Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling
18 mei 2017
Peptide competitiebepalingen worden veel gebruikt in een verscheidenheid aan moleculaire en immunologische experimenten. Dit document beschrijft een gedetailleerde methode voor een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse en de bijbehorende validatieprocedures, die nuttig kunnen zijn om specifieke fosforyleringsplaatsen te vinden.
Het algemene doel van deze procedure is om meerdere potentiële fosforylatieplaatsen tegelijkertijd te beoordelen en plaatsen te identificeren voor verdere validatie door fosforylatieplaatsmutanten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biochemie en celbiologie over de rol van post-translationele modificaties in celsignalering. Deze techniek maakt eenvoudige, budgetvriendelijke voorlopige screening voor fosforylatieplaatsen en de eiwit van belang mogelijk.
De implicatie van deze techniek strekt zich uit naar de diagnose en therapie van ziekten, inclusief ontsteking en kanker, omdat fosforylatie een belangrijk biochemisch evenement is in signaalroutes bij menselijke ziekten. Bij de demonstratie zal Sol-Bi Shin, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium, helpen met het uitvoeren van plaatsgerichte mutagenese. Combineer eerst 50 nanogram van het plasma pGEX JST NRF2, 125 nanogram van de voorwaartse primer, 125 nanogram van de achterwaartse primer, één microliter van DNTP mix, 2,5 eenheden van PFU DNA-polymerase en 10x reactiebuffer op ijs.
Voeg steriele gedistilleerd water toe om het volume tot 50 microliter te brengen. Voer PCR uit om de mutante streng te integreren en koel vervolgens het monster gedurende twee minuten op ijs. Voeg één microliter van DPNI restrictie-enzym toe aan het afgekoelde monster.
Meng het monster met voorzichtig pipetteren en centrifugeer vervolgens het monster gedurende één minuut bij 13.000 keer G. Incubeer het monster gedurende twee uur bij 37 graden Celsius om het ouderlijke dubbelstrengs DNA te verteren. Gooi vervolgens supercompetente E.coli-cellen met endA1 en RACA1 mutaties op ijs. Voeg 50 microliter van het reactiemengsel toe aan de gekoelde cellen en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
Verwarm intussen een verwarmingsblok voor tot 42 graden Celsius. Zodra de incubatie voltooid is, verwarm het mengsel gedurende 90 seconden op 42 graden Celsius en koel het mengsel vervolgens gedurende twee minuten op ijs. Voeg voorverwarmd Lysogeny-bouillon toe aan de getransformeerde cellen.
Incubeer het mengsel gedurende één uur bij 37 graden Celsius terwijl het geschud wordt op 180 RPM. Verspreid vervolgens de cellen op LB-ampicilline agar platen en incubeer de platen een nacht bij 37 graden Celsius. Breng een enkele kolonie over naar vijf milliliter Lysogeny-bouillon met ampicilline.
Incubeer de monsters een nacht bij 37 graden Celsius terwijl ze geschud worden op 180 RPM. Extraheer het monsters DNA met behulp van een standaard mini prep kit voor DNA sequentie analyse. Voer ten minste 200 nanogram van HDNA construct uit in een DNA analyzer om de mutante sequentie te verifiëren.
Druk en zuiver het gevalideerde mutante NRF2 eiwit uit. Bepaal de hoeveelheid gemuteerde NRF2 die geproduceerd is voordat u doorgaat naar de kinase assay. Om de peptide competitie assay te starten, bereid een 5X kinase buffer oplossing met een adenosine monofosfaat concentratie van 500 micromolair.
Ontdooi vervolgens bevroren monsters van AMPK wild type menselijke NRF2 en drie oligopeptiden die de AMPK fosforylatieplaatsen van NRF2 nabootsen. Combineer voor elk peptide, terwijl op ijs, 0,43 milligram van het peptide met 0,15 microgram van AMPK, 0,4 microgram van NRF2 en zes microliters van 5X Kinase Buffer. Voeg steriele gedistilleerd water toe om een eindvolume van 30 microliter te bereiken.
Stel vervolgens in een afgeschermd gebied een verwarmingsblok in op 30 graden Celsius. Voeg één microcurie van gamma 32P ATP toe aan elke buis, terwijl u elke oplossing grondig mengt door op en neer te pipetteren. Incubeer de reactiemengsels gedurende 15 tot 30 minuten bij 30 graden Celsius.
Tijdens de incubatie bereidt u een 7,5%STS PAGE gel voor. Voeg vervolgens drie microliters van 10X STS monsterbuffer toe aan elke buis en meng grondig om de kinase reactie te stoppen. Voer de monsters in de gel uit bij 70 volt gedurende 20 minuten en vervolgens bij 140 volt gedurende één uur.
Na het voltooien van de gelelektroforese verwijdert u voorzichtig de sterk radioactieve gel onder de broomfenolblauwe lijn. Breng de gel voorzichtig over van de caster naar een glazen buis. Fixeer de gel gedurende 20 minuten in een oplossing van 50%methanol, 40%water en 10%azijnzuur.
Leg de gel vervolgens voorzichtig op filterpapier en bedek deze met transparante folie. Droog de gel gedurende één uur bij 80 graden Celsius met een vacuümgeldroger. Belicht de droge gel gedurende ongeveer 16 uur of twee dagen op een fosforscherm of een röntgenfilm.
Gebruik een Phosphorimager om een hoogwaardige TIFF of Bitmap-bestand van het scherm te genereren. Om de AMPK activiteitstest te starten, ontdooit u monsters van AMPK en van mutant en wild type GST NRF2 op ijs. Combineer 0,4 microgram van mutant GST NRF2 met 0,15 microgram van AMPK en zes microliters van 5X Kinase buffer.
Voeg steriele gedistilleerd water toe om het volume tot 30 microliter te brengen. Bereid een andere reactiemengsel op dezelfde manier met 0,4 microgram van wild type GST NRF2. Voeg één microcurie van gamma 32P ATP toe aan elk reactievat.
Pipetteer de mengsels meerdere keren op en neer en centrifugeer vervolgens kort de mengsels. Incubeer de mengsels gedurende 30 minuten bij 30 graden Celsius in een afgeschermd gebied en beëindig vervolgens de kinase reactie met drie microliters van 10X STS monsterbuffer. Voer STS PAGE uit, fixeer de gel en droog de gel onder dezelfde omstandigheden als de competitieve kinase assay.
Belicht de gel overnacht op een fosforscherm en scan het scherm met de Phosphorimager. Een in vitro AMPK assay werd uitgevoerd in aanwezigheid van drie oligopeptiden van 10 residuen die de AMPK fosforylatieplaatsen op menselijk NRF2 nabootsen. Het oligopeptide dat de Serine 558 plaats nabootst, bood de grootste competitie voor AMPK fosforylatie.
Een NRF2 mutant die Serine 558 vervangt door alanine werd vervolgens gesynthetiseerd en geë
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het uitvoeren van in vitro oligopeptide-competing kinase-assays om specifieke fosforylatieplaatsen te identificeren. De techniek is waardevol voor voorlopige screening in biochemisch en celbiologisch onderzoek.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Peptidcompetitie-assays zijn essentieel in moleculaire experimenten.
- Fosforylering speelt een cruciale rol in celsignalering.
- Begrip van fosforylatie kan helpen bij ziektediagnose en therapie.
- Deze methode maakt budgetvriendelijk screenen van fosforylatieplaatsen mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om meerdere potentiële fosforylatieplaatsen tegelijkertijd te beoordelen.
- Om plaatsen te identificeren voor validatie door fosforylatieplekmutanten.
- Om de implicaties van fosforylatie in ziekten zoals kanker en ontsteking te verkennen.
Gebruikte methoden
- Combinatie van specifieke hoeveelheden plasmide-DNA, primers en polymerase.
- Uitvoeren van plaatsgerichte mutagenese.
- Uitvoeren van oligopeptide-competing kinase-assays.
- Validatie van fosforylatieplaatsen door middel van experimentele procedures.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van specifieke fosforylatieplaatsen voor verder onderzoek.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode in voorlopige screenings.
- Inzichten in de rol van post-translationele modificaties in signalering.
- Mogelijke toepassingen in het begrijpen van ziektemechanismen.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare aanpak voor het screenen van fosforylatieplaatsen.
- Het heeft belangrijke implicaties voor onderzoek in biochemie en celbiologie.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze techniek om ziektegerelateerde fosforylatie te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables early-stage screening of phosphorylation sites to support target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. By identifying functional phosphorylation sites through peptide competition, it provides predictive confidence for downstream assay development and lead identification efforts. The approach reduces reliance on low-throughput mutagenesis, accelerating hypothesis testing in signaling pathway research relevant to oncology and inflammatory disease targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by screening multiple potential phosphorylation sites simultaneously.
- Operational Value: Enables rapid identification of sites for validation using phosphorylation site mutants.
- Strategic Value: Supports predictive confidence in target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream kinase assay standardization.
- Operational Value: Delivers quantitative phosphorylation readouts amenable to high-throughput adaptation.
- Strategic Value: Enhances screening readiness for compound effect evaluation on phosphorylation dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by linking phosphorylation to signaling in cancer and inflammation.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation via mutant-based confirmation.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by clarifying mechanistic roles of post-translational modifications.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to lead identification, particularly for kinases and signaling pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through site-specific phosphorylation screening.
- Screening: Enables assay readiness via quantitative, reproducible phosphorylation measurements.
- Analytics: Generates comparative readouts that help prioritize sites for functional validation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating sites in disease-relevant contexts.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable screening platform across multiple targets and kinase families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility of phosphorylation site assessment.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by focusing resources on validated sites.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on phosphorylation-driven mechanism confidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in kinase assay design and radioactive detection methods.
- Dependent on access to phosphorimager or x-ray film detection infrastructure.
- Necessitates standardization across peptide synthesis and mutant protein expression.
- Involves adaptation considerations for non-radioactive detection systems.
- Limited by the need for prior knowledge of consensus phosphorylation motifs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
8:31
Conclusion
7:39
Results: In Vitro AMPK Assays with Competitive Oligopeptides or a Site-specific Mutant Protein
1:05
Site-directed Mutagenesis of pGEX-Nrf2
3:45
In Vitro Competitive 5' Adenosine Monophosphate-activated Protein Kinase (AMPK) Assay
6:13
In Vitro AMPK Activity Assay with a Site-specific Mutant
