aangevuld met 2-mercaptoethanol. </li><li> Incubeer monsters in 1 x Laemmli monster beladingsbuffer gedurende 5 minuten bij 95 ° C en werking SDS-PAGE onder toepassing van een 4-12% Tris-glycine gel bij 200V gedurende 45 minuten. De hoeveelheid eiwit geladen varieert afhankelijk van de cellijn. In sommige gevallen is 50-100 ug totaal eiwit nodig E-cadherine in mesenchymale cellijnen te detecteren. </li><li> Transporterende eiwitten op een nitrocellulosemembraan gedurende 2 uur bij 50 V in 1 x Tris-glycine-overdrachtsbuffer. </li><li> Blok membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C in een BSA-gebaseerde blokkerende buffer. </li><li> Verdunde primaire antilichamen 1: 1000 concentratie in 5 ml blokkeerbuffer en voeg verdunning tot het membraan, en geïncubeerd onder rustig schommelen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Was het membraan 3 maal in PBS met 0,05% Tween-20. </li><li> Incubeer membranen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met infrarood fluorescerend gekoppeld SECUNDAIRy antilichaam bij 1: 20.000 verdunning in blokkeringsbuffer zoals hierboven. </li><li> Was membraan tweemaal in PBS met 0,05% Tween-20 en vervolgens eenmaal in PBS. </li><li> Afbeelding membraan met behulp van standaard infrarood fluorescentiedetectie. </li></ol> 7. Anchorage-onafhankelijke groei Assays LET OP: Voor een gedetailleerde zachte agar assay protocol, zie 28. <ol><li> Warme steriele 2x DMEM-medium tot 42 ° C in heet waterbad. Gedurende deze tijd, warmte pre-geautoclaveerde 1% agarose in de magnetron gedurende 3 min. Magnetron voor nog eens 30 s in een tijd als nodig is of tot het volledig gesmolten. Agarose verplaatsen naar een 42 ° C waterbad. </li><li> Plaats een 50 ml conische buis in een beker met 42 ° C water in een steriele kap en meng 1% agarose en 2 x DMEM media in een 1: 1 verhouding goed voor 1,5 mL mengsel per putje in een 6-wells plaat. bereiden altijd extra DMEM / agarose om rekening te houden pipetteren fouten en om luchtbellen te vermijden. </li><li> mengsel toe te voegen aan dezijkanten van de goot, zodat er geen belletjes en laat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Terwijl de onderste laag stollen bereiden elke groep van zeldzame cellen in stap 3 getransfecteerd door opzuigen media en eenmaal gewassen met 1 ml PBS. Aspireren PBS en voeg 0,2 ml 0,05% trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Neutraliseren trypsine in 0,8 ml medium en fijnstampen cellen om een ​​eencellige suspensie. Transfer celsuspensie aan een 15 ml conische buis. </li><li> Aantal cellen en bereken volume celsuspensie vereist 10.000 cellen per putje. </li><li> Verwarm 0,6% agarose in de magnetron gedurende 3 min gevolgd door 30 seconden in tot volledig gesmolten. Bewegen agarose tot 42 ° C waterbad. </li><li> Plaats een 50 ml conische buis in een beker met 42 ° C water in een steriele kap. Meng 0,6% agarose en verdunde celsuspensie in een 1: 1 verhouding tot 1,5 ml per putje mengsel bereid in een 6-wells plaat. bereiden altijd extra celsuspensie / agarose mix om rekening te houden pipetteerfout enom luchtbellen te vermijden. LET OP: Het is belangrijk om te werken bij 42 ° C hier. Als de temperatuur te laag is zal het mengsel stollen plating en temperaturen boven 42 ° C wordt de levensvatbaarheid van cellen beïnvloeden. </li><li> Meng goed door tritureren cellen meerdere malen toevoegen celmengsel aan de putjes, zodat er geen bellen vormen, en laat stollen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 2 ml gesupplementeerd medium aan elk putje en platen bewegen incubator. <ol><li> Verander media een keer per week voor 3-4 weken of tot meercellige kolonies vormen. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het aanraken van de agar bij het verwijderen van de media door middel van vacuüm aspiratie. Of gebruik een P1000 om de bovenste laag van vloeibare media te verwijderen. </li><li> Vlek zachte agar platen door toevoegen van 200 pl nitroblauwtetrazolium-oplossing (1 mg / ml in PBS) en een nacht incuberen van de plaat bij 37 ° C. Vervang media de volgende dag met PBS voor de beeldvorming. </li><li> Afbeelding putten 40x totale vergroting op een omgekeerde microscoop. </li><li> Analyse uitvoeren op ImageJ voor kolonie gebied en het nummer. Plot betekenen kolonie aantal biologische herhalingen ± standaarddeviatie. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition%2C+TGF-beta%2C+and+osteopontin+in+wound+healing+and+tissue+remodeling+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Burn+Care+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury.</a> J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).</li>
<li>Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT-MET+in+renal+disease%3A+should+we+curb+our+enthusiasm%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm.</a> Cancer Lett. 341 (1), 24-29 (2013).</li>
<li>Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+EMT+in+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The role of EMT in renal fibrosis.</a> Cell Tissue Res. 347 (1), 103-116 (2012).</li>
<li>Willis, B. C., Borok, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+EMT%3A+mechanisms+and+implications+for+fibrotic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (3), L525-L534 (2007).</li>
<li>Ye, X., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-Mesenchymal+Plasticity%3A+A+Central+Regulator+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 675-686 (2015).</li>
<li>Li, L., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+human+cancer%3A+comprehensive+reprogramming+of+metabolism%2C+epigenetics%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation.</a> Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).</li>
<li>Tsai, J. H., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+plasticity+in+carcinoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis.</a> Genes Dev. 27 (20), 2192-2206 (2013).</li>
<li>Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+epithelial+plasticity+in+prostate+cancer+dissemination+and+treatment+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance.</a> Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 441-468 (2014).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Migration+and+Invasion+Uncoupled%3A+Increased+Migration+Is+Not+an+Inexorable+Consequence+of+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Mol Cell Biol. 34 (18), 3486-3499 (2014).</li>
<li>Mathow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zeb1+affects+epithelial+cell+adhesion+by+diverting+glycosphingolipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism.</a> EMBO Rep. 16 (3), 321-331 (2015).</li>
<li>Ware, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+resistance+to+gefitinib+mediated+by+cellular+reprogramming+and+the+acquisition+of+an+FGF2-FGFR1+autocrine+growth+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop.</a> Oncogenesis. 2, e39(2013).</li>
<li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+versus+mesenchymal+phenotype+determines+in+vitro+sensitivity+and+predicts+clinical+activity+of+erlotinib+in+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients.</a> Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).</li>
<li>Jolly, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+elucidating+the+connection+between+epithelial-mesenchymal+transitions+and+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness.</a> J R Soc Interface. 11 (101), 20140962(2014).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133 (4), 704-715 (2008).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+is+regulated+via+microRNA-200%2FZEB1+axis+control+of+tumour+cell+PD-L1+expression+and+intratumoral+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression.</a> Nat Commun. 5, 5241(2014).</li>
<li>Nicolazzo, C., Gradilone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+circulating+tumor+cells+in+soft+tissue+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , 697395(2015).</li>
<li>Somarelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://mcb.asm.org/content/early/2016/07/08/MCB.00373-16.abstract">Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2.</a> Mol Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-Mesenchymal+Transition+Phenotype+Is+Associated+with+Clinicopathological+Factors+That+Indicate+Aggressive+Biological+Behavior+and+Poor+Clinical+Outcomes+in+Invasive+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer.</a> J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).</li>
<li>Humphries, B., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA-200+family%3A+small+molecules+with+novel+roles+in+cancer+development%2C+progression+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy.</a> Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).</li>
<li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+of+primary+high-grade+soft+tissue+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas.</a> Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).</li>
<li>Petrof, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+GRHL2+result+in+an+autosomal-recessive+ectodermal+Dysplasia+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome.</a> Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).</li>
<li>Werner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+the+transcription+factor+grainyhead-like+2+%28GRHL2%29+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer.</a> J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).</li>
<li>Werth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+grainyhead-like+2+regulates+the+molecular+composition+of+the+epithelial+apical+junctional+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex.</a> Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).</li>
<li>Somarelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-Epithelial+Transition+in+Sarcomas+Is+Controlled+by+the+Combinatorial+Expression+of+MicroRNA+200s+and+GRHL2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2.</a> Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).</li>
<li>Varma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factors+Grainyhead-like+2+and+NK2-homeobox+1+form+a+regulatory+loop+that+coordinates+lung+epithelial+cell+morphogenesis+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation.</a> J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).</li>
<li>Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fluorescent+protein+expressing+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+morphological+screen+identifies+novel+microRNAs+that+regulate+neuroblastoma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation.</a> Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).</li>
<li>Borowicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soft+agar+colony+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The soft agar colony formation assay.</a> J Vis Exp. (92), e51998(2014).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomics+and+genomics+analysis+reveals+a+novel+mesenchymal+to+epithelial+reverting+transition+in+leiomyosarcoma+through+regulation+of+slug%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).</li>
<li>Alba-Castellon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail1+expression+is+required+for+sarcomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Snail1 expression is required for sarcomagenesis.</a> Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).</li>
<li>Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+to+Epithelial+Transition+Induced+by+Reprogramming+Factors+Attenuates+the+Malignancy+of+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells.</a> PLoS One. 11 (6), e0156904(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Sarcomen zijn zeldzaam, maar zeer agressieve kanker van een mesenchymale lijn. Ondanks hun mesenchymale lijn, een subset van sarcomen blijkt een fenotypische overgang naar een epitheel-achtige toestand ondergaan. Dit MET-achtige schakelaar prognostische impact, zoals patiënten met epitheel-achtige tumoren zijn minder agressief 24. Ondanks hun klinische relevantie, zijn er weinig studies over de moleculaire mechanismen die deze fenotypische overgangen in sarcomen. Om M...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55520/induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells">Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells</a>. An author name was updated.
One of the authors&#39; names was corrected from:
Shenghan Xu
to:
Shengnan Xu

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55520/induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells">Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells</a>. An author name was updated.

Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Fenotypische plasticiteit heeft betrekking op een reversibele overgang tussen cellulaire fenotypes en wordt gewoonlijk verdeeld in twee types, epitheliale naar mesenchymale (EMT) overgangen en mesenchymale tot epitheliale overgangen (MET). Deze fenotypische plasticiteit speelt een belangrijke rol in de normale processen van meercellige organismen, zoals de ontwikkeling en wondgenezing 1; echter kan deze zelfde paden en genexpressie programma ook leiden tot ziekten zoals fibrose (samengevat in 2, 3, 4) en carcinoom metastase (samengevat in referenties 5, 6, 7, 8). Tijdens metastase, bijvoorbeeld EMT verstoort celpolariteit, cel-cel interacties en bevordert invasie 9, 10. Samen EMT bijdragens om een ​​fenotypische staat die kankercel verspreiding vergemakkelijkt. Bovendien, EMT leidt ook tot een aantal andere fenotypische veranderingen die een agressieve fenotype trekken, inclusief deregulering van kankercel metabolisme 6, ontwikkeling van geneesmiddelresistentie 11, 12, verhoogde tumor-initiatie vermogen 13, 14 en gastheer immuunontwijking 15. Fenotypische plasticiteit is goed onderzocht in carcinoom progressie; Maar ook sarcomen fenotypische plasticiteit vertonen. Interessant, lijkt het alsof een aantal van dezelfde drijfveren van fenotypische plasticiteit in carcinomen ook bijdragen aan sarcoom plasticiteit en agressiviteit. Zo zijn circulerende tumorcellen (CTCs) vanaf sarcoom patiënten aangetoond dat EpCAM, een celoppervlakte-eiwit dat gewoonlijk wordt gevonden op epitheelcellen 16 expressie brengen. Additioneel werd 250 wekedelensarcoom monsters geclassificeerd als epitheel-achtige of mesenchymale-achtige basis van genexpressie. Patiënten in de epitheliale-achtige biomarker handtekening had een betere prognose dan patiënten met de mesenchymale-achtige biomarker handtekening 17. Dit is consistent met vele carcinomen, waarbij patiënten met meer epitheel-achtige carcinomen hebben betere resultaten in vergelijking met patiënten met meer mesenchymale-achtige tumoren 18. Terwijl sommige sarcomen geven biomerkers en genexpressie paden in overeenstemming met BMO blijven de moleculaire onderbouwing van deze fenotypische plasticiteit slecht begrepen. Om de mechanismen en bestuurders van BMO in sarcoma bestuderen we een model ontwikkeld van BMO inductie met behulp van twee epitheliale-specifieke factoren, de microRNA (MIR) -200 familie en grainyhead-achtige 2 (GRHL2). De miR-200S zijn een familie van kleine niet-coderende RNAs die genexpressie reguleren door te binden aan de 3&#39; UTR van messenger RNA en verhinderen translatie in eiwit. Het miR-200 familie bestaat uit twee subgroepen - een met miR-141 en miR-200a en de andere met inbegrip van miR-200b, miR-200c en miR-429. Familieleden miR-200 verrijkt in epitheliale weefsels, en het verlies van miR-200s is geassocieerd met metastase in carcinomen 19. De familie miR-200 ook omlaag gereguleerd in zacht weefsel sarcomen in vergelijking met normaal weefsel 20. Net als bij de miR-200S, GRHL2 is een belangrijke regulator die belangrijk is voor epitheliale ontwikkeling 21. De GRHL2 transcriptiefactor fungeert op twee manieren epitheliale genen, zoals E-cadherine upregulate: 1) in epitheelcellen, GRHL2 direct onderdrukt de EMT hoofdregelaar, ZEB1 22; en 2) GRHL2 direct activeert transcriptie van genen epitheliale 23. Onze eerdere onderzoekingen hebben aangetoond dat de gecombineerde expressie van miR-200s en GRHL2 in sarcoomcelleninduceert een MET-fenotype 24. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor een in vitro model van MET inductie in sarcoomcellen via ectopische expressie van miR-200s en GRHL2 creëren.

<table><tbody><tr><td>Countess geautomatiseerde teller</td><td>Life technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess celtellingkamer slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc</td><td>LI-COR Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Real Time PCR System</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>PCR microplaat</td><td>Corning</td><td>321-29-051</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Fast Universal qPCR Kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4602</td><td></td></tr><tr><td>Starting Block (PBS) Blocking Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>37538</td><td>BSA-gebaseerde blocking buffer</td></tr><tr><td>Agarose General Purpose LE</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0732</td><td>Loopbuffer</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0734</td><td>Transferbuffer</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>SLBG8489</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran 0.45 &mu;m nitrocellulose</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>10600012</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep Kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-358</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (4X)</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAi Max</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Ragents</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>miRVana miRNA mimic negatieve controle #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464058</td><td>neg miRNA</td></tr><tr><td>hsa-miR-200 mirVana miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464066</td><td>miR200A</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200B</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200C</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life technologies</td><td>11088-021</td><td>serumvrij medium</td></tr><tr><td>anti-Ecadherin antilichaam</td><td>BD Bioscience</td><td>610182</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta actin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-69879</td><td></td></tr><tr><td>anti-EpCam</td><td>Ab Serotec</td><td>MCA18706</td><td></td></tr><tr><td>anti-ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800W</td><td>LI-COR Inc</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680</td><td>LI-COR Inc</td><td>926-32223</td><td></td></tr><tr><td>anti-muis AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A211241</td><td></td></tr><tr><td>anti-konijn AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab150075</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease en Phosphatesse Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Partec CellTrics</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td>30 &mu;m filter voor flow</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>AGCCACATCGCTCAGACAC</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>GCCCAATACGACCAAATCC</td></tr><tr><td>Ecadherin-F</td><td>IDT</td><td></td><td>TGGAGGAATTCTTGCTTTGC</td></tr><tr><td>Ecadherin-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGCTCTCCTCCGAAGAAAC</td></tr><tr><td>ZEB1-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC</td></tr><tr><td>ZEB1-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGATTACACCCAGACTGC</td></tr><tr><td>NOTCH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GGCAATCCGAGGACTATGAG</td></tr><tr><td>NOTCH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCAGAACGCACTCGTTGAT</td></tr><tr><td>nitro blue tetrazolium</td><td>Sigma</td><td>N5514</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>polybrene</td></tr><tr><td>3 mL spuit</td><td>BD Bioscience</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Steriele spuitfilter</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>5mL polypropyleen ronde bodembuis</td><td>352063</td><td></td><td>flow cytometry buizen</td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcriptie Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>4368814</td><td>reverse transcriptie kit</td></tr><tr><td>4% paraformaldyhyde</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281612</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>runde serum albumine</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr></tbody></table>

inductie van mesenchymale-epitheliale transities sarcoomcellen

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Fenotypische plasticiteit verwijst naar een fenomeen waarin cellen transiënt trekken van een lijn krijgen. Tijdens carcinoom progressie, fenotypische plasticiteit drijft invasie, verspreiding en metastase. Inderdaad, terwijl de meeste van de studies van fenotypische plasticiteit in het kader van epitheliale carcinomen afkomstig zijn, blijkt sarcomen, die mesenchymale oorsprong zijn, ook fenotypische plasticiteit vertonen, met een subset van sarcomen een verschijnsel dat lijkt mesenchymal- ondergaan epitheliale transitie (MET). Hier hebben we een werkwijze omvattende de miR-200-familie en grainyhead als 2 (GRHL2) deze MET-achtige fenomeen waargenomen sarcoom patiënten samples.We achtereenvolgens tot expressie GRHL2 en miR-200 familie die cel transductie en transfectie nabootsen respectievelijk , beter inzicht in de moleculaire onderbouwing van deze fenotypische overgangen in sarcoma cellen. Sarcoma cellen die miR-200s en GRHL2 aangetoond verbeterde epitheliale characteristics in cel morfologie en verandering van epitheliale en mesenchymale biomarkers. Toekomstige studies met behulp van deze methoden kunnen worden gebruikt om beter inzicht in de fenotypische gevolgen van de MET-achtige processen op sarcoma cellen, zoals migratie, invasie, metastatische neiging, en therapie weerstand.

Schema voor BMO inductie in sarcoma cellen Een algemene tijdschema voor de inductie van MET-achtige veranderingen in sarcoma cellen wordt getoond in figuur 1. Het protocol begint met transducerende GRHL2 (figuur 1A), gevolgd door transfectie van de familie miR-200 (Figuur 1B). GRHL2 of miR-200 familieleden waren niet in staat om de impact van de verschijning van RD-cellen wanneer...

We presenteren hier een celkweek werkwijze voor het induceren mesenchymale-epitheliale overgangen (MET) sarcoom cellen op basis van gecombineerde ectopische expressie van microRNA-200 familieleden en grainyhead-achtig 2 (GRHL2). Deze methode is geschikt voor een beter begrip van de biologische gevolgen van de fenotypische plasticiteit in de agressiviteit van kanker en behandelingen.

Inductie van mesenchymale-epitheliale Transities sarcoomcellen

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

Het algemene doel van deze procedure is om de fenotypische gevolgen van mesenchymaal-epitheliale transities in sarcomen te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over waarom epitheliale-achtige sarcomen superieure resultaten hebben in vergelijking met sarcomen die meer mesenchymaal-achtig zijn. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige, reproduceerbare manier biedt om downstream genregulerende netwerken en fenotypes te bestuderen die geassocieerd zijn met mesenchymaal-epitheliale transities in sarcomen.Door een beter begrip van fenotypische plasticiteit in sarcomen hopen we therapeutische interventies te identificeren waarmee we sarcomen kunnen verschuiven naar een meer indolente, epitheelachtige staat. De procedure zal worden gedemonstreerd door twee bachelorstudenten in ons laboratorium, Jackson Xu en Shivee Gilja. Zaai op de eerste dag van de transductie 3 × 10⁵ HEK293T-cellen in elk van twee putjes van een zesputjesplaat in 2 mL aangevuld DMEM.Incubeer de plaat bij 37 °C met 5% CO2. Onderzoek na een nacht cultiveren de cellen onder een microscoop. Ze moeten 40 tot 60% confluent zijn.Verdun vervolgens in aparte buisjes met 200 µL serumvrij medium, 1,8 µg p delta 8.9 en 0,2 µg pCMV-VSV-G helperplasmiden, twee µg van de lege vector en twee µg van de vector die GRHL2 bevat. Verdun in een ander buisje vier µL van een lipide-gebaseerd transfectiereagens in 200 µL serumvrij medium per transfectie. Voor twee monsters is dit acht µL en 400 µL.Voeg 200 µL van het mengsel van transfectiereagens toe aan elke plasmidenoplossing en incubeer de monsters vervolgens gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder ondertussen het medium van de HEK293T-cellen met een vacuümaspirator. Spoel de cellen één keer met 1 mL PBS en vervang de PBS vervolgens door 800 µL serumvrij medium.Voeg na 20 minuten 400 µL van het mengsel van transfectiereagens en plasmide druppelgewijs toe aan elke put met de geplaatse cellen. Incubeer de schaal gedurende twee uur bij 37 °C in 5% CO₂. Verwijder na de incubatie voorzichtig het transfectiemedium via vacuümaspiratie.HEK293T-cellen zijn zwak adherent, wees daarom voorzichtig bij het aspireren van het medium om te voorkomen dat de cellen van de bodem van de schaal of kolf worden verwijderd. Vervang het geaspireerde medium door twee milliliters gesupplementeerde DMEM. Plaats de cellen terug in de incubator voor een overnachtcultuur.Vernieuw de volgende dag het medium van de getransfecteerde HEK293T-cellen en zaai vervolgens 3 x 10⁵ menselijke rhabdomyosarcoomcellen van de RD-lijn uit in elke put van een zes-wellsplaat met twee milliliter gesupplementeerd DMEM per put. Cultiveer beide platen een nacht. Gebruik op de vierde dag een pipette om het virale medium van de HEK293T-cellen te verzamelen en breng dit over in twee nieuwe conische buizen van 15 milliliter, één voor het lentivirus met een lege vector en één voor het lentivirus met het GRHL2-plasmide.Vervang voorzichtig het medium door nieuw DMEM en plaats de HEK293T-cellen gedurende de nacht terug in de incubator. Voeg vervolgens twee µL polybrene van 10 mg/mL per milliliter viraal medium toe aan twee nieuwe conische buizen van 50 mL, één voor de transfectie van de lege vector en één voor de GRHL2-transfectie. Verwijder de zuiger uit een spuit van 3 mL en bevestig een polyethersulfonfilter van 0,45 µm aan de punt van de spuit.Voeg het eerder verzamelde virale medium toe aan de cilinder van de spuit en breng dit over in een van de nieuwe conische buisjes van 50 milliliter die polybrene bevatten. Herhaal deze stap met het andere monster. Verwijder vervolgens het medium van de RD-cellen via vacuümaspiratie en voeg twee milliliters van elk van de gefiltreerde virale mediummonsters toe aan afzonderlijke putjes van de RD-plaat.Incubeer de RD-cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator. Herhaal de volgende dag de collectie van het virale medium en voeg het infectiemedium toe aan dezelfde wells waarin de eerder geïnfecteerde RD-cellen zich bevinden. De HEK293T-cellen kunnen worden weggegooid nadat het virale medium is verzameld.Incubeer de cellen nog twee dagen. Was op de zevende dag de RD-cellen met 1 ml PBS en voeg vervolgens 200 µL 0,05% trypsine toe aan elke well. Incubeer gedurende vijf minuten bij 37 °C.Voeg twee milliliter aangevuld medium toe en breng de celsuspensie vervolgens over naar nieuwe conische buizen van 15 milliliter. Centrifugeer de cellen bij 250 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspireer na het centrifugeren het medium en resuspendeer de cellen in één milliliter DMEM aangevuld met 5% FBS en 1% penicilline streptomycin.Om de cellen te filteren ter voorbereiding op flowcytometrie, gebruikt u een pipet om de ene milliliter RD-cel suspensie door een steriel 30 micrometer tube top filter in flowcytometrie-buisjes over te brengen. Plaats de buisjes op ijs. Sorteer met behulp van een flowcytometer de EGFP-positieve cellen in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes die 0,5 milliliters DMEM bevatten, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.Plaats de gesorteerde cellen terug op ijs. Zaai de EGFP-positieve cellen van zowel de lege vector- als de GRHL2-transducties uit in in totaal één milliliter aangevulde DMEM in gescheiden putjes van een 12-wells plaat. Plaats de cellen vervolgens in de incubator voor kweek.De opbrengst van EGFP-positieve cellen na flowcytometrie is meestal vrij laag, in de range van 50.000 tot 100.000 cellen. Hierdoor moeten de cellen mogelijk nog 10 tot 14 dagen extra worden gekweekt voordat men doorgaat naar de volgende stap. Voeg in een microcentrifugebuis drie µL van elke 50 µM miR-200 mimic toe aan 300 µL serumvrij medium.Voeg in een aparte buis negen µL van 50 µM negatieve controle micro RNA toe aan 300 µL serumvrij medium. Voeg vervolgens in een andere microcentrifugebuis zes µL siRNA-specifiek transfectiereagens toe aan 600 µL serumvrij medium. Verdeel 300 µL van dit mengsel over twee buizen, één voor elk van de twee miR-mengsels.Combineer de 300 µL van elk miR-mengsel met een mengsel van 300 µL transfectiereagens. Incubeer dit gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Bereid tijdens het incuberen een celsuspensie voor van 600.000 EGFP-positieve RD-cellen die de MD-vector of GRHL2 tot expressie brengen in 2,4 mL met 250 cellen per µL serumvrij medium per behandeling.Voeg in een 24-wells plaat 100 µL per well van de miR-200 of de negatieve controlemix toe aan zes wells. Voeg vervolgens 400 µL van elke celсусpensie toe aan drie wells van elke miR-mix. Incubeer de plaat gedurende de nacht bij 37 °C in 5% CO2.Vervang de volgende dag het medium door volledig gesupplementeerd DMEM. Verzamel de cellen twee dagen later voor analyse met behulp van de geschikte buffer. Maak elke twee uur beelden van elke put met een 10X objectief met behulp van een geautomatiseerde live-cell imager.Deze time-lapsebeelden tonen de mesenchymaal-epitheliale transitie, of MET, in RD-cellen die GRHL2, EGFP en miR-200 miRNA's tot expressie brengen. De cellen veranderen van een spoelvormig uiterlijk naar een kasseistructuur, met toegenomen cel-celadhesies en een rondere morfologie. MET wordt niet waargenomen onder andere behandelingscondities.In plaats daarvan vertonen de cellen een langgerekte, spoelvormige morfologie met weinig cel-celverbindingen. Tijdens de inductie van MET ging de morfologische verandering in RD-cellen na overexpressie van GRHL2 en miR-200 gepaard met een upregulatie van de epitheliale marker E-cadherine, zoals gemeten via qPCR en western blotting. Toevoeging van miR-200s reguleerde E-cadherine alleen op, maar gecombineerde overexpressie van miR-200s en GRHL2 versterkte de expressie van E-cadherine synergetisch.Zoals aangetoond door immunofluorescentiemicroscopie, was er een toename van epitheliale adhesiemoleculen, EpCAM en TJP-1, bij de cel-celverbindingen, aangegeven door de witte pijlen. De opregulatie van epitheliale eiwitten ging gepaard met een neerregulatie van de mesenchymale genen ZEB1 en Notch1, bepaald via QRT-PCR. Inductie van MET verminderde de anchorage-onafhankelijke groei van RD-cellen, zoals gemeten met soft-agar groeiproeven.De groeiremming in soft agar werd uitsluitend veroorzaakt door miR-200s, aangezien overexpressie van GRHL2 leidde tot een toename van anchorage-onafhankelijke groei. Dit is consistent met eerdere rapporten die aantonen dat GRHL2-expressie anchorage-onafhankelijke groei induceert. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, waaronder assays om veranderingen in celmigratie, invasie, metastase en respons op therapie te meten, om de fenotypische gevolgen van MET in sarcomen te verduidelijken.

induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een eenvoudige werkwijze beschreven voor de inductie van epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) in verschillende celtypen. Methoden voor de analyse van cellen in EMT toestanden met immunocytochemie inbegrepen.

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Weefselbewerkt-fibroblast afgeleid inheemse matrix is ​​een opkomende hulpmiddel om een ​​stromale substraat dat epitheelcelproliferatie en differentiatie ondersteunt genereren. Hier een protocol deze methode toegepast op de impact van verschillende stromale celtypen op tumorcel biologie beoordelen wordt gepresenteerd.

Tissue Engineering van Tumor Stromal Microenvironment met Toepassing op Cancer Cell Invasion

Het is aangetoond dat de regulatie van alternatieve splicing bijdraagt aan de epitheel-mesenchymale overgang (EMT), een essentieel cellulair programma in verschillende fysiologische en pathologische processen. Hier beschrijven we een methode die gebruikmaakt van een induceerbaar EMT-model voor de detectie van alternatieve splicing tijdens EMT.

Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie

Hier beschrijven we de ontwikkeling en toepassing van een gelcontractie-assay voor het evalueren van contractiele functie in mesenchymale cellen die een epitheel-mesenchymale overgang hebben ondergaan.

Ontwikkeling van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay om contractiele functie van mesenchymale Cellen die Onderging-mesenchymale transitie Evalueer

Epitheliële naar mesenchymale overgang (EMT) maakt het mogelijk dat kankers invasief worden. Om EMT te onderzoeken, wordt een op neurale stamcellen (NSC) gebaseerd in vitro model beschreven dat vrij is van serum en enzymen. Dit gestandaardiseerde systeem maakt een kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van celmigratie, gen- en eiwitexpressie mogelijk. Het model is geschikt voor geneesmiddelontdekking.

Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery

Directe inspuiting van kanker afkomstige extracellulaire blaasjes (EVs) leidt tot een herprogrammering van beenmerg, ter ondersteuning van de progressie van de tumor; het is echter onduidelijk welke cellen bemiddelen dit effect. Hierin beschrijven we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken EV-gemedieerde tumor-mesenchymale stamcellen (MSC) interacties in vivo, onthullen een cruciale rol voor EV-opgeleide MSCs in metastase.

Een preklinische muismodel van osteosarcoom definiëren de extracellulaire vesikel-gemedieerde communicatie tussen Tumor en mesenchymale stamcellen

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de isolatie van tumor-initiërende cellen van humaan Sarcoom patiënt-afgeleide xenotransplantaten door fluorescentie-geactiveerde celsortering, waarbij gebruik wordt gemaakt van humaan leukocyten antigeen-1 (HLA-1) als een negatieve marker, en voor de verdere validering en karakterisering van deze HLA-1-negatieve tumor initiërende cellen.

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

Een protocol voor in vitro inductie van endotheel-mesenchymale overgang (EndMT), die nuttig is voor het onderzoeken van cellulaire signaalroutes die betrokken zijn bij EndMT, wordt beschreven. In dit experimenteel model wordt EndMT veroorzaakt door behandeling met TGF-β in MS-1 endotheliale cellen.

Moleculaire analyse van endotheel-mesenchymale overgang geïnduceerd door transformeren groeifactor-β signalering

Hier is het bot extracellulaire matrix (BEM) model voor Osteosarcoom (OS) gevestigde en getoond. Het kan worden gebruikt als een geschikte steiger voor nabootsen van primaire tumor groei in vitro en bieden een ideaal model voor het bestuderen van de histologische en cytogenic heterogeniteit van OS.

Driedimensionale bot extracellulaire Matrix Model voor Osteosarcoom

We beschrijven een systematische workflow om TGF-β signalering en TGF-β-geïnduceerde EMT te onderzoeken door de eiwit- en genexpressie te bestuderen die betrokken zijn bij deze signaleringsroute. De methoden omvatten western blotting, een luciferase reporter assay, qPCR, en immunofluorescentie vlekken.

TGF-β Signalering en TGF-β-geïnduceerde Epitheel-naar-mesenchymale overgang bij borstkanker en normale cellen bestuderen

Het huidige protocol beschrijft het opzetten van 3D 'bovenop' culturen van een niet-getransformeerde borstepitheelcellijn, MCF10A, die is aangepast om door Bloedplaatjes Activerende Factor (PAF) geïnduceerde transformatie te bestuderen. Immunofluorescentie is gebruikt om de transformatie te beoordelen en wordt in detail besproken.

Fosfolipide mediator geïnduceerde transformatie in driedimensionale culturen

Leer een celkweekmethode om mesenchymale-epitheliale transities in sarcoomcellen te induceren met microRNA-200 en GRHL2. Deze techniek helpt onderzoekers fenotypische plasticiteit en kankeragressiviteit beter te begrijpen.

Inductie van mesenchymale-epitheliale Transities sarcoomcellen

Meer video's verkennen