Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's
September 28th, 2017
We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteïnen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.
Het algemene doel van deze procedure is om RNA-bindende eiwitten in levende cellen te identificeren en hun RNA-bindende gebieden in kaart te brengen met behulp van UV-gemedieerde foto-crosslinking gevolgd door massaspectrometrie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van epigenetica te beantwoorden, zoals welke epigenetische regulatoren aan RNA zijn gebonden en welke eiwitgebieden vereist zijn voor de interacties. Het grote voordeel van deze techniek is dat het geen zuivering van de eiwit-RNA-complexen vereist en daarom weinig materiaal nodig heeft en eiwitten identificeert die aan elk type RNA zijn gebonden.
Zoals gepresenteerd, richt deze methode zich op nucleaire eiwitten omdat dat ons wetenschappelijke interesse is, maar met kleine aanpassingen in de fractioneringsstappen, zou het kunnen worden gebruikt om RNA en bindende eiwitten in andere stu-nu-laire compartimenten te bestuderen. Na het kweken en uitbreiden van muis ESC's volgens het tekstprotocol, breid de cellen uit tot het vereiste aantal platen van 10 centimeter. Voeg vóór het bereiken van confluency vier SU direct toe aan het medium tot een uiteindelijke concentratie van 500 micromolair.
Laat 4sU controle schotels onbehandeld. Schud de platen voorzichtig om de 4sU homogeen door het medium te verdelen en plaats de platen vervolgens gedurende twee uur terug in dezelfde weefselkweekincubator. De efficiëntie van 4sU-incorporatie varieert tussen celtypen en daarom kan het nodig zijn om de concentratie en incubatietijd te optimaliseren om een efficiënte crosslinking te garanderen en toxiciteit te minimaliseren.
Breng vervolgens de platen over naar een emmer met ijs en gooi het medium weg. Gebruik vervolgens 5 milliliter ijskoud PBS om de platen voorzichtig te spoelen. Voeg 2 milliliter ijskoud PBS toe en plaats de platen zonder deksels in een crosslinker uitgerust met UV-B-stralende lampen.
Besproei de platen bij een energie-instelling van 1 Joule per vierkante centimeter. Efficiënte UV-crosslinking is cruciaal. We raden aan UV-B-licht te gebruiken, maar UV-A kan ook worden gebruikt.
In ieder geval moet de hoeveelheid UV-energie die wordt gebruikt, worden geoptimaliseerd en kan worden gecontroleerd door PAR-CLIP of ChIRP. Gebruik cellifters om de cellen te verzamelen en over te brengen naar ijskoud PBS in conische buisjes. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 2000 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.
Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in vijf milliliter ijskoud PBS met 2 millimolair EDTA en 0,2 millimolair PMSF. Tel de cellen met een hemocytometer. Verwacht vijf tot tien en tien tot twintig miljoen cellen van respectievelijk 10 centimeter en 15 centimeter platen.
Centrifugeer vervolgens de cellen bij 2000 keer g en 4 graden Celsius gedurende vijf minuten. Om kernen uit de cellen te isoleren, bereid ijskoud buffer A voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg voor gebruik 0,5 millimolair DTT en 0,2 millimolair PMSF toe aan de gewenste hoeveelheid buffer A. Voeg 2 milliliter van de koude buffer toe aan de cellen om ze te wassen, draai vervolgens de cellen bij 2500 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.
Gooi het supernatant weg en voeg buffer A aanvulling met 0,2 procent van een niet-ionisch, niet-denaturerend detergent toe, draai het monster vervolgens bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Na het draaien van de cellen bij 2500 keer g gedurende vijf minuten, verwijder het supernatant. De pellet bestaat uit intacte kernen zonder cytoplasma.
Om de kernen te lyseren, voeg 200 microliter lysebuffer toe aan de buis. Gebruik een 1/8-duim sonde om het monster te soniceren om de chromatine bij een amplitude-instelling van 50 procent gedurende vijf tot tien seconden te scheuren. Draai het monster bij 12000 keer g gedurende vijf minuten en verzamel alleen 175 microliter supernatant om de pellet te vermijden.
Meet vervolgens de eiwitconcentratie via de Bradford-assay of een vergelijkbare techniek. Gebruik vervolgens lysebuffer om het eiwit in de verschillende monsters te verdunnen tot 1 milligram per milliliter of de laagste monstersconcentratie. Voeg 5 millimolair DTT-oplossing toe aan het nucleaire lysate en incubeer het monster bij kamertemperatuur gedurende een uur.
Voeg vervolgens 14 millimolair iodoaceetamide uit verse voorraad toe en incubeer het lysate bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten. Verdun het lysate met vijf keer het volume van 50 millimolair ammoniumbicarbonaat en voeg trypsine toe. Incubeer het monster bij 37 graden Celsius gedurende de nacht.
Om één op maat gemaakte stage tip per monster voor te bereiden, plaats een schijf van solid phase extraction C18 materiaal in de bodem van een 200 microliter pipette tip. Voeg 50 microliter oligo R3 reverse-phased resin toe bovenop de C18 schijf, plaats vervolgens de stage tip in een centrifugatieadapter en plaats de adapter in een 1,5 milliliter microfugebuis. Voeg 100 microliter van 100 procent acetonitril toe aan de tips om ze te wassen.
Centrifugeer vervolgens de tips bij 1000 keer g gedurende één minuut om het oplosmiddel te verwijderen. Equilibreer de tips met 50 microliter van 0,1 procent trifluorazijnzuur of TFA. Draai ze vervolgens weer.
Voeg 100 procent formijnzuur toe aan het gedigesteerde eiwitmonster om de PH te verlagen naar 2 tot 3. Laad vervolgens het monster op een op maat gemaakte stage tip en centrifugeer het monster bij 1000 keer g gedurende één minuut totdat al het monster door de tip gaat. Was de gebonden peptiden met 50 microliter van 0,1 procent TFA.
Vervolgens, na het draaien van het monster bij 1000 keer g gedurende één minuut, elueer de peptiden door 50 microliter elutiebuffer toe te voegen aan de stage tip en centrifugeer bij 1000 keer g gedurende één minuut om de elutiebuffer uit de tip te verwijderen. Gebruik een vacuümcentrifuge ingesteld op 150 keer g en 1 tot 3 kilopascal gedurende één uur om het monster te drogen. Om cross-linked RNA uit het
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om RNA-bindende eiwitten te identificeren en hun RNA-bindende gebieden in levende cellen te kaarten met behulp van UV-gemedieerde fotocrosslinking en massaspectrometrie. Het biedt inzichten in de interacties tussen eiwitten en RNA, met name in de context van epigenetica.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Epigenetica
Achtergrond
- Het begrijpen van RNA-eiwitinteracties is cruciaal voor het ophelderen van genregulatie.
- Deze methode maakt het mogelijk om RNA-bindende eiwitten te bestuderen zonder de noodzaak van zuivering.
- Het richt zich op nucleaire eiwitten, maar kan worden aangepast voor andere cellulaire compartimenten.
- Massaspectrometrie wordt gebruikt om eiwitten die aan RNA zijn gebonden, te identificeren.
Doel van de studie
- Om RNA-bindende eiwitten in levende cellen te identificeren.
- Om de specifieke RNA-bindende gebieden van deze eiwitten in kaart te brengen.
- Om de rol van epigenetische regulatoren in RNA-interacties te verkennen.
Gebruikte methoden
- UV-gemedieerde fotocrosslinking om RNA-eiwitinteracties vast te leggen.
- Massaspectrometrie voor de identificatie van RNA-bindende eiwitten.
- Celcultuur van muis embryonale stamcellen (ESC's).
- Aanpassing van fractieringsstappen voor het bestuderen van verschillende cellulaire compartimenten.
Belangrijkste resultaten
- RNA-bindende eiwitten in levende cellen succesvol geïdentificeerd.
- RNA-bindende gebieden van deze eiwitten in kaart gebracht.
- De toepasbaarheid van de methode op verschillende RNA-typen aangetoond.
- Inzichten geboden in de rol van epigenetische regulatoren in RNA-interacties.
Conclusies
- Dit protocol is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van RNA-eiwitinteracties.
- Het stelt onderzoekers in staat om de dynamica van RNA-bindende eiwitten in levende cellen te onderzoeken.
- De flexibiliteit van de methode maakt aanpassing mogelijk voor verschillende experimentele behoeften.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables unbiased, proteome-wide identification of RNA-binding proteins and their interaction domains in live cells, supporting target validation in epigenetics and RNA-mediated disease mechanisms. By eliminating the need for complex purification, it reduces sample requirements and increases throughput for early discovery workflows. The approach provides mechanistic de-risking by mapping functional RNA-binding regions, informing lead identification and preclinical target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying which epigenetic regulators bind RNA in live cells.
- Operational Value: Maps RNA-binding regions without protein complex purification, reducing material needs and workflow complexity.
- Predictive Value: Identifies functional domains required for RNA interaction, supporting target de-risking and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative RNA-binding region (RBR) id scores that enable comparison of binding likelihood across protein domains.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible peptide-level outputs compatible with mass spectrometry-based screening platforms.
- Scalability: Adaptable to various cultured cell types, supporting assay reuse across target classes and disease models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase RNA-binding maps to preclinical validation via orthogonal methods like PAR-CLIP.
- Mechanistic De-risking: Confirms novel RNA-binding proteins (e.g., TET2) and their domains, reducing ambiguity in target mechanism.
- Biomarker Alignment: Supports identification of RNA-binding epigenetic regulators with potential as translational biomarkers in disease contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing RNA-binding data that informs mechanistic understanding before assay development and screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on RNA-protein interactions in nuclear processes like chromatin regulation and DNA repair.
- Screening: Delivers quantitative, mass spectrometry-ready peptide data enabling comparison of binding conditions and mutant variants.
- Analytics: Generates RBR id scores and spatial maps (e.g., on U1-70k) that quantify RNA-binding likelihood and validate structural models.
- Translational Research: Enables follow-up validation using PAR-CLIP to confirm domain-specific RNA binding in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Adaptable fractionation and crosslinking steps allow application across cell types, RNA types, and subcellular compartments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target mechanism by defining RNA-binding regions at peptide resolution.
- Operational Value: Eliminates purification steps, reduces hands-on time, and enables processing of limited cell inputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by de-risking targets with unclear RNA-mediated mechanisms.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of epigenetic targets based on validated RNA interaction domains.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, UV crosslinking, and mass spectrometry sample preparation.
- Depends on access to UV-B crosslinking equipment and nuclease digestion tools for RNA removal.
- Needs standardization of 4sU incorporation and UV energy dosing across cell types to balance efficiency and toxicity.
- Requires adaptation of nuclear/cytoplasmic fractionation steps when studying non-nuclear compartments.
- Limited by the efficiency of photoreactive uridine analog incorporation, which may require optimization per cell line.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:04
Crosslink of Protein-RNA Interactions in Live Cells
3:26
Isolation of Nuclei
4:27
Lysis of Nuclei and Trypsin Digestion
5:51
Desalting of Peptides
7:39
Removal of Crosslinked RNA
8:44
Results: RNA-binding Protein and RNA-binding Region Identification
10:04
Conclusion
