Name: Gemengde Primaire culturen van Muizen dunne darm Bestemd voor de Studie van Gut hormoon en live cell imaging van entero-Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer de isolatie en cultuur van gemengde muizen dunne darmcellen voor het bestuderen van darmpeptidesecretie en live cell imaging van entero-endocriene cellen. Deze methode maakt in vitro karakterisatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

GLP-1 immuno-assays werden uitgevoerd door de Core Biochemical Assay Laboratory in Addenbrooke&#39;s Hospital. Dit werk heeft in de loop der jaren, ondersteund door de Wellcome Trust (momenteel actief subsidies 106262 / Z / 14 / Z en 106263 / Z / 14 / Z) en de Medical Research Council (MRC) (subsidies MRC_MC_UU_12012 / 3 en MRC_MC_UU_12012 / 5).

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van Cambridge dierenwelzijn en ethische toetsingscommissie en gelijkvormigheid aan het Animals (Scientific Procedures) Act 1986 Wijziging Regulations (SI 2012/3039). 1. Voorbereiding <ol><li> Plaats een portie van basaalmembraanmatrix (BMM) (-200 pl) op ijs te ontdooien. OPMERKING: De BMM stolt bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Voorverwarmen 50 ml steriel hoog glucose Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) (zonder toevoegingen) en ~ 40 ml steriel kweekmedium (hoog-glucose DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline en 0,1 mg / ml streptomycine (P / S) en 2 mM L-glutamine) in 50 ml centrifugebuizen in een waterbad bij 37 ° C </li><li> Pre-chill calcium- en magnesium-bevattende fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Weeg 15 mg collagenase (XI ruw), aan een 50 ml centrifugebuis en houdt het op ijs. <ol><li&gt; LET OP: Collagenase schadelijk is. Het veroorzaakt irritatie van de huid (H315) en ernstige oogirritatie (H319). Het kan allergie of astmasymptomen of ademhalingsmoeilijkheden veroorzaken bij inademing (H334). Het kan irritatie van de luchtwegen (H335) veroorzaken. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, voorkomen stofvorming en te voorkomen dat het inademen van stof. Zorg voor voldoende ventilatie. </li></ol></li></ol> 2. Tissue Collection <ol><li> Voeg -20 ml L-15 medium in een 50 ml centrifugebuis en plaats op ijs. </li><li> Euthanaseren een muis door cervicale dislocatie of andere goedgekeurde schema 1 methode. OPMERKING: Darmweefsel is veelal afkomstig van muizen op een C57BL6 achtergrond. Echter, andere genetische achtergronden ook gebruikt bv 129 / SvEv 15. Afbeeldexperimenten vereisen het gebruik van fluorescerende reporter muizen bijv GLU-Venus 1. Weefsel wordt verkregen van volwassen muizen (2-6 maanden) van beide geslachten. De muizen worden ondergebracht in individually geventileerde kooien met ad libitum toegang tot water en regelmatige chow. Echter, experimenten om het effect van een vetrijk dieet te testen, bijvoorbeeld op enteroendocrine celfunctie 16 kan worden uitgevoerd als dit wordt ondersteund door een project licentie. </li><li> Ontleden en verwijder voorzichtig muizendarm (van pylorus naar het begin van het rectum) met behulp van een tang en dissectie schaar. Bewaar het in L-15 medium op ijs tot gebruik. </li></ol> 3. Weefselbereiding <ol><li> Plaats darmweefsel in een 10 cm petrischaaltje met PBS genoeg om het weefsel te bedekken. Neem 10 cm gewenste weefsels (bijv bovenste dunne darm, top 10 cm distaal van pylorus). </li><li> Spoelen darminhoud behulp van een plastic Pasteur pipet en gekoelde PBS. <ol><li> Behulp van een tang, delicaat grip ene uiteinde van de intestinale segment en plaats het uiteinde van een Pasteur pipet erin. Spoel inhoud met gekoelde PBS. Herhaal vanaf beide uiteinden totdat de majoteit van de inhoud werd gespoeld. Transfer naar een schone petrischaal met vers gekoeld PBS. </li></ol></li><li> Behulp van een tang, verwijder het vetweefsel en mesenterium, zorg om niet af te trekken van de spierlaag tegelijkertijd. </li><li> Schil de spierlaag off &quot;als een sok&quot; onder een dissectie microscoop met twee sets van fijne pincet. OPMERKING: Deze stap is niet noodzakelijk, maar wordt sterk aanbevolen. Er zijn andere manieren om het verwijderen van de spierlaag het hier beschreven. Bijvoorbeeld kan de darm worden opengesneden lengterichting eerst vóór het verwijderen van de spierlaag. <ol><li> Een uitgangspunt bij het meer proximale uiteinde van het weefsel, wanneer er een zichtbare flap spier. Trek weg een kleine hoeveelheid spierlaag helemaal rond de darm. Opmerking: Om scheuren van de spierlaag of darmepitheel voorkomen, verminderen de spankracht door klemmen een groter oppervlak in plaats van de tips van de fijne pincet. </li><li> Klem de darm en zoveel mogelijk van de spierlap mogelijk, trek uit elkaar en beginnen afpellen van de spierlaag van rond de darmen. Om te voorkomen dat het scheurt zowel de spierlaag en epitheel, houden bijstelling van de positie van de tang om ze dicht bij elkaar. Zo verwijdert de spierlaag van de gehele lengte van de intestinale segment en ontdoen. </li></ol></li><li> Snij de darm geopend lengterichting en wassen met de wervelende in een schone petrischaal met gekoelde verse PBS. Herhaal dit indien nodig om de resterende chyme of slijm te verwijderen. </li><li> Gehakt weefsel met een chirurgisch scalpel vierkantjes van ~ 1-2 mm 2 bereiken en deze toe tot ~ 20 ml gekoelde PBS in een 50 ml centrifugebuis met behulp van een Pasteur pipet. Om weefselstukjes vasthouden aan de pipet te voorkomen, afgesneden van de tip en nat de pipet door tritureren met PBS. </li><li> Schud de buis verder wassen stukken weefsel. Laat het weefsel bezinken en gieten of pipette van de meerderheid van de PBS en herhaal met verse PBS totdat de PBS duidelijk kijkt. </li></ol> 4. Bereiding van BBM-beklede plaat / Schotels en digestiemedium OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een weefselkweek kap (met incubatiestappen bij 37 ° C waterbad). <ol><li> Bereid een 2% oplossing in gekoeld BMM DMEM (zonder toevoegingen). Tijdens het werken, houd de oplossing op ijs. Voor een 2% oplossing, voeg 140 ul ontdooid BMM 7 ml DMEM (genoeg om een 24-putjesplaat te maken). <ol><li> Voeg 250 ul 2% BMM oplossing per putje (plaat met 24 putjes) of per glazen bodem imaging schaal. </li><li> Incubeer beklede platen / schotels voor ten minste 30 minuten in een incubator bij 37 ° C zodat er passende polymerisatie van de BMM. </li></ol></li><li> Voeg 50 ml voorverwarmde DMEM (zonder toevoegingen) naar 15 mg collagenase (volgens de stappen 1.2 en 1.4) van een 0,3 mg / ml te vormen en zwenken oplossen. <ol><li> Opce volledig opgelost, met behulp van een 20 ml spuit, filtreer de collagenase oplossing door een steriel 0,2 urn filter in een nieuwe steriele 50 ml centrifugebuis. Label deze als de vertering medium. </li></ol></li></ol> 5. Tissue Spijsvertering <ol><li> Verwijder het weefsel stukken uit de PBS met een 10 mL serologische pipet en aan een steriele 50 ml centrifugebuis die gekoelde steriele DMEM (zonder toevoegingen), draai en verwijder DMEM. Opmerking: Om weefsel vasthouden aan de serologische pipet voorkomen door nat wrijven met DMEM voorafgaand aan contact met het weefsel. </li><li> &#39;Digest 1 en 2: verwijdering van celafval en enkele cellen <ol><li> 7 ml digestiemedium aan het weefsel stukken en geven de buis een werveling. </li><li> Incubeer gedurende 5 min in een waterbad bij 37 ° C. </li><li> Schud (niet krul) de buis gedurende -3 s. </li><li> Laat het weefsel bezinken en gooi de digestiemedium, reserveren van eenklein volume te kijken naar onder de microscoop. OPMERKING: Vooral bij het starten, wordt sterk aanbevolen om een ​​klein volume van elke &#39;digest&#39; (~ 30 pi) onder de microscoop inspecteren om de voortgang van het verteringsproces meten. Als veel crypten worden waargenomen in dit stadium kan het schudden te hard zijn. Voor representatieve beelden van wat de verschillende &#39;digest&#39; stadia typisch eruit, zie figuur 1. </li><li> Herhaal stap 5.2.-5.2.4 (met verse spijsvertering gemiddeld). </li></ol></li><li> &#39;Digests&#39; 3-5: Collection of fragmenten crypt <ol><li> Voeg 7 ml spijsvertering medium aan het weefsel. </li><li> Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C. <ol><li> Tijdens de incubatie schud elke 5 min gedurende 10-12 s. Opmerking: Het schudden is krachtiger dan schudden &#39;digest&#39; 1 en 2. </li></ol></li><li> Toestaan ​​onverteerd weefsel bezinken en verzamel de vertering medium in een 15 ml centrifugebuis. Alsweefsel ongeluk verzameld samen met het medium, laat het bezinken, te verwijderen met behulp van een 10 ml serologische pipet en over te dragen naar de 50 ml centrifugebuis die onverteerd weefsel. </li><li> Centrifuge verzamelde medium / supernatant bij kamertemperatuur gedurende 3 min bij 100 x g. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 ml voorverwarmd kweekmedium door voorzichtige trituratie en vernietiging. </li><li> Inspecteert een klein volume van de celsuspensie onder de microscoop (zie toelichting uit stap 5.2.4). LET OP: In het ideale geval crypte fragmenten beginnen te verschijnen in &#39;verteren&#39; 3 samen met de cel puin en enkele cellen. &#39;Digests&#39; 4 en 5 bevat een significant groter aantal crypt fragmenten met verminderde celresten (figuur 1). Passen schudden intensiteit noodzakelijk dat wil zeggen als het weefsel niet verteert en crypte fragmenten worden niet weergegeven, schud krachtiger. </li><li> Herhaal stap 5.3.1-5.3.6 tot 5 &#39;verteert&#39; zijn geweestvoltooid of totdat het merendeel van het weefsel werd gedigesteerd (a 6e digest kan nodig zijn). </li><li> Zodra alle supernatanten van &#39;digesties&#39; 3-5 (of 3-6) zijn verzameld, gecentrifugeerd verteren bovenstaande vloeistoffen bij kamertemperatuur gedurende 3 min bij 100 x g. </li><li> Uitscheiding experimenten, combineren de supernatanten van &#39;digesties&#39; 3-5 (of 3-6) voorafgaand aan centrifugatie. OPMERKING: minder weefsel nodig voor afbeeldexperimenten Daarom kan voor de samenvatting supernatant die de schoonste (afwezigheid van celafval en enkele cellen) met het grotere aantal crypte fragmenten. Dit is typisch &#39;digest&#39; 4 of 5. </li><li> Verwijder het supernatant en voorzichtig resuspendeer de pellet door tritureren totdat er geen klonten zichtbaar. Resuspendeer de pellet in voorverwarmde kweekmedium aangevuld met 10 pM Y-27632 dihydrochloride (te anoikis 17 te voorkomen). Met 5 ml secretie experimenten en 2 ml kweekmedium voor afbeeldexperimenten. </li><li> Filtercelsuspensie door een 100-um filter (één onverteerd weefsel te verwijderen). Voer een verdere 2 ml voorverwarmd kweekmedium door het filter (totaal volume: 7 ml en 4 ml uitscheiding en imaging, respectievelijk) wassen. OPMERKING: filteren is echter niet essentieel, grotere weefselfragmenten neiging niet te hechten aan de plaat / borden. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> Figuur 1: Representatieve beelden van &#39;verteert&#39; uit primaire dunne darm kweekmethode. (A) Origineel materiaal van &#39;digesties&#39; 1 en 2 die in hoofdzaak enkele cellen en celresten. (B) Een voorbeeld van uit &quot;digest 3. De zwarte pijlen geven crypt fragmenten die in het verteren materiaal. (C) Typerend &#39;digest&#39; 4 of 5 Deelfiguur (D) voorstelt samengevoegd verwerken materiaal&#39;digesten&#39; 3-5 door een 100 urn filter om de ongewenste grotere weefselfragmenten zien in (C) te verwijderen. Alle foto&#39;s zijn genomen met een digitale omgekeerde microscoop met een 20X objectief. Schaalbalken = 100 urn. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> 6. Plating Intestinale Cultures (verrijkt voor cryptcellen) <ol><li> Overtollige BMM oplossing uit plaat of schotels en voeg 250 ul voorverwarmde kweekmedium per secretie goed. LET OP: In beeld brengen van gerechten worden achtergelaten zonder medium kunt u doorgaan naar de volgende stap te snel om te voorkomen dat het gerecht uitdroogt. </li><li> Plaat 250 ul celsuspensie per putje (plaat met 24 putjes) of per glazen onderste schaal. <ol><li> Plate druppelsgewijs in een langzame &#39;zig-zag&#39; beweging over de put. Toestaan ​​crypte fragmenten nemen met ~ 5 minuten alvorens de plaat aan The incubator. NB: Dit moet een gelijkmatige verdeling van crypten / cellen in de put aan te moedigen. </li></ol></li><li> Incubeer plaat of schotels een nacht bij 37 ° C en 5% CO2. OPMERKING: Een &#39;fragmentarisch&#39; monolaag zou hebben gevormd. Een representatief beeld van kweken na driemaal wassen, zie figuur 2A. </li><li> &#39;Flood&#39; imaging gerechten met 2 mL pre-verwarmd kweekmedium per schaal. LET OP: Deze gerechten zal geschikt zijn voor beeldvorming voor maximaal ~ 72 uur na plating. Colon culturen duren meestal langer, tot 7 dagen. Cellen die niet gehecht kan worden verwijderd door een wasstap. Primaire culturen nu worden gebruikt voor experimenten. </li></ol>

<ol><li>Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+sensing+in+L+cells%3A+A+primary+cell+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Glucose sensing in L cells: A primary cell study.</a> Cell Metab. 8, 532-539 (2008).</li>
<li>Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+chemosensing+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gut chemosensing mechanisms.</a> J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).</li>
<li>Lovshin, J. A., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19444259">Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).</li>
<li>Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gut+hormone+secretion.+Studies+using+isolated+perfused+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines.</a> Peptides. 77, 47-53 (2016).</li>
<li>Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+glucose-stimulated+GLP-1+secretion+from+perfused+rat+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine.</a> Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).</li>
<li>Brighton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acids+trigger+GLP-1+release+predominantly+by+accessing+basolaterally+located+G+protein-coupled+bile+acid+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors.</a> Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).</li>
<li>Petersen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+L+cells+in+mouse+and+human+small+intestine+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids.</a> Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).</li>
<li>Brubaker, P. L., Vranic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+rat+intestinal+cells+in+monolayer+culture%3A+a+new+in+vitro+system+to+study+the+glucagon-like+immunoreactive+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides.</a> Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).</li>
<li>Kuhre, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+production+and+secretion+in+GLUTag%2C+NCI-H716%2C+and+STC-1+cells%3A+a+comparison+to+native+L-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells.</a> J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ATOH1+and+Neurog3+requirements+define+tuft+cells+as+new+secretory+cell+type+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium.</a> J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).</li>
<li>Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+pathways+involved+in+the+detection+of+peptones+by+murine+small+intestinal+enteroendocrine+L-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells.</a> Peptides. 77, 9-15 (2016).</li>
<li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).</li>
<li>Emery, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+GLP-1+secretion+downstream+of+the+ligand-gated+ion+channel+TRPA1%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1.</a> Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).</li>
<li>Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galanin+inhibits+GLP-1+and+GIP+secretion+via+the+GAL1+receptor+in+enteroendocrine+L+and+K+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells.</a> Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).</li>
<li>Tolhurst, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+fatty+acids+stimulate+glucagon-like+peptide-1+secretion+via+G-protein-coupled+receptor+FFAR2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2.</a> Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).</li>
<li>Richards, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+impairs+the+function+of+glucagon-like+peptide-1+producing+L-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells.</a> Peptides. 77, 21-27 (2016).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient-dependent+secretion+of+glucose-dependent+insulinotropic+polypeptide+from+primary+murine+K+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells.</a> Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).</li>
<li>Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+type+1+receptor-dependent+GLP-1+and+PYY+secretion+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans.</a> Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).</li>
<li>Moss, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatostatin+receptor+5+and+cannabinoid+receptor+1+activation+inhibit+secretion+of+glucose-dependent+insulinotropic+polypeptide+from+intestinal+K+cells+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents.</a> Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).</li>
<li>Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-localisation+and+secretion+of+glucagon-like+peptide+1+and+peptide+YY+from+primary+cultured+human+L+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells.</a> Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft de isolatie en kweek van gemengde muis kleine darmcellen de studie van darm peptidesecretie en single cell imaging gemerkte entero-endocriene cellen mogelijk. Om de waarschijnlijkheid van de dunne darm kweken slagen vergroten, is het belangrijk dat het protocol zo snel mogelijk (bij voorkeur binnen 3 uur van het oogsten van het weefsel) wordt uitgevoerd en dat het weefsel in ijskoud medium gehouden of buffer voorafgaand aan het verteringsproces, om celdood te beperken. Hoewel het niet essentieel is, vooral voor colon culturen, is het verwijderen van de spierlaag van de dunne darm sterk aangemoedigd. De dunne darm cultuurprotocol gestandaardiseerd zoveel mogelijk. Het is echter belangrijk op te merken dat er geen verteringsproces is identiek. Er zijn veel stappen in dit protocol, waar variabiliteit op een dag-tot-dag basis kan worden ingevoerd bijvoorbeeld de mate van de spier te verwijderen, de grootte van thij gehakt &#39;weefselstukjes de sterkte schudden, de potentie van een bepaalde partij collagenase enz. Het is daarom van het grootste belang hoeveelheden van elk van de verschillende &quot;digesten inspecteren onder de microscoop om de voortgang van het verteringsproces maat en de ratel en het aantal &#39;digest&#39; dienovereenkomstig beoordelen. Het wordt aanbevolen om meer schud om te beginnen en zo de crypte fragmenten niet duidelijk uit &#39;digest&#39; 3 verder te gaan trillen krachtiger. Vanuit onze ervaring, entero-endocriene cellen niet vermenigvuldigen in cultuur en zijn meestal verloren van de dunne darm culturen binnen 4 dagen. Toch is dit laat voldoende tijd om gut peptidesecretie experimenten fysiologische prikkels en / of farmacologische middelen te testen (gewoonlijk over 2 uur, 18-24 uur na plateren uitgevoerd). Experimenten die een incubatie overnacht vóór de afscheiding experiment zijn ook mogelijk bvbij voorbehandeling met pertussis toxine 15. De primaire kweek techniek hier wordt gepresenteerd is een bekende methode, zoals blijkt uit de omvang van de onderzoeksoutput het heeft door de jaren heen geproduceerd. De primaire kweek model werd gebruikt om de uitscheiding van een verscheidenheid aan darmpeptiden, waaronder GLP-1 1, GIP 18 en 19 PYY bestuderen in reactie op diverse nutriënten en non-nutriënten 14, 20 prikkels en remmers. Verder dezelfde techniek is met succes toegepast voor de kweek van humane darmcellen 21. Vaak is een combinatie van de primaire celkweek werkwijze tezamen met een aanvullend experimenteel model bv. ex vivo of in vivo kan de meest inzicht 6 te bieden. Met name en in tegenstelling tot andere methoden, deze techniek heeft important toepassingen buiten het meten van darm neuropeptidevrijgave. We hebben aangetoond dat primaire dunne darm kweken afgeleid van transgene reportermuizen krachtige instrumenten voor het ondervragen van intracellulaire signaleringsroutes gekoppeld met peptidesecretie gut, waarbij bijvoorbeeld Ca2 + en cAMP sensors, GCaMP3 11, 13 en Epac2camps 14 respectievelijk en elektrofysiologische technieken 12. Zoals bij alle in vitro modellen, de primaire kweken intestinale hebben bepaalde inherente beperkingen waaronder het verlies van polariteit van de epitheliale cellen in kweek, en het verlies van toevoer en innervatie bloed. Het is moeilijk om de mogelijke gevolgen van deze kunstmatige omstandigheden te schatten op enteroendocrine celfunctie. Echter, gegevens verkregen uit primaire culturen vaak transleerbaar in de in vivo setti geweestng (zoals de invloed van korte-keten vetzuren op GLP-1 uitscheiding 15). De primaire intestinale culturen zijn een veelzijdige techniek met vele mogelijke toepassingen. Zij hebben reeds belangrijk mechanistisch inzicht in de regulering van de darm peptide secretie.

De algemene doelstelling van deze methode is om te isoleren en cultuur gemengde muizen darmcellen aan de studie van darm peptide secretie en live cell imaging van entero-endocriene cellen mogelijk te maken. Een vroege versie van deze procedure werd oorspronkelijk gepubliceerd in 2008 door Reimann et al. 1 en is sindsdien vormde de basis van een verdere 20 publicaties van onze groep. Voor dit manuscript, hebben we gekozen om zich te concentreren op de dunne darm culturen zoals ze zijn moeilijker vast te stellen dan colon culturen. Entero-endocriene cellen scheiden een reeks darmpeptiden waaronder glucagon-achtig peptide 1 (GLP-1), glucose-afhankelijke insulinotrope peptide (GIP), cholecystokinine (CCK) en peptide YY (PYY) 2. Deze darmpeptiden hebben belangrijke fysiologische rol bij het orkestreren van de postprandiale respons zoals het vertragen van de darm doorvoer, versterking van glucose gestimuleerde insulineafgifte en inductie van verzadiging. GLP-1 mimetica and geneesmiddelen die de afbraak remmen momenteel goedgekeurd voor de behandeling van type 2 diabetes en er continue evaluatie van het therapeutisch potentieel van het stimuleren van de endogene secretie van dit peptide 3. Een beter begrip van entero-endocriene fysiologie en de mechanismen waarvan secretie ofwel gestimuleerd of geremd is dus van cruciaal belang. Gut peptidesecretie kan worden onderzocht met verschillende in vitro en ex vivo experimentele modellen, elk met voor- en nadelen (voor een uitgebreide recente herziening ook betrekking tot het gebruik van in vivo modellen wordt Svendsen et al. 4). Ex vivo technieken zoals de geïsoleerde geperfuseerde darm 5 en 6 Ussingkamers worden momenteel gebruikt om gut peptidesecretie verkennen in reactie op verschillende stoffen. Het belangrijkste voordeel van deze methoden,vergeleken met primaire kweken, dat de directe omgeving van de entero-endocriene cellen blijft grotendeels intact en belangrijker, wordt de polariteit van de cellen behouden. Daarom is het mogelijk om informatie over welke celoppervlak een secretagogum handelt 6 wekken. Echter, deze zijn meestal low-throughput technieken en de kwaliteit van de gegevens die zijn afgeleid van hen is sterk afhankelijk van de integriteit en de levensvatbaarheid van het darmweefsel, wat onvermijdelijk verloop van tijd afnemen. Intestinale organoids worden steeds meer gebruikt als in vitro modellen voor de studie van de entero- endocriene cel functie en ontwikkeling 7. Organoids, die kan worden afgeleid uit zowel muizen- als menselijke weefsels, hebben het voordeel van het vormen van 3D &#39;crypt-achtige&#39; structuren die cel polariteit in kweek te handhaven. Echter, organoïde afgeleide entero-endocriene cellen nog niet volledig gekarakteriseerd en hun gelijkenis met natuurlijk L CELls blijft grotendeels onbekend. Primaire culturen hebben het voordeel dat dichterbij de fysiologische instelling waarbij entero-endocriene cellen niet worden onderhouden en gedifferentieerd kunstmatige omstandigheden gedurende lange tijdsperioden. Een alternatieve primaire kweek methode die toegepast is voor de beoordeling van de darm peptidesecretie is de isolatie van foetale ratten darmcellen (FRICS) 8. Echter, de cultuur van volwassen darmweefsel heeft een ontmoeting gehad met minder succes en een aantal verschillen zijn waargenomen in het reactievermogen van FRICS vs. volwassen muizen darmcellen (bijvoorbeeld glucose 8). Entero-achtige cellijnen (bijv GLUTag, STC-1 en NCI-H716) werden traditioneel gebruikt om onderscheid te maken tussen vs. indirecte effecten op entero-endocriene cellen en onderliggende moleculaire mechanismen koppelen stimulans secretie ontleden; Zie Kuhre et al </em&gt;. 9 voor peptide productie en secretie van &#39;L celachtige&#39; geïmmortaliseerde cellijnen. Dit is nodig omdat entero-endocriene cellen, verspreid langs het maagdarmkanaal geweest, vormen iets minder dan 1% van darmepitheelcellen 10 en gesorteerde cellen, in onze handen, niet overleven in cultuur 1. Cellijnen blijft nuttige instrumenten vanwege het feit dat ze een grotendeels homogene celpopulatie die bevorderlijk is voor genetische manipulaties zoals gen-silencing. Derhalve is het gemakkelijk om de rol van eiwitten die niet farmaceutisch kunnen worden gericht, terwijl transgene muizen zijn niet beschikbaar onderzoeken. Echter, cellijnen zijn niet altijd geldig modellen van primaire cellen. Hoewel er veel overeenkomsten, bevindingen uit primaire culturen soms verschillen aangetoond tussen de signaleringsroutes geactiveerd door bepaalde voedingsstoffen in primaire L-cellen ten opzichte van GLUTag cellen, bijvoorbeeld (bijv. Peptonen &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 11). Cruciaal in combinatie met fluorescerende reporter transgene muizen, de primaire kweek model kunnen uitvoeriger behandeling van afzonderlijke primaire entero- endocriene cellen in het intracellulaire niveau. Fluorescent gemerkte L-cellen in primaire kweken zijn gebruikt door onze groep patch klemmen 1, 12 studies en eencellige calcium 11, 13 en cyclisch adenosine monofosfaat-FRET beeldvorming 14 studies die aanzienlijke vooruitgang opgeleverd op het gebied van entero fysiologie. Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor het uitvoeren secretie experimenten onder toepassing van een 24-wells plaat of voor de bereiding van maximaal 16 beeldvorming gerechten, van een 10 cm deel van de dunne darm van een volwassen muis. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast voor de studie van colon cellen door het verhogen digestietijden en collagenase concentratie.

<table><tbody><tr><td>24-well plates</td><td>Costar</td><td>3524</td><td>Voor secretie-experimenten</td></tr><tr><td>Bombesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4272</td><td>Positieve controle (calcium-imaging-experiment)</td></tr><tr><td>Centrifugebuizen, 15 mL, steriel</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td>Voor weefselvoorbereiding/vertering</td></tr><tr><td>Centrifugebuizen, 50 mL, steriel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430828</td><td>Voor weefselvoorbereiding/vertering</td></tr><tr><td>Collageenase XI (Ruw)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>Voor het samenstellen van het verteringsmedium</td></tr><tr><td>Dichroische spiegel</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>Voor beeldvormingsexperimenten</td></tr><tr><td>DMEM Hoge glucose (4500 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6546</td><td>Voor het oplossen van matrigel (bewaar bij 4 &deg;C). Voor het samenstellen van het verteringsmedium, voorverwarmen tot 37 &deg;C.</td></tr><tr><td>Emissiefilter (Bandbreedte 510-560 nm)</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>Voor beeldvormingsexperimenten</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>Voor het samenstellen van het kweekmedium</td></tr><tr><td>Pincetten/Tweezers</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT520</td><td>Voor dissectie/verwijdering van darm</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td>Positieve controle (secretie-experiment)</td></tr><tr><td>Glazen bodem schotel (35 mm)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>Voor beeldvormingsexperimenten</td></tr><tr><td>Hoge precisie pincet (110 mm)</td><td>IDEAL-TEK</td><td>3480641 (5 SA)</td><td>Voor het verwijderen van de spierlaag</td></tr><tr><td>Hoge resolutie digitale CCD-camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-ER</td><td>Voor beeldvormingsexperimenten</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Positieve controle (secretie-experiment)</td></tr><tr><td>L-15 Medium (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Voor het verzamelen van weefsel, bewaar op ijs</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Voor het samenstellen van het kweekmedium</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Basement Membrane Matrix, voor het coaten van platen en schalen</td></tr><tr><td>MetaFluor&nbsp;</td><td>Molecular Devices (geleverd door Cairn Research)</td><td>-</td><td>Fluorescentie-verhoudingsbeeldvormingssoftware</td></tr><tr><td>Muizen (C57BL6)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>C57BL/6J</td><td>Achtergrondmuizen gebruikt voor fokken. Kan ook worden gebruikt voor secretie-experimenten</td></tr><tr><td>Muizen (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td><td>in house</td><td>-</td><td>Voor calcium-imaging en secretie-experimenten</td></tr><tr><td>Microscoop (EVOS XL Core)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>Voor fotomicrografieën van culturen</td></tr><tr><td>Microscoop&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Omgekeerde microscoop met 40X olie-objectief gebruikt voor beeldvormingsexperimenten</td></tr><tr><td>Monochroom</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>Voor beeldvormingsexperimenten</td></tr><tr><td>Pasteur-pipetten</td><td>Alpha Laboratories</td><td>LW4234</td><td>Voor het reinigen van weefsel</td></tr><tr><td>PBS bevattend Ca2+ en Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>Voor het wassen van weefsel, bewaar op ijs</td></tr><tr><td>Penicilline &amp; Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>Voor het samenstellen van het kweekmedium</td></tr><tr><td>Petrischalen (100 mm x 20 mm)</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td>Voor het reinigen van weefsel en het verwijderen van de spierlaag</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td>Positieve controle (calcium-imaging-experiment)</td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT554</td><td>Voor dissectie/verwijdering van darm</td></tr><tr><td>Steriele celzetter 100 &micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>Voor het filteren van cryptecelsuspensie voor het plateren</td></tr><tr><td>Chirurgisch scalpelmes nr.22 (sterieel, roestvrij)</td><td>Swann Morton</td><td>0308</td><td>Voor het snijden van weefsel</td></tr><tr><td>Spuitfilters, Minisart NML (0,2 &micro;m poriegrootte)</td><td>Sartorius</td><td>16534-K</td><td>Voor het filter-steriliseren van de collageenase-oplossing (verteringsmedium)</td></tr><tr><td>Spuiten, 20 mL, wegwerp, sterieel, Luer-slip</td><td>BD</td><td>300613</td><td>Voor het filter-steriliseren van de collageenase-oplossing (verteringsmedium)</td></tr><tr><td>Xenonbooglamp 75W</td><td>Cairn Research</td><td>-</td><td>Voor beeldvormingsexperimenten</td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>ROCK-remmer, bereid een 10 mM stamoplossing in steriel water (gebruik 1:1.000 in het uiteindelijke kweekmedium)</td></tr></tbody></table>

gemengde primaire culturen van muizen dunne darm bestemd voor de studie van gut hormoon en live cell imaging van entero-cells

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

De darm is de grootste endocrien orgaan van het lichaam, met afscheidende entero-endocriene cellen die zich langs de lengte van het maag-epitheel. Ondanks hun fysiologisch belang, entero-endocriene cellen slechts een kleine fractie van de epitheliale celpopulatie en in het verleden hun karakterisatie aanzienlijke uitdaging resulteert in een afhankelijkheid cellijn modellen gepresenteerd. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de isolatie en de cultuur van gemengde muizen kleine darmcellen. Deze primaire kweken werden gebruikt om de signaalwegen onderliggende stimulatie en remming van darm peptidesecretie identificeren in responsie op een aantal voedingsstoffen en neuropeptiden als farmacologische middelen. Verder wordt in combinatie met het gebruik van transgene fluorescente reporter muizen, hebben we aangetoond dat deze primaire kweken een krachtig hulpmiddel voor het onderzoek van fluorescent-gemerkte entero-endocriene cellen bij het intracellular niveau, onder toepassing van werkwijzen zoals patchklemmen en eencellige calcium en cAMP-FRET beeldvorming.

Het gebruik van seriële digestiestappen maakt het verzamelen van een relatief zuiver preparaat van crypte fragmenten te plateren voor experimenten. De eerste twee digesties verwijderen hoofdzakelijk enkelvoudige cellen en celresten uit het verteren materiaal (Figuur 1A). Tijdens de derde digest, crypt fragmenten worden in het gedigereerde materiaal (Figuur 1B). Verteert 4 en 5 een opbrengst groter aantal crypt fragmenten met minder enkelvoudige cellen (Figuur 1C). Filteren van het gepoolde materiaal digesties 3-5 verwijdert grote stukken onverteerd weefsel, die schadelijk zijn voor de kweek kan worden, waardoor een schone crypte fragment bereiding (figuur 1D). Na 18-24 uur kweek worden monolagen van primaire dunne darm cellen waargenomen (Figuur 2A). Gebruik culturen gegenereerd uit transgene muizen die het specifiek calCium fluorescentie sensor GCaMP3, onder controle van de promoter proglucagon 11, L cellen omlijnd en verspreid in de kweek (figuur 2B). In primaire kweken dunne darm, verbindingen gericht de Gq-Ca 2+ i en i cAMP afhankelijke paden stimuleerde de secretie van GLP-1 (uitscheiding experiment methode zien Reimann et al. 1). Bombesine (BBS, 100 nM) en gezamenlijk aanbrengen van forskoline en 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (F / I, 10 pM elk) veroorzaakt een 2- en 11-voudige stimulatie van GLP-1 afgifte ten opzichte basale respectievelijk (Figuur 2C). Specifieke L celexpressie van GCaMP3 maakt de identificatie van en de real-time monitoring van calcium mobilisatie in individuele L-cellen. Beide 100 nM bombesine (BBS) en 30 mM kaliumchloride (KCl) gestimuleerde tijdelijke stijgingen van intracellulair calcium indicatief is voor de bekende Gq &lt;/ sub&gt; - en elektrogeen-gekoppelde trajecten in primaire L-cellen (Figuur 2D). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> Figuur 2: Representatieve gegevens afkomstig van primaire kweken dunne darm. Voorbeeld afbeeldingen gemengde primaire dunne darm kweken gebruikt voor (A) secretie en (B) afbeeldexperimenten onderbrengen 24 uur plating. (A) Beeld uit een 24-putjesplaat, met een digitale omgekeerde microscoop met een 4x objectief. Schaal bar = 500 urn. (B) Met GLU-Cre x ROSA26 GCamP3 muizen L cellen in het gezichtsveld (groene cellen) geïdentificeerd door de fluorescentie van GCaMP3. Schaalbalk staat voor 50 urn. (C) GLP-1 uitscheiding werd gemeten als reactie op bombesine (BBS, 100 nM) en forskoline / 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (F / I, 10 pM elk). Percentage GLP-1 uitscheiding berekenddoor het meten van GLP-1 niveaus in de supernatanten en cellysaten. De gegevens stellen de gemiddelden ± SEM van n = 3 voor elke omstandigheid. (D) GCaMP3 fluorescentie (reflecterend cytosolische calcium) van de twee cellen beschreven in (B) volgde onmiddellijk plaats in reactie op kaliumchloride (KCl, 30 mM) en BBS (100 nM). Single cell imaging werd uitgevoerd met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een 40X olie-immersie objectief. GCaMP3 werd geëxciteerd bij 475/10 nm, onder toepassing van een 75 W xenon booglamp en een monochromator gecontroleerd door fluorescentie beeldverwerkingssoftware. Emissie werd opgenomen met een hoge-resolutie digitale ladingsgekoppelde inrichting (CCD) camera met een dichroïsche spiegel en een 510-560 nm bandbreedtefilter. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft de isolatie en kweek van gemengde muis kleine darmcellen. Deze primaire kweken intestinale maken het onderzoek signaalroutes onderliggende darm peptidesecretie behulp van een aantal technieken.

Gemengde Primaire culturen van Muizen dunne darm Bestemd voor de Studie van Gut hormoon en live cell imaging van entero-Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Het algemene doel van deze methode is het isoleren en kweken van gemengde muis-intestinale cellen om de studie van darmpeptide-secretie en live-cell imaging van entero-endocriene cellen mogelijk te maken. We hebben deze methode oorspronkelijk ontwikkeld om de in vitro karakterisering van entero-endocriene cellen mogelijk te maken. Entero-endocriene cellen bewaken de darminhoud en reguleren de homeostase van het lichaam.Ze zijn echter moeilijk te bestuderen omdat ze verspreid liggen over het darmepitheel. De hier beschreven calcis zijn bijzonder nuttig in combinatie met genetische fluorescentiemarkering van entero-endocriene cellen, aangezien dit het gebruik van elektrofysiologische single-celltechnieken en live-cell imaging mogelijk maakt. De procedure zal worden gedemonstreerd door Cheryl Brighton, een post-doc in ons laboratorium.Begin met het overbrengen van een geïsoleerd muisduodenum naar een petrischaal van 10 centimeter gevuld met PBS. Pak met een pincet voorzichtig één uiteinde van het darmfragment vast en voer de tip van een pasteurpipet in het lumen. Spoel vervolgens de darminhoud schoon met gekoelde PBS.Herhaal dit voor beide darmuiteinden totdat het grootste deel van de inhoud is verwijderd. Breng de gespoelde darm over naar een schone petrischaal gevuld met verse, gekoelde PBS. Verwijder onder een dissectiemicroscoop alle vetweefsels en mesenterium van het darmfragment, terwijl wordt voorkomen dat de spierlaag loslaat.Identificeer vervolgens een flap van de spierlaag aan het proximale uiteinde van het weefsel. Trek daarna, met behulp van twee sets fijne pincetten, voorzichtig een klein deel van de laag rondom de gehele darm weg. Pak de darm en zoveel mogelijk van de spierflap vast, trek vervolgens de lagen voorzichtig uit elkaar en begin de spierlaag rondom de darm af te pellen.Houd de pincetten dicht bij elkaar om te voorkomen dat de spierlaag en het epitheel scheuren. Verwijder de spierlaag over de gehele lengte van het darmfragment. Open vervolgens de darm door deze in de lengte door te snijden en breng deze over naar een schone petrischaal met vers gekoelde PBS.Schud het weefsel om alle resterende chimeer of slijm weg te wassen. Zodra het is gewassen, snijdt u het weefsel met een chirurgisch scalpellamesje in vierkantjes van ongeveer één tot twee vierkante millimeter. Breng vervolgens de verkregen fragmenten met een vochtige pasteurpipet met een vooraf afgeknotte tip over naar een centrifugebuis van 50 milliliter die gevuld is met ongeveer 20 milliliter gekoelde PBS.Schud de buis voorzichtig om de weefselfragmenten extra te wassen en laat het weefsel bezinken. Zodra het weefsel is bezonken, wordt het grootste deel van de PBS geaspireerd en wordt het monster nogmaals gewassen met verse PBS. Om de darm te verteren, wordt een serologische pipet van 10 milliliter gebruikt om de weefselfragmenten over te brengen naar een steriele centrifugebuis van 50 milliliter met gekoelde steriele DMEM; draai de suspensie rond, laat het weefsel bezinken en verwijder vervolgens het medium.Voeg 7 milliliters van het digestiemedium toe aan de weefselfragmenten en wervel de suspensie. Incubeer de suspensie in een waterbad bij 37 degrees Celsius gedurende vijf minuten. Schud de buis na incubatie voorzichtig gedurende ongeveer drie seconden.Centrifugeer het onverteerde weefsel tot een sediment en breng het digestiemedium over naar een centrifugebuis van 15 milliliter. Laat eventueel per ongeluk meegenomen weefsel bezinken en breng dit met een serologische pipette van 10 milliliter terug naar de centrifugebuis van 15 milliliter met het onverteerde weefsel. Bewaar een klein volume van het digestiemedium voor microscopische observatie en gooi de rest weg.Controleer de inhoud van het digestiemedium onder de lichtmicroscoop om er zeker van te zijn dat de suspensie niet veel crypten bevat. Voeg vervolgens 7 milliliters vers digestiemedium toe en voer de digestieprocedure nogmaals uit. Om de cryptfragment-suspensie te bereiden, voegt u 7 milliliters vers digestiemedium toe aan de darmfragmenten.Incubeer het weefsel in een waterbad bij 37 °C gedurende tien minuten. Schud het monster ditmaal langer en krachtiger, elke vijf minuten. Laat het onverteerde weefsel bezinken en breng het digestiemedium over in een centrifugebuis van 15 ml.Laat eventueel per ongeluk verzameld weefsel bezinken en breng dit met een serologische pipet van 10 milliliter terug naar de centrifugebuis van 50 milliliter met het onverteerde weefsel. Voeg 7 milliliter vers digestiemedium toe aan de darmfragmenten en start de volgende digestie. Centrifugeer vervolgens het medium dat bij de vorige digestie is verzameld bij 100 x g bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.Nadat het supernatant is weggegooid, wordt het celpellet opnieuw gesuspendeerd in 5 milliliters van het voorverwarmde kweekmedium door voorzichtig te pipetteren. Zet vervolgens het monster apart en neem een klein aliquot van de celsuspensie. Bevestig onder de lichtmicroscoop dat het monster geïsoleerde cryptfragmenten bevat.Herhaal de digestie van het weefsel nog 2-3 keer of totdat het grootste deel van het weefsel is gedigesteerd. Zodra de supernatanten van de digestie zijn verzameld, worden deze samengevoegd en wordt het monster drie minuten gecentrifugeerd bij 100x g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet door voorzichtig te pipetteren, totdat er geen klonten meer zichtbaar zijn, in 5 milliliters voorverwarmd kweekmedium aangevuld met 10 micromolar Y-27632 om anoikis te voorkomen.Filter tot slot de celсусpensie door een 100 micron filter om onverteerd weefsel te verwijderen. Was het filter met nog eens 2 milliliters van het voorverwarmde kweekmedium aangevuld met Y-27632. Haal de met basement membrane matrix gecoate plaat uit de incubator voordat de cellen worden uitgezaaid.Verwijder het overschot aan basaalmembraanmatrix-oplossing uit de plaat en voeg aan elke put 250 µL van het voorverwarmde kweekmedium toe, aangevuld met 10 µM Y-27632. Zaai per put van de 24-wells plaat 250 µL van de celсусpensie uit door druppelsgewijs te pipetteren in een langzame zigzagbeweging. Incubeer de plaat gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2.Hier worden de microscoopbeelden gepresenteerd van de monolagen van de primaire dunnedarmcellen, genomen na 18 tot 24 uur cultivatie. Primaire dunnedarmcellen die in vitro werden gekweekt, reageerden op stimuli die intracellulair calcium of cyclisch AMP verhogen, wat resulteerde in een tweevoudige toename van de afgifte van glucagon-like peptide-1 wanneer de cellen werden behandeld met bombesine, en een elfvoudige toename van de secretie bij gelijktijdige stimulatie met forskoline en IBMX. Ten slotte werd, met behulp van culturen gegenereerd uit transgene muizen die GCAMP 3 tot expressie brengen onder controle van de pro-glucagonpromotor, aangetoond dat primaire L-cellen uit de dunnedarm reageren op stimulatie met bombesine en kaliumchloride met een toename van cytosolisch calcium, zoals gedemonstreerd door de verhoogde fluorescentie.De gedemonstreerde procedure is gericht op de kweek van cellen uit de dunne darm, wat door veel laboratoria als uitdagend wordt ervaren. We gebruiken een vergelijkbare praktische methode voor de kweek van andere darmsegmenten, zowel van muis- als menselijke oorsprong. Eenmaal beheerst kan deze techniek in vier uur worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd.Geen twee preparaten zijn hetzelfde, dus het is belangrijk om te onthouden dat aliquoten van elk digestaat onder de microscoop moeten worden geïnspecteerd. Hierdoor kunt u de voortgang beoordelen en de intensiteit van het schudden en het aantal digesten dienovereenkomstig aanpassen.

mixed-primary-cultures-murine-small-intestine-intended-for-study-gut

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel en de bijbehorende video presenteren ons protocol voor het genereren van weefsel-engineered darm in muizen, waarbij een organoid units-on-scaffold benadering.

Tissue Engineering van de darm in een muizenmodel

Verbeterde beeldvormingstechnologie maakt driedimensionale beeldvorming van organen mogelijk tijdens de ontwikkeling. Hier beschrijven we een systeem voor de kweek van hele organen dat levende beeldvorming van de zich ontwikkelende villi in de foetale muizendarm mogelijk maakt.

Muis Foetale Hele Darm Cultuur System voor Ex Vivo Manipulatie van signaalwegen en Driedimensionale Live-Imaging van Villus Development

We beschrijven een methode om humane enteroïden te kweken uit kleine darmcrypten en colonoïden uit coloncrypten die zijn verzameld uit zowel chirurgisch weefsel als biopsieën. In dit methodologische artikel presenteren we de kweekmodaliteiten die essentieel zijn voor het succesvolle groeien en onderhouden van humane enteroïden en colonoïden.

Oprichting van Human Epithelial Enteroids en Colonoids van Whole Tissue en Biopsie

Enterochromaffin (EG) cellen bestaan uit een kleine subset van gastro-intestinale epitheliale cellen. EG cellen zijn elektrisch prikkelbaar en vrij serotonine, nog moeilijkheden in kweken en het identificeren van de EG cellen hebben beperkte fysiologische studies. De methode die hier gepresenteerd wordt een primaire cultuur model vatbaar voor onderzoek van afzonderlijke cellen van de EG vastgesteld door electrofysiologie.

Hele cel electrofysiologie van primaire gekweekte lymfkliertest Enterochromaffin cellen

Hier presenteren we een krachtige en fysiologische model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de darm hormoon afscheiding en intestinale absorptie — de geïsoleerde geperfundeerd rat dunne darm.

Mechanismen die ten grondslag liggen aan de Gut hormoon afscheiding met behulp van de geïsoleerde geperfundeerd Rat dunne darm

In dit protocol beschrijven we hoe murine primaire epitheliale colon monolayers rechtstreeks uit intestinale crypten kunnen worden gegenereerd. We bieden experimentele benaderingen om samenvloeiende monolagen te genereren op doorlatende filters, confluente monolagen voor kraswondgenezing en biochemische studies, en schaarse en samenvloeiende monolagen voor immunofluorescentieanalyse.

Generatie van Murine Primaire Colon Epitheliale Monolayers uit Intestinal Crypts

Dit artikel presenteert een unieke methode voor het analyseren van gastheer-microbioom interacties met behulp van een nieuw darmorgaancultuursysteem voor ex vivo experimenten.

Een darmorgaankweeksysteem voor het analyseren van host-microbiota-interacties

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van type-1 aangeboren lymfoïde cellen uit de muriene dunne darm lamina propria, en het vaststellen van 3-dimensionale (3D) co-culturen tussen beide celtypen om bi-directionele interacties tussen intestinale epitheelcellen en type-1 aangeboren lymfoïde cellen te bestuderen.

Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

We beschrijven een protocol om murine dunne darmcrypten en kweekdarm 3D-organoïden uit de crypten te isoleren. Daarnaast beschrijven we een methode om organoïden te genereren uit een enkele darmstamcel in afwezigheid van een sub-epitheliale cellulaire niche.

De 3D-kweek van organoïden uit murine darmcrypten en een enkele stamcel voor organoïde onderzoek

Hier beschrijven we de constructie van een basis driedimensionaal (3D) intestinale cellijnmodelsysteem en een paraffine-inbeddingsprotocol voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten. Kleuring van geselecteerde eiwitten maakt de analyse van meerdere visuele parameters van een enkel experiment mogelijk voor mogelijk gebruik in preklinische onderzoeken naar geneesmiddelen.

Basis driedimensionaal (3D) darmmodelsysteem met een immuuncomponent

Leer de isolatie en cultuur van gemengde muizen dunne darmcellen voor het bestuderen van darmpeptidesecretie en live cell imaging van entero-endocriene cellen. Deze methode maakt in vitro karakterisatie mogelijk.

Gemengde Primaire culturen van Muizen dunne darm Bestemd voor de Studie van Gut hormoon en live cell imaging van entero-Cells

Meer video's verkennen