Name: Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio s (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Leer RNA-bindende eiwitten identificeren in levende cellen met UV-fotokoppeling en massaspectrometrie. Deze methode brengt eiwit-RNA-interacties in kaart zonder zuivering, wat waardevol is voor epigenetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.B. werd ondersteund door het programma van de geleerden Searle, de W.W. Smith Foundation (C1404) en de March of Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G erkent ondersteuning van NIH grants R01GM110174 en NIH R01AI118891, en DOD verlenen BC123187P1. R.W.-T. werd gesteund door de NIH opleiding grant T32GM008216.

1. cultuur en uitbreiding van mESCs Opmerking: muis embryonale stamcellen zijn eenvoudig te cultuur en kan snel worden uitgebreid tot de grote aantallen voorgeschreven biochemische experimenten dankzij hun snelle fietsen tijd. Gezonde mESCs verdubbelen elk 12 h.
<ol><li>Uitvouwen mESCs naar het gewenste nummer op gelatinized platen in mESC medium (zie hieronder) in een incubator weefselkweek bewaard bij 37 ° C, 5% CO 2, en &#62; 95% vochtigheid. 
	Opmerking: Genoeg platen moeten worden voorbereid voor de biologische replicatieonderzoeken 3-5 voor de + 4SU monster en de controle van de - 4SU. Een 10-cm plaat (dat wil zeggen 5-10 miljoen cellen) is meer dan voldoende voor elke biologische repliceren.</li>
	<li>Het medium voor het mESCs is samengesteld uit Dulbecco &#39; s bewerkt Eagle &#39; s medium (DMEM), aangevuld met 15% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 0,5 x penicilline/streptomycine, 1 x niet-essentiële aminozuren, 100 µM bèta-mercaptoethanol, 1.000 U /mL leukemie remmende factor (LIF), 3 µM CHIR99021, 1 µM PD0325901.</li>
	<li>Voordat hij passaging mESCs, stelt het gewenste aantal platen van 10 cm.
	<ol><li>Voeg 4 mL 0,1% gelatine in water om ervoor te zorgen dat het gehele oppervlak van de plaat is gedekt; Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT); verwijderen van gelatine oplossing.</li>
	</ol></li> <li>Passage van cellen wanneer ze bereiken ~ 10 miljoen cellen per plaat, meestal ~ 48 h na inoculatie. 
	Opmerking: Aangezien mESCs in dichte kolonies groeien, platen nooit worden toegestaan tot 100% confluentie zoals waargenomen voor cellijnen die in monolayers (bijvoorbeeld HEK293 of 3T3 cellen groeien). Een mESC plaat moet worden gepasseerd wanneer de kleur omslaat naar geel ~ 50% confluente en zeker vóór het medium.
	<ol><li>Loskoppelen van cellen, spoel de platen met dichte mESC culturen eens in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), aangevuld met 2 mM EDTA, dan toevoegen van 0,05% trypsine opgelost in DMEM en terug te keren plaat incubator voor 5 min (37 ° C, 5% CO 2, en &#62; 95% vochtigheid).</li>
		<li>Plaat verwijderen incubator en resuspendeer de cellen met gelijk volume DMEM door op en neer herhaaldelijk krachtig pipetteren.</li>
		<li>Telling van cellen met behulp van hemocytometer en ervoor te zorgen dat cellen een eencellige schorsing vormen (d.w.z. geen clusters), vervolgens Centrifugeer cel mengsel 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet cel in 1-2 mL DMEM.</li>
		<li>Enten cellen bij een dichtheid van 10.000 cellen/cm 2 in mESC medium (d.w.z. ~ 800.000 cellen per 10-cm plaat) met behulp van de gelatine beklede platen bereid in stap 1.3.1.</li>
	</ol></li></ol> 2. Dwarslijn van eiwit &#8211; RNA interacties in levende cellen Opmerking: RNA-eiwit crosslinking wordt gemedieerd door de foto-gevechts ribonucleoside analoge 4-thiouridine (4SU). 4SU heeft een langere absorptie maximaal dan endogene nucleotiden en kan alleen worden opgenomen in RNA; intermediair-golflengte UVB kan daarom worden gebruikt om selectief dwarslijn RNA naar eiwitten 25 , 26. UVB behandeling van 4SU-behandelde cellen leidt tot covalente crosslinks tussen 4SU-bevattende RNA en aminozuren, met een gerapporteerde voorkeur voor Tyr, Trp, BMO en Lys Cys 27.
<ol><li>Uitvouwen mESCs om het vereiste aantal 10-cm platen als beschreven in stap 1. 
	Opmerking: Genoeg platen moeten worden voorbereid voor de biologische replicatieonderzoeken 3-5 voor de + 4SU monster en de controle van de - 4SU. Een 10-cm plaat (dat wil zeggen 5-10 miljoen cellen) is voldoende voor elke biologische repliceren.</li>
	<li>Voordat de platen confluentie bereiken, 4SU direct tot medium aan toevoegen een eindconcentratie van 500 µM. laat - 4SU control gerechten onbehandeld.</li>
	<li>Shake platen zachtjes te verspreiden de 4SU homogeen gedurende het medium. Terugsturen naar de dezelfde weefselkweek incubator voor 2 h (37 ° C, 5% CO 2, en &#62; 95% vochtigheid).</li>
	<li>Platen overbrengen in een ijsemmer en negeren middellange.</li>
	<li>Spoel de plaat zachtjes met ijskoude PBS 5 mL. 
	Opmerking: Spoel zachtjes of cellen kunnen loskoppelen.</li>
	<li>Voeg toe 2 mL ijskoud PBS en plaats platen zonder deksels in een crosslinker uitgerust met UVB-emitting bollen (312 nm). Bestralen platen bij de instelling van een energie van 1 J/cm 2. 
	Opmerking: Het is cruciaal dat plastic deksels zijn verwijderd of ze misschien beschermen de cellen van UV-licht en voorkomen van crosslinking.</li>
	<li>Cellen met behulp van cell lifters verzamelen en overbrengen van ijskoude PBS in conische buisjes. Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 5 min, 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 5 mL ijskoud PBS met 2 mM EDTA en 0,2 mM phenylmethylsulfonyl-fluoride (PMSF).</li>
	<li>Cellen tellen met behulp van een hemocytometer. 5-10 en 10-20 miljoen cellen uit 10-cm en 15 cm platen respectievelijk verwachten.</li>
	<li>Centrifuge op 2.000 x g gedurende 5 minuten, 4 ° C. 
	Opmerking: Ingehuld cellen direct inzetbaar voor stap 3 of ze kunnen worden flash-bevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij-80 ° C voor onbepaalde tijd. Dit is een potentieel stopplaats.</li>
</ol> 3. Isolatie van kernen Opmerking: kernen zijn geïsoleerde verwijderen cytoplasmatische eiwitten en het vergroten van de dekking van nucleaire eiwitten. Deze stap kan worden vervangen door andere vormen van cellulaire fractionering te bestuderen van de RBPs in andere cellulaire compartimenten.
<ol><li>Voorbereiden ijskoud Buffer een (10 mM Tris-HCl pH 7,9, 4 ° C, 1.5 mM MgCl 2, 10 mM KCl). Gebruik van ten minste 2,5 mL per 10 miljoen cellen (zoals geteld in stap 2.9) voor extractie. 
	Opmerking: Voorraden Buffer A (bijvoorbeeld een 500 mL fles) kunnen worden voorbereid en opgeslagen bij 4 ° C voor 6 maanden.
	<ol><li>Voorafgaand aan het gebruik, het toevoegen van 0.5 mM dithiothreitol (DTT) en 0.2 mM PMSF tot het gewenste bedrag (2,5 mL per 10 miljoen cellen) van de ijskoude buffer A.</li>
	</ol></li> <li>Wassen van cellen met behulp van 2 mL Buffer A per 10 miljoen cellen. Spin bij 2.500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Discard supernatant, Buffer A aangevuld met 0,2% van een nonionic, niet-denaturering wasmiddel, zoals octyl-fenoxy-polyethoxy-ethanol toevoegen (Zie de Tabel van materialen), 500 µL per 10 miljoen cellen. Roteren voor 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugeer bij 2.500 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant; de pellet omvat intact kernen verstoken cytoplasma. 
	Opmerking: Kernen kunnen worden onmiddellijk gebruikt voor stap 4 of flash-bevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij-80 ° C voor onbepaalde tijd. Dit is een potentieel stopplaats.</li>
</ol> 4. Lysis van de kernen Opmerking: kruisverwijzende kernen in een massa spectrometrie-compatibele buffer om release eiwitten en eiwit-RNA complexen zijn lysed.
<ol><li>Toevoegen lysis-buffermengsel (9 M ureum, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 24 ° C), 200 µL per 10 miljoen cellen. Bewerk ultrasone trillingen ten als u wilt schuintrekken chromatine met behulp van een 1/8 &#34; sonde bij 50% amplitude instelling voor 5-10 s.</li>
	<li>Spin op 12.000 x g gedurende 5 minuten en verzamelen 175 µL van supernatans dat om te voorkomen dat de pellet. 
	Opmerking: 100 µL zal worden gebruikt voor de volgende stappen van de RBR-ID en de resterende 75 µL van lysate kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor later gebruik en/of westelijke vlekkenanalyse.</li>
	<li>Maatregel eiwitconcentratie via analyse van Bradford of soortgelijke techniek 28. Verdun eiwitconcentratie in de verschillende monsters tot 1 mg/mL of de laagste monster met behulp van de juiste hoeveelheid lysis-buffermengsel. 
	Opmerking: Van de kernen van 10 miljoen mESCs verwachten 100-200 µg eiwit.</li>
</ol> 5. Spijsvertering van de trypsine Opmerking: eiwitten zijn verteerd voor het genereren van peptiden suitable onderop massaspectrometrie (MS) p.a..
<ol><li>Oplossing van de DTT toevoegen aan nucleaire lysate (5 mM definitieve); Incubeer gedurende 1 h op RT.</li>
	<li>Iodoacetamide uit verse voorraad (14 mM definitieve) toevoegen; Incubeer gedurende 30 min op RT in het donker.</li>
	<li>Dilute lysate met 5 keer volume van 50 mM NH 4 HCO 3</li>
	<li>Toevoegen van trypsine (µg eiwit: µg trypsine = 200:1); Incubeer bij 37 ° C's nachts.</li>
</ol> 6. Ontzouten van peptiden <ol><li>een op maat gemaakte fase tip per monster bereiden.
	<ol><li>6.1.1. plaats een schijf van vaste fase extractie C18 materiaal in de bodem van een tip van 200 µL Pipetteer.</li>
		<li>Toevoegen 50 µL van oligo R3 omgekeerd fase hars op de top van de C18-schijf. Plaats fase tip binnen centrifugeren adapter en de plaats tip met adapter in een 1,5 mL microfuge buis.</li>
		<li>Voeg 100 µL 100% acetonitril tips om te wassen. Centrifugeer bij 1000 x g gedurende 1 minuut te verwijderen van het oplosmiddel.</li>
		<li>Uitgebalanceerd met 50 µL 0,1% trifluorazijnzuur (TFA). Centrifugeer bij 1000 x g gedurende 1 min.</li>
	</ol></li> <li>100% mierenzuur toevoegen aan verteerd eiwitSteekproef te verlagen de pH ten slotte op 2-3. 
	Opmerking: Dit mocht ~ 5 µL per 1 mL verdunde peptide monster, maar pH moet worden gemeten en meer mierenzuur zuur toegevoegd zonodig.</li>
	<li>Load monster naar op maat gemaakte fase tip, centrifuge op 1000 x g voor 1 min totdat alle monster doorloopt het puntje.</li>
	<li>Wassen gebonden peptiden met 50 µL 0,1% TFA. Centrifugeer bij 1000 x g gedurende 1 min.</li>
	<li>Elueer peptiden door toevoeging van 50 µL elutie buffer (75% acetonitril, 0,025% TFA) fase tip en centrifuge bij 1000 x g gedurende 1 minuut te dwingen de elutie buffer uit het topje.</li>
	<li>Droog het monster met behulp van een vacuüm centrifuge ingesteld bij 150 x g en 1-3 kPa voor 1 h. 
	Opmerking: Gedroogde peptiden kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor onbepaalde tijd. Dit is een potentieel stopplaats.</li>
</ol> 7. Verwijdering van kruisverwijzende RNA Opmerking: behandelen van peptiden met nuclease verwijderen kruisverwijzende RNA.
<ol><li>Resuspendeer de pellet in 50 µL 2 x nuclease buffer (100 mM NH 4 HCO 3, 4 mM MgCl 2).</li>
	<li>Maatregel peptide concentratie met behulp van extinctie op 280 nm uitgaande van peptiden voor een A-280 1 1 mg/mL. 
	Opmerking: De verwachte concentratie is 1 mg/mL.</li>
	<li>Passen alle monsters tot 1 mg/mL of bij de laagste concentratie met 2 x nuclease buffer.</li>
	<li>Voorbereiding van een master mix van 50 µL H 2 O + 1 µL hoge zuiverheid nuclease (&#8805; 250 U) (Zie de Tabel van materialen) per monster.</li>
	<li>Neem 50 µL van peptide monster en voeg 50 µL van H 2 O + nuclease meester mix.</li>
	<li>Incubate bij 37 ° C gedurende 1 h. treed toe tot het uitvoeren van massaspectrometrie. 
	Opmerking: De peptiden zijn nu klaar voor massaspectrometrie. Zij kunnen worden geanalyseerd onmiddellijk of opgeslagen bij-80 ° C voor onbepaalde tijd. Dit is een potentieel stopplaats.</li>
</ol> 8. Nano Liquid Chromatography, Spectrometrie van de massa en verwerking van Raw Data Opmerking: omdat 4SU-crosslinking de massa van de peptide verandert, hun ionen tellen niet mee naar de intensiteit van de niet-kruisverwijzende peptide tijdens LC-MS/MS, dat lijkt dus te worden verlaagd door het crosslinking. De mate en de consistentie van deze daling weerspiegelt de mate van eiwit-RNA crosslinking voor elke peptide 24.
<ol><li>Bereiden HPLC buffers als volgt: 0,1% mierenzuur in HPLC-grade water (buffer A), 0,1% mierenzuur in HPLC-grade acetonitril (Buffer B).</li>
	<li>Als een nano-HPLC beschikbaar is, sluit een nano-kolom met de volgende specificaties: inwendige diameter 75 µm; boordevol C18-AQ deeltjes; lengte 20-25 cm. 
	Opmerking: Als de HPLC beschikbaar prestatiestatus hoger debiet gebruiken een juiste kolom formaat voor het aangegeven debiet. Hogere stroom chromatografie vermindert gevoeligheid.</li>
	<li>Program de HPLC-methode als volgt: stroom tarief 250-300 nL/min; gradiënt van 2 naar 28% buffer B in 120 min, vanaf 28 tot 80% B voor de volgende 5 min en isocratic 80% B voor 10 min. 
	Opmerking: Als de HPLC niet over een geautomatiseerde kolom evenwichtsinstelling voorafgaande monster laden beschikt, start het programma met 10 min op 0% B vóór het laden van het monster.</li>
	<li>Program de MS overname methode uit te voeren gegevens-afhankelijke acquisition (DDA) als standaard geweer proteomics experimenten. De taakcyclus instrument moet volledige MS scans met tandem MS scans (of MS/MS) van de meest intense signalen worden afgewisseld. De optimale instellingen gebruiken voor proteomics MS loopt. 
	Opmerking: Voor de resultaten van het vertrouwen, gebruik van instrumenten die op zijn minst de volledige MS uitvoeren kunnen scannen in hoge resolutiemodus (bijvoorbeeld orbitrap, time-of-flight). Voor nauwkeurige kwantificering, zorg ervoor dat de intervallen tussen volledige MS scans niet langer zijn dan 3 s. langere cycli van de plicht ertoe leiden dat nauwkeurige definitie van uitgepakte ion chromatogrammen.</li>
	<li>Laden van 1-2 µg van monster op de HPLC-kolom en de HPLC-MS/MS methode run zoals geprogrammeerd. Voor elke biologische repliceren uitvoeren van ten minste twee onafhankelijke runs en behandel ze als technische replicatieonderzoeken.</li>
	<li>Na MS, de raw-bestanden importeren in een softwarepakket van proteomics voor MS/MS spectra identificatie en kwantificering van de peptide via uitgepakte ion-chromatography. Raadzaam softwarepakketten die chromatografische uitlijning van meerdere uitvoeren kunnen MS loopt (Zie de Tabel van materialen) 29 , 30.</li>
	<li>Als de optie beschikbaar in de softwaresuite is, inschakelen &#34; Match tussen Runs &#34; vóór het opstarten van gegevensverwerking.</li>
	<li>Zodra de analyse is voltooid, de peptide lijst samen met de kwantificering waarden exporteren.</li>
</ol>

<ol><li>Bonasio, R., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transcription+by+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of transcription by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).</li>
<li>Bonasio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+topics+in+epigenetics%3A+ants%2C+brains%2C+and+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs.</a> Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).</li>
<li>Rinn, J. L., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+regulation+by+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genome regulation by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).</li>
<li>Goff, L. A., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+RNA+biology+to+lncRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Linking RNA biology to lncRNAs.</a> Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).</li>
<li>Holoch, D., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+epigenetic+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression.</a> Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
<li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li>
<li>Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins%3A+modular+design+for+efficient+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins: modular design for efficient function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).</li>
<li>Cabili, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+reveals+global+properties+and+specific+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses.</a> Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nat Commun. 6, 10127(2015).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nat Commun. 7, 11212(2016).</li>
<li>Wilusz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+triple+helix+stabilizes+the+3%27+ends+of+long+noncoding+RNAs+that+lack+poly%28A%29+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails.</a> Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).</li>
<li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162 (5), 948-959 (2015).</li>
<li>Brannan, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SONAR+Discovers+RNA-Binding+Proteins+from+Analysis+of+Large-Scale+Protein-Protein+Interactomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes.</a> Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).</li>
<li>Bonasio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+with+RNA+direct+the+Polycomb+group+protein+SCML2+to+chromatin+where+it+represses+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes.</a> Elife. 3, e02637(2014).</li>
<li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+JARID2+and+noncoding+RNAs+regulate+PRC2+recruitment+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin.</a> Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).</li>
<li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+the+PRC2+component+Ezh2+is+cell+cycle-regulated+and+up-regulates+its+binding+to+ncRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA.</a> Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).</li>
<li>Saldana-Meyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+regulates+the+human+p53+gene+through+direct+interaction+with+its+natural+antisense+transcript%2C+Wrap53%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53.</a> Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Identification+of+RNA-Binding+Domains+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells.</a> Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li>
<li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Mapping+of+RNA-Binding+Regions+in+the+Nuclear+Proteome+of+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).</li>
<li>Favre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Thiouridine+photosensitized+RNA-protein+crosslinking+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thionucleobases+as+intrinsic+photoaffinity+probes+of+nucleic+acid+structure+and+nucleic+acid-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Photochem+Photobiol+B%22%5BJournal%5D)">Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions.</a> J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+U1+snRNP%2C+a+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle%2C+reveals+the+mechanism+of+5%27+splice+site+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We beschrijven een gedetailleerde experimenteel protocol standaardinteracties RBR-ID in mESCs en met adequate wijzigingen, in een willekeurige cel die 4SU in RNA kunt opnemen. Andere celtypes voorschrijven optimalisatie van de aanpak om ervoor te zorgen een voldoende signaal / ruisverhouding. Bovendien, terwijl het protocol hierin richt zich op de behandeling van nucleaire RBPs beschreven, moet de technologie van de RBR-ID worden gemakkelijk aangepast aan verschillende cellulaire compartimenten, zoals het cytosol of spec...

Het doel van de methode van de RBR-ID is het identificeren van de roman RNA-bindende proteÃ¯nen (RBPs) en hun RNA-bindende regio's (RBRs) kaart met peptide tabelniveau resolutie ter vergemakkelijking van het ontwerp van RNA-bindende mutanten en het onderzoek van de biologische en biochemische functies van eiwitten-RNA interacties.
RNA is uniek onder biomoleculen zoals het kan fungeren als een boodschapper uitvoering van genetische informatie én ook in complexe driedimensionale structuren met biochemische functies meer verwant aan die van eiwitten1,2 vouwen. Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat noncoding RNAs (ncRNAs) spelen een belangrijke rol in verschillende gene regelgevings- en epigenetische trajecten3,4,5 , en meestal deze regelgevende taken zijn gemedieerde in concert met eiwitten die ermee specifiek een bepaalde RNA. Van bijzonder belang zijn, werd een aantal interacterende eiwitten onlangs geïdentificeerd voor de intens bestudeerde lange ncRNA (lncRNA) Xist, waardevolle inzicht bijbrengen in hoe deze lncRNA x-chromosoom inactivatie in vrouwelijke cellen6,7 bemiddelt ,8. Met name verscheidene van deze Xist-interactie proteïnen bevatten geen canonieke RNA-bindende domeinen9, en daarom hun RNA-bindende activiteit niet kon worden voorspeld in silico gebaseerd op hun primaire volgorde alleen. Gezien het feit dat duizenden lncRNAs worden uitgedrukt in een bepaalde cel10, is het redelijk te veronderstellen dat velen van hen via interacties met handelen misschien nog worden ontdekt RNA-bindende proteÃ¯nen (RBPs). Een experimentele strategie om te identificeren deze roman RBPs zou daarom de taak van de ontrafeling van de biologische functie van ncRNAs aanzienlijk kunnen vergemakkelijken.
Eerdere pogingen om te identificeren RBPs empirisch hebben vertrouwd op polyA + RNA selectie gekoppeld aan massaspectrometrie (MS)11,12,13,14,15. Hoewel deze experimenten toegevoegd veel eiwitten aan de lijst van vermeende RBPs, door ontwerp, dat ze kon alleen het detecteren van eiwitten gebonden polyadenylated uitgeschreven. De meeste kleine RNAs en vele lncRNAs zijn echter niet polyadenylated. 16 , 17 en hun interacterende eiwitten zou waarschijnlijk hebben gemist in deze experimenten. Een recente studie toegepast machinaal leren op eiwit-eiwitinteractie interactome-databases op het identificeren van eiwitten die samen met meerdere bekende RBPs gezuiverd en toonde aan dat deze terugkerende RBP partners waren meer kans om te bezitten van RNA-bindende activiteiten18. Echter, deze aanpak is gebaseerd op mijnbouw bestaande grote interactie databases en herkent alleen eiwitten die mede gezuiverde in niet-denaturerende omstandigheden met bekende RBPs kunnen, dus met uitzondering van de analyse onoplosbare membraan-embedded en schaarse eiwitten.
De identificatie van een eiwit als een bona fide RBP vaak geen automatisch informatie over de biologische en/of biochemische functie van de interactie eiwit-RNA oplevert. Om aan dit punt, is het meestal wenselijk om de eiwit domein en aminozuur residuen betrokken bij de interactie te identificeren, zodat specifieke mutanten kunnen worden ontworpen om de functie van RNA-bindende testen in het kader van elke roman RBP19, 20. vorige inspanningen van onze fractie en anderen hebben gebruikt recombinant eiwit fragmenten en schrapping mutanten te identificeren van RNA-bindende regio's (RBRs)19,20,21,22; echter, dergelijke benaderingen zijn arbeidsintensief en onverenigbaar met hoge gegevensdoorvoer analyses. Meer recentelijk, een studie beschreven een experimentele strategie om de kaart van RNA-bindende activiteiten in een high-throughput mode met behulp van massaspectrometrie23; echter deze aanpak gebaseerd op een dubbele polyA + RNA-selectie, en dus uitgevoerd dezelfde beperkingen als de RBP identificatie benaderingen zoals hierboven beschreven.
We ontwikkelden een techniek, genoemd RNA bindende regio identificatie (RBR-ID), die exploiteert eiwit-RNA photocrosslinking en kwantitatieve massaspectrometrie om eiwitten en eiwit regio's interactie met RNA in levende cellen zonder te identificeren veronderstelling over de status van de polyadenylatie RNA, dus met inbegrip van RBPs afhankelijk van polyA-RNAs24. Bovendien, deze methode berust uitsluitend op crosslinking en stelt geen speciale eisen op eiwit oplosbaarheid of toegankelijkheid en is dus geschikt voor RNA-bindende werkzaamheden binnen membranen (bijvoorbeeld de nucleaire envelop) of slecht oplosbare compartimenten (kaart bijvoorbeeld de nucleaire matrijs). We beschrijven de experimentele stappen voor het uitvoeren van de RBR-ID voor de kernen van muis embryonale stamcellen (mESCs) maar met kleine aanpassingen dit protocol moet geschikt zijn voor allerlei soorten cellen, mits ze efficiënt 4SU van de cultuur opnemen kunnen medium.

```html
<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum, gekwalificeerd, US oorsprong</td><td>Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine oplossing 200 mM</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine oplossing</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>MEM Niet-essentiële aminozuur oplossing (100&times;)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO Leukemie Remmende Factor (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Sigma</td><td>PZ0162</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine oplossing, 2% in water</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>4-thiouridine</td><td>Sigma</td><td>T4509</td><td>50 mM stock in water</td></tr><tr><td>Spectrolinker XL-1500</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-90</td><td></td></tr><tr><td>Fenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CO-630</td><td>Sigma</td><td>542334</td><td>Commerciële vorm van octyl-fenoxy-polyethoxy-ethanol detergent</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, sequencing grade</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Empore solid phase extractie disk</td><td>3M</td><td>66883</td><td></td></tr><tr><td>OLIGO R3 omgekeerde - fase hars</td><td>Fisher Scientific</td><td>1133903</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E8263</td><td>Hoge zuiverheid nuclease</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator Model 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>discontinued</td><td>bijgewerkt met FB505110</td></tr><tr><td>HPLC-kwaliteit acetonitril</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-kwaliteit water</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Bicarbonaat</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Sigma</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 18-AQ</td><td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td><td>r13.aq.0003</td><td>Packing materiaal voor HPLC kolom</td></tr><tr><td>Capillair voor nano kolom (75 &micro;m)</td><td>Molex</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant software</td><td>Max Planck Institute for Biochemistry</td><td></td><td>Kan chromatografische uitlijning van meerdere MS runs uitvoeren</td></tr></tbody></table>
```

bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van rna-bindende regio 's

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs spelen een belangrijke rol in verschillende nucleaire processen, waaronder regulering van de expressie van genen, structuur van de chromatine en DNA-herstel. In de meeste gevallen is het optreden van noncoding RNAs gemedieerd door eiwitten waarvan de functies zijn op hun beurt weer gereguleerd door deze interacties met noncoding RNAs. In overeenstemming met dit, een groeiend aantal eiwitten die betrokken zijn in nucleaire functies hebben gemeld RNA binden en in enkele gevallen de RNA-bindende regio's van deze proteïnen zijn toegewezen, vaak door middel van moeizame, kandidaat-gebaseerde methoden.
Wij rapporteren hier een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een hoge-doorvoer, Proteoom bestrijkende onbevooroordeelde identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen en hun RNA-bindende regio's. De methodologie steunt op de opneming van een fotoreactief uridine analoge in de cellulaire RNA, gevolgd door UV-gemedieerde eiwit-RNA crosslinking en spectrometrische analyse te onthullen van RNA-kruisverwijzende peptiden binnen het proteoom. Hoewel we de procedure voor de muis embryonale stamcellen beschrijven, moet het protocol gemakkelijk worden aangepast aan een verscheidenheid van gekweekte cellen.

Figuur 1 toont de workflow van de RBR-ID. Als gevolg van de relatief lage crosslinking efficiëntie van deze techniek is het zeer belangrijk dat zowel het niveau van de uitputting en de consistentie van het waargenomen effect (P -waarde) over biologische wordt gerepliceerd. Figuur 2 toont een vulkaan plot van RBR-ID resultaat. Peptiden dat RNA erkenning motief (SRM) domein overlapt geven zeer consistente uitputting graad....

We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteÃ¯nen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Het algemene doel van deze procedure is om RNA-bindende eiwitten in levende cellen te identificeren en hun RNA-bindingsregio's in kaart te brengen met behulp van UV-gemedieerde fotocrosslinking gevolgd door massaspectrometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van epigenetica, zoals welke epigenetische regulatoren aan RNA gebonden zijn en welke eiwitregio's vereist zijn voor deze interacties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat purificatie van de eiwit-RNA-complexen niet nodig is, waardoor er weinig materiaal vereist is en eiwitten die gebonden zijn aan elk type RNA kunnen worden geïdentificeerd.Zoals gepresenteerd richt deze methode zich op kernproteïnen omdat dit onze wetenschappelijke interesse is, maar met kleine aanpassingen in de fractioneringsstappen zou deze methode kunnen worden gebruikt om RNA en bindende proteïnen in andere subnucleaire compartimenten te bestuderen. Nadat de muis-ESC's zijn gekweekt en uitgebreid volgens het tekstprotocol, worden de cellen uitgebreid naar het vereiste aantal platen van 10 centimeter. Voordat de platen confluent zijn, wordt vier SU direct aan het medium toegevoegd tot een eindconcentratie van 500 micro molar.Laat de 4sU-controleschalen onbehandeld. Schud de platen voorzichtig om de 4sU homogeen door het medium te verspreiden en plaats de platen vervolgens gedurende twee uur terug in dezelfde weefselkweekincubator. De efficiëntie van de 4sU-incorporatie varieert per celtype, waardoor het noodzakelijk kan zijn om de concentratie en incubatietijd te optimaliseren om een efficiënte cross-linking te waarborgen en toxiciteit te minimaliseren.Breng vervolgens de platen over naar een ijsemmer en gooi het medium weg. Gebruik daarna 5 milliliters ijskoud PBS om de platen voorzichtig te spoelen. Voeg 2 milliliters ijskoud PBS toe en plaats de platen zonder deksels in een cross-linker die is uitgerust met UV-B-emitterende lampen.Bestraal de platen bij een energie-instelling van 1 Joule per vierkante centimeter. Efficiënte UV-crosslinking is essentieel. Wij raden het gebruik van UV-B licht aan, maar UV-A kan ook worden gebruikt.In ieder geval moet de hoeveelheid gebruikte UV-energie worden geoptimaliseerd; dit kan worden gemonitord via PAR-CLIP of ChIRP. Gebruik celscrapers om de cellen te verzamelen en over te brengen naar ijskoud PBS in conische buizen. Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende vijf minuten bij 2000 ×g en 4 °C.Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in vijf milliliter ijskoud PBS met 2 millimol EDTA en 0,2 millimol PMSF. Tel de cellen met een hemocytometer. Verwacht vijf tot tien miljoen cellen uit 10 centimeter platen en tien tot twintig miljoen cellen uit 15 centimeter platen.Centrifugeer de cellen vervolgens bij 2000 ×g en 4 °C gedurende vijf minuten. Bereid, om kernen uit de cellen te isoleren, ijskoude buffer A voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg vóór gebruik 0,5 mM DTT en 0,2 mM PMSF toe aan de gewenste hoeveelheid buffer A. Voeg 2 mL van de koude buffer toe aan de cellen om deze te wassen, en centrifugeer de cellen vervolgens bij 2500 ×g en 4 °C gedurende vijf minuten.Verwijder het supernatant en voeg buffer A toe, aangevuld met 0,2 procent van een niet-ionisch, niet-denaturerend detergent, en laat het monster vervolgens vijf minuten roteren bij 4 graden celsius. Na het centrifugeren van de cellen bij 2500 times g gedurende vijf minuten, wordt het supernatant verwijderd. De pellet bevat intacte kernen zonder cytoplasma.Voeg 200 µL lysisbuffer toe aan de buis om de kernen te lyseren. Gebruik een probe van 1/8 inch om het monster te soniceren en het chromatine te sheareren bij een amplitudinstelling van 50 procent gedurende vijf tot tien seconden. Centrifugeer het monster op 12000 ×g gedurende vijf minuten en verzamel slechts 175 µL supernatant om het pellet te vermijden.Meet vervolgens de proteïneconcentratie via de Bradford-assay of een vergelijkbare techniek. Gebruik daarna lysislysisbuffer om de proteïne in de verschillende monsters te verdunnen tot 1 milligram per milliliter of de laagste monsterconcentratie. Voeg een 5 millimolaire DTT-oplossing toe aan het nucleair lysaat en incubeer het monster gedurende één uur bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 14 millimolair iodoacetamide toe uit een verse voorraad en incubeer het lysaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Verdun het lysaat met vijf keer het volume van 50 millimolair ammoniumbicarbonaat en voeg daarna trypsine toe. Incubeer het monster gedurende de nacht bij 37 degrees celsius.Om één op maat gemaakte stage-tip per monster voor te bereiden, plaatst u een schijfje C18-materiaal voor vaste-fase-extractie in de bodem van een 200 µL pipetpunt. Voeg 50 µL Oligo R3 reverse-phase hars bovenop het C18-schijfje toe, plaats de stage-tip vervolgens in een centrifugatieadapter en plaats de adapter in een 1,5 mL microcentrifugebuis. Voeg 100 µL 100% acetonitril toe aan de tips om deze te wassen.Centrifuge de tips vervolgens bij 1000 ×g gedurende één minuut om het oplosmiddel te verwijderen. Equilibreer de tips met 50 µL van 0,1% trifluorazijnzuur of TFA. Centrifugeer ze daarna opnieuw.Voeg 100% mierenzuur toe aan het gedigesteerde eiwitmonster om de pH te verlagen naar 2 tot 3. Laad het monster vervolgens op een op maat gemaakte stage tip en centrifugeer het monster bij 1000 ×g gedurende één minuut totdat het gehele monster door de tip is gegaan. Was de gebonden peptiden met 50 µL 0,1% TFA.Centrifuge het monster vervolgens één minuut bij 1000 ×g, elueer de peptiden door 50 µL elutiebuffer aan de stagtip toe te voegen en centrifugeer één minuut bij 1000 ×g om de elutiebuffer uit de tip te persen. Gebruik een vacuümcentrifuge, ingesteld op 150 ×g en 1 tot 3 kPa gedurende één uur, om het monster te drogen. Om cross-linked RNA uit het monster te verwijderen, wordt het pellet opnieuw gesuspendeerd in 50 µL 2x nucleasebuffer.Meet de peptideconcentratie bij 280 nanometer, uitgaande van 1 milligram per milliliter peptiden voor een A280 van 1. Gebruik 2x nucleasebuffer om alle monsters aan te passen naar één milligram per milliliter of naar de laagste concentratie, en bereid vervolgens een mastermix voor van 50 microliter water plus 1 microliter nuclease van hoge zuiverheid per monster. Combineer 50 microliter peptide monster met 50 microliter van de water-plus-nuclease mastermix.Incubeer het monster vervolgens gedurende één uur bij 37 °C. Voer ten slotte nanovloeistofchromatografie, massaspectrometrie en gegevensverwerking uit volgens het tekstprotocol. Deze figuur toont een volcano plot van een RBR id-resultaat van muizen-ESC's.Peptiden die overlapten met een RNA-herkenningsmotiefdomein zijn blauw gekleurd en vertonen zeer consistente uitputtingsniveaus. Een RNA-bindend peptide van HNRNPC is rood gemarkeerd. Hier wordt een heatmap getoond van RBR-id-scores, die zijn berekend als een schatting van de waarschijnlijkheid dat een eiwitregio aan RNA bindt.De score is geprojecteerd op het oppervlak van de spliceosomale subunit U1-70k. De helderrode kleur in de nabijheid van het RNA-contact, zoals bepaald door de kristalstructuur, duidt op een correcte identificatie van de eiwit-RNA-interactie. In deze figuur wordt TET2 gepresenteerd als een nieuw RBP en is de RNA-bindingsactiviteit toegewezen aan een C-terminale regio door de RBR id-score uit te zetten langs de primaire sequentie van het eiwit.Ten slotte kan de vereiste voor deze nieuwe RBR worden geverifieerd door PAR-CLIP uit te voeren met de wildtype-sequentie en het signaal te vergelijken met dat van een mutant waarin de voorspelde RBR ontbreekt. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in zeven tot acht uur over twee dagen worden uitgevoerd, mits dit correct wordt gedaan. Voorafgaand aan de cross-linking kunnen cellen worden gestimuleerd met verschillende behandelingen om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe differentiatie start of hoe de celcyclus RNA-proteïne-interacties reguleert.Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u extracten genereert die cross-linked proteïne-RNA-complexen bevatten om plaatsen van proteïne-RNA-interacties te identificeren met massaspectrometrie.

sample-preparation-for-mass-spectrometry-based-identification-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

RNA transcripten zijn onderworpen aan een uitgebreide posttranscriptionele regulering die wordt bemiddeld door een veelheid van trans-werkende RNA-bindende eiwitten (RBPs). Hier presenteren wij een generaliseerbaar methode om te identificeren precies en op een transcriptoom schaal van de RNA-bindingsplaatsen van RBPs.

PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren

In this video, we describe the systematic evolution of ligands by the exponential enrichment (SELEX) method to identify specific RNA-binding sequences for a target protein of interest. The protein is incubated with a large pool of randomized RNA sequences, and the protein-binding RNA sequences are isolated, PCR-amplified, and sequenced to identify their protein-binding sites.

SELEX-Based In Vitro Binding Assay to Identify RNA-Protein Interactions

Genexpressie analyse van een subset van cellen in een specifiek weefsel vormt een grote uitdaging. In dit artikel wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit totaal RNA van een specifieke cel populatie te isoleren door het combineren van een snelle immunolabeling methode met lasermicrodissectie.

RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

Sequentie specificiteit is essentieel voor genregulatie. Regelgevende eiwitten die specifieke sequenties herkennen zijn belangrijk voor genregulatie. Het definiëren van functionele binding sites voor dergelijke eiwitten is een uitdagend biologisch probleem. Een iteratieve benadering voor de identificatie van een bindingsplaats voor een RNA-bindend eiwit wordt hier beschreven en is toepasbaar op alle RNA-bindende eiwitten.

Sequentie ruimte verkennen om bindende sites te identificeren voor regulatoire RNA-bindende eiwitten

We presenteren een gedetailleerd klein RNA Library Reparatie protocol met minder bias dan standaardmethodes en een verhoogde gevoeligheid voor 2 '-O-methyl rna's. Dit protocol kan worden gevolgd met behulp van zelfgemaakte reagentia om kosten te besparen of kits te gebruiken voor het gemak.

Verbetering van kleine RNA-SEQ: minder bias en betere detectie van 2 '-O-methyl Rna's

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een LC-MS-gebaseerde sequencingmethode die kan worden gebruikt als een directe methode om kort RNA (&lt;35 nt per run) te sequencen zonder een cDNA-tussenproduct, en als een algemene methode om verschillende nucleotidemodificaties te sequencen in een enkele studie met precisie op één base.

2D-HELS MS Seq: Een algemene LC-MS-gebaseerde methode voor directe en de novo sequencing van RNA-mengsels met verschillende nucleotidemodificaties

MAPS-technologie is ontwikkeld om het targetoom van een specifiek regulerend RNA in vivo te onderzoeken. De sRNA van belang is gelabeld met een MS2 aptamer die de co-zuivering van zijn RNA-partners en hun identificatie door RNA-sequencing mogelijk maakt. Dit gewijzigde protocol is bijzonder geschikt voor Gram-positieve bacteriën.

MS2-Affinity Zuivering in combinatie met RNA Sequencing in Gram-Positieve Bacteriën

Het protocol geeft instructies voor het modificeren van RNA met dimethylsulfaat voor mutatieprofileringsexperimenten. Het omvat in vitro en in vivo tasten met twee alternatieve bibliotheekvoorbereidingsmethoden.

Onderzoekende RNA-structuur met dimethylsulfaatmutatieprofilering met sequencing in vitro en in cellen

Leer RNA-bindende eiwitten identificeren in levende cellen met UV-fotokoppeling en massaspectrometrie. Deze methode brengt eiwit-RNA-interacties in kaart zonder zuivering, wat waardevol is voor epigenetisch onderzoek.

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Meer video's verkennen