Name: Beoordeling van Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve en intracellulaire diastolische Calcium verwijdering in geïsoleerde ventriculaire Cardiomyocytes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Leer de evaluatie van sarcoplasmatisch reticulum calciumreserve en diastolische calciumverwijdering in geïsoleerde ventriculaire cardiomyocyten. Deze methode onderzoekt calciumafhandeling bij diabetes en hartfalen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (nr. 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), de medische en Health Science programma van de provincie Zhejiang (nr. 201646246, Dongwu Lai), en de wetenschap van de gezondheid en Plan van de technologie van Hangzhou City (nr. 2013A28, Ding Lin).

alle dierproeven werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij experimentele Research Center, China Chinese medische academie en Zhejiang Universiteit.
 1. bereiding van de oplossing <ol><li>bereiden alle oplossingen zoals beschreven in tabel 1.</li></ol>
 2. isolatie van links ventriculaire (LV) Cardiomyocytes Opmerking: LV cardiomyocytes zijn geïsoleerde enzymatisch met behulp van een Langendroff perfusie systeem zoals eerder beschreven 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
<ol><li>Opzetten van de Langendroff perfusie systeem. Vul de perfusie-systeem met normale Tyrode (NT) oplossing, de temperatuur vastgesteldop 36,5 ° C en elimineren alle luchtbellen in de buis.</li>
	<li>Wegen en anesthetize van een rat Sprague-Dawley door intraperitoneale injectie (ip) van Chloraalhydraat (400 mg/kg). De verdoving status bevestigen door de beoordeling van de staart of teen snuifje reactie na 5 min.</li>
	<li>Open de buikholte onder de xiphoid process met een chirurgische scissor, heffen de xiphoid process, en open de borst met de schaar. Verwijderen van het hartzakje, iets til het hart met een gebogen Tang, identificeren van de aortaboog en afgesneden van het hart door de schaar in de hoofdmap van de aorta.</li>
	<li>Het hart overbrengen in een schotel van 60 mm en wassen met NT oplossing. Houd de aorta met twee micro-ontrafeling pincet, mounten op de canule Langendorff perfusie en vervolgens stevig het afbinden van de aorta naar de canule met behulp van chirurgische hechtingen. 
	Opmerking: Een geschoolde operator kan eindigen dit proces binnen 15 s.</li>
	<li>Perfuse het hart met 30 mL NT om te herstellen van de omloop van de kransslagaderen. Schakel het perfusaat tot 30 mL Ca 2 +-vrije Tyrode oplossing (10 mM Taurine, 1 mg/mL BSA) om te stoppen met de hartslag. Vervolgens schakelen het perfusaat Collagenase A isolatie oplossing (0,6 mg/mL) voor een enzym vertering. 
	NB: Gebruik Collagenase A voor experimenten met diabetische ratten of Collagenase II voor experimenten zonder diabetesratten.</li>
	<li>Na vertering voor 20-25 min, snel omzetten in de perfusie-oplossing de Ca 2 +-vrije Tyrode oplossing om te stoppen verdere vertering. Houdt het hart met een tang, afgesneden van de canule en het hart in een 35-mm-schotel met KB oplossing te plaatsen (Zie tabel 1).</li>
	<li>Ontleden de LV muur met een schaar en pincet. Afgesneden van het atrium, rechterventrikel en Atrioventriculaire junction gebied. Het resterende weefsel is de LV; Breng dit in een nieuwe 35-mm schotel met KB oplossing. Het LV-weefsel in kleine stukjes gehakt.</li>
	<li>Voorzichtig de stukken met een gefilterde kunststof druppelaar Pipetteer en resuspendeer in 10 mL KB oplossing.</li>
	<li>Filteren de cellen met 150 µm diafragma RVS filter, en overdracht aan een centrifugebuis 15 mL. Centrifugeer bij 150 x g gedurende 30 s en negeren de bovendrijvende substantie. Resuspendeer de myocytes in 10 mL KB oplossing, gratis regelen voor 6 min, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 mL KB oplossing. 
	Opmerking: Alle stappen zijn uitgevoerd bij 36 ° C in oplossingen vergast met 100% O 2.</li>
</ol> 3. Calcium herinvoering <ol><li>na afwikkeling van gedurende 20 min. in KB oplossing, verwijder het supernatant en resuspendeer de myocytes met calcium herinvoering oplossing A (0.3 mM Ca 2 +, 4.5 mL Ca 2 +-gratis Tyrode oplossing, 1,5 mL NT oplossing) voor 10 min.</li>
	<li>Herhaal de bovenstaande procedure met calcium herinvoering oplossing B (0.3 mM Ca 2 +, 3 mL Ca 2 +-gratis Tyrode oplossing, 3 mL NT oplossing).</li>
	<li>Herhaal de bovenstaande procedure met NT oplossing (1.2 mM Ca 2 +) voor het zuiveren van de beschikbare myocytes. De geïsoleerde LV myocytes worden opgeslagen in deze oplossing en bestuderen ze binnen 4-6 h.</li>
</ol> 4. Set Up van perfusie System <ol><li>verbinden de instroom-buis met de NT oplossing voor kamer perfusie ( figuur 1A).</li>
	<li>Voor naald perfusie van het target-myocyte, sluit u de multi vat spruitstuk tip (b.v., perfusie potlood, hierna potlood voortaan), opgelost in de micromanipulator, aan de klep gecontroleerde perfusie systeem. NT oplossing en 10 mM cafeïne oplossing toevoegen aan elke kolom van het potlood ( figuur 1A).</li>
	<li>Luchtbellen in de buizen om te voorkomen dat de lucht blokkade evacueren.</li>
	<li>Het aantal infuus van de micron tip het potlood voor 10 s, en het handmatig aanpassen van de regulator van de stroom de stroom om snelheid te houden met een geschatte snelheid van 3 infuus/10 s.</li>
</ol> 5. Metingen van intracellulaire Ca 2 + Transiënten- en verkorting van de Sarcomeer 7 , 8 , 9 <ol><li>Pipetteer 10 µL celsuspensie op de dia cel getallen tellen door een teller van de cel onder de Microscoop en de dichtheid te berekenen. Verdun myocytes een geschatte concentratie van 50.000 cellen/mL.</li>
	<li>Toevoegen de Fura-2 acetoxymethyl (AM) voorraad (een calcium gevoelige kleurstof) in een 1 mL suspensie van myocytes om de uiteindelijke concentratie aan 2 µM. houden in het donker gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Centrifuge bij 150 g voor 30 s en resuspendeer de cardiomyocytes met NT oplossing 2 keer.</li>
	<li>Zet het licht uit en houden van de cellen in het donker. Plaats de myocytes in de zaal van de perfusie gedurende 15 minuten. Start de kamer perfusie (1,5 mL/min) met NT oplossing. De myocytes tempo met 1 Hz veld stimulatie met behulp van een stimulator (Golf duur 4.0 ms, pulse amplitude 8.0 V) voor 5 min.</li>
	<li>Selecteer een myocyte met goede vorm (vorm van de staaf, scherpe rand en schakel kruis strepen) en stabiele gestimuleerd kramp (geen spontane samentrekking) onder de 10 x microscopische objectief. Vervolgens de microscopische zoomfactor wijzigen tot 40 x en draaien van de oriëntatie van de camera CCD om te houden van de myocyte in een horizontale positie.</li>
	<li>Frame de één myocyte door de cel framing-adapter aan te passen. Zorg ervoor dat de achtergrond duidelijk.</li>
	<li>Bloot de myocytes aan het licht dat wordt uitgestraald door een Xenon lamp, met 340 of 380 nm golflengte excitatie filters, en beeld de myocytes via een 40 x doelstelling. Detecteren van fluorescentie signaal op 510 nm. In de tussentijd, noteer de Sarcomeer lengte wijzigingen van de myocytes en registreren met behulp van de soft-edge-module tegelijk.</li>
	<li>Record fluorescentie door een dual-excitatie fluorescentie fotomultiplicator systeem. Voer het opnameprogramma voor het calcium imaging systeem, klikt u op &#34; bestand/nieuw bestand &#34; een nieuwe opnamebestand te maken, en klik op de &#34; start &#34; knop synchroon fluorescentie en Sarcomeer recordlengte.</li>
</ol> 6. Beoordeling van SR Ca 2 + Reserve en diastolische Ca 2 + functie voor het verwijderen 7 , 8 , 9 <ol><li>Interlink de &#34; Aux Out &#34; haven in de stimulator met de &#34; analoog In &#34; poort op het ventiel controlesysteem (b.v., de bevelhebber van de klep, Zie Tabel van materialen) door een BNC-kabel (om te synchroniseren de TTL-signaal).</li>
	<li>Preset een programma voor het schakelen van de perfusie-kleppen automatisch als eerder beschreven 8 , 9; Gedetailleerde stappen voor operatie worden vermeld als volgt.
	<ol><li>Preset de parameters in de klep controle software volgens tabel 2, en klikt u op de &#34; Download &#34; knop voor het downloaden van de volgorde in het programma geladen. Klik op de &#34; Triggeh &#34; knop om de trigger functie. 
		Opmerking: Het controlesysteem van de klep kan de volgorde uitvoeren na ontvangst van de TTL-signaal.</li>
		<li>Definitie van de stimulator aan reeks mode en stel de parameters volgens tabel 3.</li>
	</ol></li> <li>Instellen de stimulator op &#34; S1 stap &#34; aan het tempo van de LV beginnen myocytes op 1 Hz. de perfusie van de naald op de snelheid van 1,5 mL/min met NT oplossing. 
	Opmerking: Omdat de snelheid van de naald-stream sneller dan zaal perfusie is, de lichtbreking van de naald-stream is anders dan de lichtbreking van kamer perfusie. Het verschil van licht breking geeft aan het aantal effectieve naald perfusie, die de target myocyte omringt.</li>
	<li>Selecteer een doel-myocyte onder de microscopische weergave van laag vermogen (in de volgorde van stroomafwaarts naar upstream) en zorg ervoor dat het kan worden bereikt door de micro-punt van het potlood. De Microscoop vergroting naar 400 x wijzigen Draaien van de oriëntatie van de camera CCD om te houden van de myocyte in de horizontale positie. De rechthoekige opening onder de cel framing adapter op een geschikte venster dat wordt gevuld met de myocytes aanpassen. Ervoor zorgen dat er minimale achtergrond; andere myocytes of dode cel puin in dit venster niet toegestaan.</li>
	<li>Pas de positie van het potlood vast op de micromanipulator, en zorgvuldig plaats de micro tip op de afstand van de straal van de target myocyte veld visie onder 400 x Microscoop vergroting.</li>
	<li>Aanpassen van het bereik van de stream naald zodat het meestal betrekking hebben op de target myocyte en ervoor te zorgen dat de myocyte kan niet worden weggevaagd door de naald stroom.</li>
	<li>Na 60 s fundamentele pacing, roll de cursor van de stimulator aan de &#34; D2 stap &#34;. 
	Opmerking: De rest van protocol zal automatisch worden uitgevoerd door de stimulator- en controlesysteem van de klep. Op basis van de bovenstaande instelling, het protocol kan automatisch worden uitgevoerd zoals in figuur 2A, 1 Hz fundamentele pacing met NT oplossing voor 60 s. Vervolgens onderbreken pacing en vertraging voor 2 s, snel overschakelen naar 10 mM cafeïne perfusie voor 15 s (functioneel om vrij te geven Ca 2 + opslag in de SR), en ga vervolgens terug naar NT oplossing.</li>
	<li>Aan het einde van de opname, detecteren de fluorescentie van de achtergrond voor individuele myocytes. Klik op de &#34; onderbreken &#34; knop als u wilt onderbreken het bestand opnemen, de microscopische weergave verplaatsen naar een nabijgelegen leeg gebied. Klik op de &#34; record &#34; knop om de opname te hervatten seconden, en het opnemen van numerieke 340 en 380 nm intensiteitswaarden voor achtergrondcorrectie.</li>
	<li>Open de &#34; bewerking/constante &#34; dialoogvenster en vul de waarden in de &#34; achtergrond &#34; vormen, respectievelijk; de software Fura 2 verhouding waarden door af te trekken van de achtergrond kunt corrigeren.</li>
</ol> 7. Data analyse 9 <ol><li>voor metingen van calcium Transiënten en Sarcomeer verkorten de fundamentele pacing stadium, het gemiddelde van de kramp pulsen en vervolgens analyseren dynamische parameters, zoals calcium transiënten, de tijdconstante van calcium voorbijgaande verval (Tau-1 Hz), met behulp van de software automatisch. 
	Opmerking: Als de software het verval segment niet goed past, exporteert u de daling trace voor handmatige mono-exponentiële curve-fitting.</li>
	<li>Voor cafeïne geïnduceerde calcium pulsen, selecteert u alleen de pols met een steile Golf voor analyse van de functie voor het verwijderen van calcium. Uitsluiten van de cellen met de signaal verstoring, abnormale hartslag of die weg midway stroomde.</li>
	<li>Meten van de amplitude van de cafeïne-geïnduceerde calcium pols (Ca-cafeïne, een index van SRCa 2 + reserve).</li>
	<li>Verkrijgen van de constante voor cafeïne geïnduceerde calcium pulse (Tau-cafeïne) het verval door mono-exponentiële curve passend (10 s duur) handmatig uit de software ( figuur 2C).</li>
</ol>

<ol><li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca+%282%2B%29-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80(2015).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li>
<li>Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+decay+of+Ca2%2B+homeostasis+in+the+development+of+diabetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Diabetol%22%5BJournal%5D)">Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy.</a> Cardiovasc Diabetol. 13, 75(2014).</li>
<li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+diabetic+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes.</a> Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).</li>
<li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).</li>
<li>Ferrantini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R4496C+RyR2+mutation+impairs+atrial+and+ventricular+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility.</a> J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).</li>
<li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII+inhibition+in+heart+failure%2C+beneficial%2C+harmful%2C+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+kinase+inhibitor%2C+fasudil%2C+ameliorates+diabetes-induced+cardiac+dysfunction+by+improving+calcium+clearance+and+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling.</a> J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).</li>
<li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+Current-Induced+Abnormal+Impulses+in+CaMKII%CE%B4+Knockout+Mouse+Ventricular+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKIIδ Knockout Mouse Ventricular Myocytes.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+L-type+calcium+current+and+cardiac+function+in+CaMKII%7Bdelta%7D+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice.</a> Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).</li>
<li>Roussel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoyl-carnitine+increases+RyR2+oxidation+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+in+cardiomyocytes%3A+Role+of+adenine+nucleotide+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).</li>
<li>Yaras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diabetes+on+ryanodine+receptor+Ca2%2B+release+channel+%28RyR2%29+and+Ca2%2B+homeostasis+in+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart.</a> Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Overexpression+of+O-GlcNAcase+Improves+Contractile+Function+in+the+Diabetic+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart.</a> Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Calcium flux vrijgelaten uit de SR is de belangrijke Ca2 + bron voor systole in het hart. Zekere hoogte, de amplitude van SR Ca2 + inhoud en de fractionele Ca weerspiegelen2 + vrijgelaten uit de SR de SR Ca2 + reserve beschikbaar voor cardiale contractie. Aan de andere kant, hangt de Ca2 + reserve voor SR af van het vermogen van SR Ca2 + reuptake, Ca2 + lekken van SR en hun balans over de SR tijdens de diastole12,</s...

Intracellulair calcium ([Ca2 +]ik) recycling speelt een cruciale rol in de regulering van de systolische en diastolische functie in cardiomyocytes1. Zoals we weten, initieert de calcium-geïnduceerde Ca2 + release de excitatie-contractie koppeling, die vertalen het elektrische signaal naar contractie. Membraan depolarisatie activeert de sarcolemmal L-type Ca2 + kanalen, die ertoe Ca2 bewegen + van de SR in het cytoplasma via ryanodine receptoren 2 (RyR2 vrijwaart). De tijdelijke verhoogde cytoplasmatische Ca2 + initieert samentrekking van myofibrils. Tijdens de diastole, cytoplasmatische Ca2 + is reuptaken in de SR door middel van de SR Ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) en gepompt uit de cardiomyocyte via de nb+-Ca2 + exchanger (NCX)2. Dit proces leidt tot contractie-ontspanning recycling in de cardiomyocyte.
De cardiale SR is een netwerk van intracellulaire membraan dat de contractiele machines omringt. Het fungeert als een Ca2 + reservoir voor contractie, en het reabsorbs intracellulaire Ca2 + tijdens ontspanning. De SR Ca2 + reserve beschikbaar voor beats is bepalen voor cardiale contractility. Ondertussen, de verwijdering van intracellulaire Ca2 + is essentieel voor cardiale diastole. Sommige pathofysiologische omstandigheden, zoals diabetes en hartfalen, verminderde Ca2 + inklaring en depressief SR Ca2 + kan winkel in cardiomyocytes worden betrokken in het proces van cardiale dysfunctie2,3 ,4.
Voor het meten van SR Ca2 + release en diastolische Ca2 + verwijdering in cardiomyocytes, er zijn twee veelgebruikte methoden: de integriteit van de NCX huidige gebaseerd op patch-clamp5,6, en de cafeïne-geïnduceerde Ca 2 + pulse gebaseerd op Ca2 + fluorescentie imaging7,8,9. De voormalige aanpak hangt af van het feit dat de Ca2 + vrijgelaten uit de Slowaakse Republiek grotendeels uit de cel door NCX gepompt is. Deze aanpak wordt echter beperkt door de eis van geavanceerde apparatuur en bekwame bediening. In de huidige studie beschrijven we een handige aanpak om te beoordelen van SR Ca2 + reserve en Ca2 + verwijdering in myocytes door het meten van een cafeïne-geïnduceerde Ca2 + puls op basis van een Ca2 + fluorescentie imaging systeem. Kort, intracellulaire Ca2 + fluorescentie wordt aangegeven door Fura-2. Door koppeling van de stimulatie systeem en perfusie systeem, presenteren we een programma voor het schakelen van de perfusie en pacing systeem automatisch. 10 mM cafeïne werkte te snel bewegen totaal Ca2 + release in de SR. De exponentiële afname tijd-constanten zijn (Tau) van calcium Transiënten- en cafeïne-geïnduceerde calcium peulvruchten zijn verkregen van mono-exponentiële curve passend, die de bijdrage van de SERCA en NCX aan diastolische Ca2 + verwijdering dienovereenkomstig weerspiegelen.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>012314</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Alfa Aesar</td><td>012315</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>11595</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16828</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18395</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>011594</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15031</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12403</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Roche</td><td>735094</td><td></td></tr><tr><td>caffeine</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX 71</td><td></td></tr><tr><td>Langendorff system</td><td>Beijing Syutime Technology Co</td><td>PlexiThermo-S-LANGC</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Marchauser</td><td>MM33 links</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion chamber</td><td>IonOptix</td><td>FHD</td><td></td></tr><tr><td>Valve Controlled Gravity Perfusion System</td><td>ALA</td><td>VC 3-8</td><td></td></tr><tr><td>valve commander software</td><td>ALA</td><td>VC 3 1.0.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Precision flow regulator</td><td>Delta Med</td><td>3204315</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil</td><td>AutoMate Scientific</td><td>04-08-[360]</td><td></td></tr><tr><td>Micron Removable Tip</td><td>AutoMate Scientific</td><td>360um i.d.</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems</td><td>IonOptix</td><td>Hyperswitch</td><td></td></tr><tr><td>Recording software</td><td>IonOptix</td><td>IonWizard 6.2.59</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-dawley rats</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.</td><td>SCXK 2016-01-007436</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van sarcoplasmic reticulum calcium reserve en intracellulaire diastolische calcium verwijdering in geïsoleerde ventriculaire cardiomyocytes

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Recycling van intracellulair calcium speelt een cruciale rol in de regulering van de systolische en diastolische functie in cardiomyocytes. Cardiale sarcoplasmic reticulum (SR) fungeert als een Ca2 + reservoir voor contractie, welke reuptakes intracellulaire Ca2 + tijdens ontspanning. De SR Ca2 + reserve beschikbaar voor beats is bepalen voor cardiale contractibility, en de verwijdering van intracellulaire Ca2 + is essentieel voor de diastolische hartfunctie. Onder sommige pathofysiologische aandoeningen, zoals diabetes en hartfalen, kunnen verminderde calcium mijnen en SR Ca2 + winkel in cardiomyocytes worden betrokken in de voortgang van cardiale dysfunctie. Hier beschrijven we een protocol om SRCa2 + reserve en diastolische Ca2 + verwijdering te evalueren. Kortom, een enkele cardiomyocyte werd enzymatisch geïsoleerd en de intracellulaire Ca2 + fluorescentie aangegeven door Fura-2 werd opgenomen door een calcium imaging systeem. Gebruiken cafeïne voor inducerende totale SR Ca2 + release, vooraf wij een automatische perfusie schakelaar programma interlinking het stimulatie en de perfusie-systeem. De mono-exponentiële curve-fitting werd vervolgens gebruikt voor het analyseren van verval tijd constanten van calcium Transiënten- en cafeïne-geïnduceerde calcium peulvruchten. Dienovereenkomstig, de bijdrage van de SR Ca2 +-ATPase (SERCA) en Na+-Ca2 + exchanger (NCX) te verwijderen van de diastolische calcium werd geëvalueerd.

Hier, we illustreren streptozotocin (STZ) - geïnduceerde diabetesratten (DM) en leeftijd-matched Sprague - Dawley (SD) ratten bijvoorbeeld. 8-week-oude mannelijke SD ratten (200 ± 20 g) ontving een enkele intraperitoneale injectie van STZ (70 mg/kg, ip) voor de DM groep of citraat buffer voor de controlegroep. Een week na toediening van de STZ, ratten met bloedglucose &#62; 16.7 mmol/L diabetische werden beschouwd. Na 8 weken werden de LV myocytes enzymatisch geïsoleerd. Na de herintroduc...

Recycling van intracellulair calcium speelt een cruciale rol in de regulering van de systolische en diastolische functie in cardiomyocytes. Hier beschrijven we een protocol om te evalueren van sarcoplasmic reticulum Ca2 + reserve en diastolische calcium functie voor het verwijderen in cardiomyocytes door een calcium imaging systeem.

Beoordeling van Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve en intracellulaire diastolische Calcium verwijdering in geïsoleerde ventriculaire Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Het algemene doel van deze procedure is om de calciumreserve van het sarcoplasmatisch reticulum en de intracellulaire diastolische calciumverwijderingsfunctie in geïsoleerde cardiomyocyten te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over het intracellulaire calciumhandelingsmechanisme onder bepaalde pathofysiologische omstandigheden, zoals diabetes en hartfalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gemak en het feit dat deze minder beperkt wordt door techniek en apparatuur.Om deze procedure te starten, dient het Langendorff-perfusiesysteem te worden klaargemaakt. Vul het perfusiesysteem met NT-oplossing, stel de temperatuur in op 36,5 °C en verwijder alle luchtbellen uit de slang. Open vervolgens de buikholte onder het xiphoïdeusproces, til het xiphoïdeusproces op en open de borstkas met een schaar.Verwijder vervolgens het pericardium, til het hart voorzichtig op met gebogen pincetten, identificeer de aortaboog en snijd het hart los bij de wortel van de aorta. Breng het hart daarna over naar een schaal van 60 millimeter en was het met NT-oplossing. Houd de aorta vast met twee micro-dissectiepincetten en monteer deze op de Langendorff-perfusiecanule.Ligeer vervolgens de aorta stevig aan de canule met behulp van chirurgisch hechtmateriaal. Perfuseer daarna het hart met 30 milliliters NT-oplossing om de circulatie van de coronaire arteriën te herstellen. Schakel vervolgens het perfusaat over naar 30 milliliters calciumvrije Tyrode-oplossing om de hartslag te stoppen.Schakel daarna het perfusaat over naar collagenase A-isolatieoplossing voor enzymatische digestie. Na digestie gedurende 20 tot 25 minuten wordt de perfusie-oplossing snel vervangen door calciumvrije Tyrode-oplossing om verdere digestie te stoppen. Houd vervolgens het hart vast met een pincet, snijd het los van de canule en plaats het hart in een schaal van 35 millimeter met KB-oplossing.Bepaal vervolgens het gebied van de linkerkamer. Snijd het atrium, de rechterkamer en het gebied van de atrioventriculaire junctie weg. Draagt de linkerkamer daarna over naar een nieuwe schaal van 35 millimeter met KB-oplossing en snijd het weefsel in kleine stukjes.Pipetteer de stukjes voorzichtig met een gefilterde plastic druppelaar. Filter vervolgens de cellen met een roestvrijstalen filter met een opening van 150 micron en breng ze over naar een centrifugebuis van 15 milliliter. Centrifugeer daarna het monster op 150 ×g gedurende 30 seconden en verwijder het supernatant.Resuspendeer de myocyten in 10 milliliters KB-oplossing en laat ze zes minuten bezinken. Verwijder daarna het supernatant en resuspendeer het pellet in 10 milliliters KB-oplossing gedurende 20 minuten. Nadat ze 20 minuten in de KB-oplossing hebben bezonken, verwijdert u het supernatant en resuspendeert u de myocyten met calcium-reintroductie-oplossing A. Herhaal de bovenstaande procedure met calcium-introductie-oplossing B. Herhaal vervolgens de bovenstaande procedure met NT-oplossing om de beschikbare myocyten te zuiveren.Bewaar de geïsoleerde LV-myocyten in deze oplossing en bestudeer ze binnen vier tot zes uur. Voeg vervolgens NT-oplossing en een 10 millimol cafeïne-oplossing toe aan elke kolom van het potlood. Verwijder eventuele luchtbellen in de buisjes om luchtblokkades te voorkomen.Sluit nu de instroombuis aan op de NT-oplossing voor perfusie van de kamer. Voor naaldperfusie van de doelmyocyt verbindt u de multi-barrel manifold-tip met het klepgestuurde perfusiesysteem. Tel vervolgens gedurende 10 seconden het aantal druppels uit de micron-tip van het potlood en stel de stroomregelaar handmatig zo in dat de stroomsnelheid ongeveer drie druppels per 10 seconden bedraagt.Voeg bij deze procedure de fura-2-acetoxymethyl-stock toe aan één milliliter van de myocytenсусpensie om de uiteindelijke concentratie op 2 µM te brengen. Bewaar deze gedurende 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Verwijder daarna het supernatant en resuspendeer de cardiomyocyten twee keer met NT-oplossing.Schakel vervolgens het licht uit en houd de cellen in het donker. Plaats de myocyten gedurende 15 minuten in de perfusiekamer voordat ze worden geperfuseerd met NT-oplossing. Pace de myocyten gedurende vijf minuten met veldstimulatie van één hertz met behulp van een stimulator.Select nu een myocyten met een goede vorm en een stabiele gestimuleerde twitch onder de 10X microscoopobjectief. Klik op Bestand Nieuw Bestand om een nieuw opnamebestand aan te maken. Wijzig vervolgens de microscopische vergroting naar 40X en draai de CCD-camera om de myocyten in een horizontale positie te houden.Kader vervolgens de enkele myocyt in door de kaderadapter voor cellen aan te passen en zorg dat de achtergrond helder is. Stel de myocyten daarna bloot aan het licht van een xenonlamp met excitatiefilters van 340 of 380 nanometer golflengte en beeld de myocyten af via een 40X objectief. Detecteer het fluorescentiesignaal bij 510 nanometer.Klik op de Start-knop om fluorescentie en sarcomeerlengte synchroon vast te leggen met behulp van het dubbele excitatie fluorescentie-fotomultiplicatiesysteem. Let op de veranderingen in de sarcomeerlengte van de myocyten en neem deze gelijktijdig op met de soft edge-module. Verbind bij deze procedure de aux out-poort van de stimulator via een BNC-kabel met de analoge import op het klepcontrolesysteem.Stel vervolgens de parameters in de klepbesturingssoftware in, klik op de downloadknop om de in het programma geladen sequentie te downloaden en klik op de triggerknop om de triggerfunctie te activeren. Stel daarna de stimulator in op sequentiemodus en stel de parameters in. Stel vervolgens de stimulator in op de S1-stap om de LV-myocyten met een frequentie van 1 Hz te stimuleren.Start de naaldperfusie met NT-oplossing bij een snelheid van 1,5 milliliters per minuut. Selecteer een doelmyocyt onder lage microscopische vergroting en zorg ervoor dat deze bereikbaar is met de microtip van het potlood. Verander daarna de microscoopvergroting naar 400X.Draai de oriëntatie van de CCD-camera zodat de myocyt in horizontale positie blijft. Pas vervolgens de rechthoekige diafragma onder de cellframing-adapter aan naar een geschikt venster dat gevuld is met de myocardcellen. Pas daarna de positie van het potlood op de micromanipulator aan en plaats de microtip voorzichtig op een afstand van de straal van het gezichtsveld ten opzichte van de doelmyocyt.Stel vervolgens het bereik van de naaldstroom zo in dat het hoofdzakelijk de doelmyocyt beslaat en zorg ervoor dat de myocyt niet door de naaldstroom kan worden weggespoeld. Na 60 seconden basispacing wordt de cursor van de stimulator naar de D2-stap verplaatst. De rest van het protocol wordt automatisch uitgevoerd door de stimulator en de klepbesturing.Klik op de Pauze-knop om de bestandopname te pauzeren en verplaats het microscopische beeld naar een nabijgelegen leeg gebied. Klik vervolgens op de Opname-knop om de opname voor enkele seconden te hervatten en registreer de numerieke intensiteitswaarden bij 340 en 380 nanometer voor achtergrondcorrectie. Open daarna het dialoogvenster Operation Constant en vul de waarden in het achtergrondformulier in.De software kan fura-2 ratio-waarden corrigeren door de achtergrond af te trekken. Hier wordt een illustratie getoond van het protocol voor het automatisch schakelen van perfusiekleppen en het pacing-systeem. Deze figuur toont de statistische waarden van de calciumreserve in het sarcoplasmatisch reticulum en de fractionele calciumvrijgave voor twitches gestimuleerd met één hertz in de diabetische groep en de Sprague Dawley-groep.De diabetische groep vertoonde een significant lagere SR-calciumreserve en SR-fractionele calciumvrijgave dan de Sprague Dawley-groep. Hier toont het softwarepaneel een handmatige mono-exponentiële curve-fitting voor de tijdconstante van het verval van de cafeïne-geïnduceerde calciumpuls. Deze staafdiagrammen vergelijken de Tau-cafeïne en Tau-1Hz/Tau-cafeïne tussen de diabetische en Sprague Dawley-groepen.De diabetische groep vertoonde significant hogere waarden voor Tau-caffeïne en Tau-1Hz/Tau-caffeïne dan de Sprague Dawley-groep. Deze procedure biedt een haalbaar en handig instrument om het mechanisme van de intracellulaire calciumhuishouding bij hartdisfunctie te onderzoeken. Bij het uitvoeren van deze procedure zijn er enkele belangrijke punten waar op gelet moet worden, zoals de stabiele adhesie van myocyten aan de schaal, het afsluiten van de kanalschakelaar, het beheersen van de stroomsnelheid van de naaldperfusie en de juiste afstand tussen de naaldpunt en de doelmyocyt.

assessment-sarcoplasmic-reticulum-calcium-reserve-intracellular

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Individuele cardiomyocyten van wilde type en mutante muizen kunnen uit het hart worden geïsoleerd om hun contractiliteit en calciumtransienten te bestuderen. Dit maakt het mogelijk om de bijdrage van cellulaire disfunctie aan hartdisfunctie, van welke oorzaak dan ook, te karakteriseren.

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Dit artikel beschrijft de gedetailleerde protocol en de apparatuur die nodig is voor dual optische kaart brengen van transmembraan potentiaal (V m) en gratis intra-sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca 2+ in de Langendorff-doorbloed konijn hart. Deze methode maakt directe observatie en kwantificering van Vm en SR Ca 2+ dynamiek in het intacte hart.

Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Momenteel worden de meeste beschikbare calciumindicatoren gebruikt om cytoplasmatische calciumtransienten te kwantificeren als indirecte maatstaven voor calcium dat vrijkomt uit het sarcoplasmatisch reticulum in gekweekte gladde spiercellen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een specifieke FRET-gebaseerde indicator die directe meting van calciumsignalen binnen het sarcoplasmatisch reticulum lumen mogelijk maakt.

Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

Dit document beschrijft een protocol dat de veranderingen in de myofilament Ca2+ gevoeligheid tijdens contractie in geïsoleerde hartspiercellen van rattenhart beoordeelt. Samen met cardiale elektrofysiologie, systolische/diastolische cytosol Ca2+ niveaus en contractie/relaxatie, is deze meting onmisbaar voor het onderbouwen van de mechanismen die de excitatie-contractiekoppeling in gezonde en zieke harten mediëren.

Beoordeling van Myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Gevoeligheid Onderliggende Cardiac excitatie-contractie Coupling

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, Langendorff gebaseerde procedure voor de isolatie van eencellige atriale cardiomyocytes van een rat model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie. Een handmatige regulering van de intraluminale druk van cardiale Holten is geïmplementeerd om de opbrengst van functioneel intact myocytes geschikt voor excitatie-contractie-koppeling studies.

Isolatie van atriale Cardiomyocytes van een Rat Model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie

We presenteren de methodologie voor het isoleren van Murine myocyten en het verkrijgen van spannings-of calcium sporen tegelijk met sarcomere inkorten van sporen met fluorescentie fotometrie met gelijktijdige metingen van digitale cellen geometrie.

Optische beeldvorming van geïsoleerde Murine ventriculaire Myocyten

Dit protocol is bedoeld om stapsgewijze de techniek van extractie en beoordeling van de hartfunctie te beschrijven met behulp van gevilde cardiomyocyten. Deze methode maakt het mogelijk om de myofilamentfunctie te meten en te acuut temodificeren met kleine bevroren biopsieën die kunnen worden verzameld vanaf verschillende hartlocaties, van muizen tot mannen.

In Vitro Beoordeling van cardiale functie met behulp van gevilde cardiomyocyten

Gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van menselijke en dierlijke ventriculaire cardiomyocyten van vibratome-cut myocardische plakjes. Hoge opbrengsten van calciumtolerante cellen (tot 200 cellen/mg) kunnen worden verkregen uit kleine hoeveelheden weefsel (&lt;50 mg). Het protocol is van toepassing op myocardium dat tot 36 uur aan koude ischemie wordt blootgesteld.

Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

Muismodellen maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen. Voor dit doel zijn cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patchklemmetingen uit te voeren. Hier wordt een methode beschreven om murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom mogelijk maakt.

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom

Er wordt een reeks protocollen gepresenteerd die de meting van de contractiele functie beschrijven via sarcomeerlengtedetectie samen met calcium (Ca2+) voorbijgaande meting in geïsoleerde rattenmyocyten. De toepassing van deze aanpak voor studies in diermodellen van hartfalen is ook inbegrepen.

Analyse van cardiale contractiele disfunctie en Ca2+ transiënten in knaagdiermyocyten

Dit protocol beschrijft een methode om tegelijkertijd cytosolisch, vrij calcium [Ca2+]i en vaatdiameter in samentrekkende lymfevaten in realtime te meten en vervolgens absolute Ca2+- concentraties te berekenen, evenals contractiliteits-/ritmiekparameters. Dit protocol kan worden gebruikt om Ca2+ en contractiele dynamiek te bestuderen in verschillende experimentele omstandigheden.

Real-time evaluatie van absolute, cytosolische, vrije Ca2+ en overeenkomstige contractiliteit in geïsoleerde, onder druk staande lymfevaten

Leer de evaluatie van sarcoplasmatisch reticulum calciumreserve en diastolische calciumverwijdering in geïsoleerde ventriculaire cardiomyocyten. Deze methode onderzoekt calciumafhandeling bij diabetes en hartfalen.

Beoordeling van Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve en intracellulaire diastolische Calcium verwijdering in geïsoleerde ventriculaire Cardiomyocytes (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve en intracellulaire diastolische Calcium verwijdering in geïsoleerde ventriculaire Cardiomyocytes

Meer video's verkennen