Name: Semi-geautomatiseerde analyse van muis skeletspieren morfologie en vezel-achtige samenstelling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Ontdek een semi-geautomatiseerde methode voor analyse van skeletspiervezels en morfologie bij muizen. Deze techniek versnelt de identificatie van vezelsubtypen en ondersteunt onderzoek naar spierziekten en functie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zijn dankbaar aan de Boettcher-Stichting en de vereniging Amyotrofische laterale sclerose (#17-II-344) voor hun steun aan dit onderzoek.

alle procedures waarbij muizen door de Universiteit van Colorado-Anschutz medische Campus institutionele Animal Care en gebruik Comité zijn goedgekeurd (91813(05)1D).
 1. dag 1: primaire (1°) immunokleuring met boviene serumalbumine (BSA) blokkeren <ol><li>luchtdroge bevroren secties van muis stuk spier (bijvoorbeeld tibialis anterior, soleus) gemonteerd op geladen geleiders voor ~ 30 min 11. een rand rond de secties met een hydrofobe barrière PAP pen tekenen.</li>
	<li>Plaats ~ 250 µL 5% BSA/fosfaatgebufferde zoutoplossing (BSA/PBS) op elke dia te blokkeren van niet-specifieke antilichaam binding. Incubeer dia's bij kamertemperatuur voor 1 h.</li>
	<li>Terwijl het blokkeren, bereiden 1:50 verdunningen van het 1° antilichaam supernatant in 5% BSA/PBS (alle zijn muis monoklonale antilichamen; Zie tabel 1 6 , 12); 250 µL van bereiden oplossing per dia. Houd 1° antilichaam voorraden en verdunningen op ice.</li>
</ol> <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> tabel 1: primaire antilichamen gebruikt om te onderscheiden MyHCs.
<ol start="4"> <li>na aspiratie van de 5% BSA/PBS blokkerende oplossing, 250 µL van 1° antilichaam verdunning aan de juiste dia's toevoegen. Toevoegen van 250 µL van 5% BSA/PBS aan secundaire (2°) antilichaam-alleen negatieve controle slides.</li>
	<li>Incubate bij 4 ° C gedurende 24-48 uur in een vochtige omgeving. 
	Opmerking: Een petrischaal bedekt met aluminiumfolie met vochtige filterpapier kan dienen als een kamer geschikt incubatie.</li>
</ol> 2. Dag 2:2 ° immunokleuring met fluorescerende antilichamen <ol><li>1° antilichaam oplossing gecombineerd of controle van 5% BSA/PBS-oplossing. Wassen all dia's drie keer, 10 min met 5% BSA.</li>
	<li>Tijdens het wassen, maak 1:200 verdunningen van het gezuiverde, fluorophore-geconjugeerde 2 ° antistoffen bij 5% BSA/PBS (Zie tabel 2, allemaal geit anti-muis). 250 µL van oplossing per dia voor te bereiden. 2° fluorophore-geconjugeerde antilichamen in het donker op ice. houden</li>
</ol> <img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> tabel 2: Fluorophore-geconjugeerde secundaire antilichamen gebruikt om te visualiseren primaire antilichaam erkenning van MyHCs.
<ol start="3"> <li>na aspiratie van de derde toepassing van blokkerende oplossing van 5% BSA/PBS, voeg 250 µL van 2° antilichaam verdunning op alle dia's. Incubeer gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur in een donkere, vochtige omgeving.</li>
	<li>Aspirate 2° antilichaam oplossing. Wassen all dia's drie keer, 10 min met 5% BSA/PBS.</li>
	<li>Uitspoelen met PBS. 10 min. drogen</li>
	<li>Mount het dekglaasje met een niet-permanente, lage viscositeit waterige montage medium.</li>
	<li>Droog, verzegelen de randen van de dia met nagellak. Droog en bewaar in een donkere slidebox.</li>
</ol> 3. Dia's met Epifluorescence microscopie Imaging <ol><li>de dia's met een kleine, 70% ethanol doordrenkte lab-veeg schoon.</li>
	<li>Verkrijgen digitale beelden van immunostained spier secties met behulp van een Microscoop van de epifluorescence uitgerust met een fotografische apparatuur (Zie de Tabel van de materialen).
	<ol><li>Selecteer een gebied van ongeveer 1 mm 2 (10 X doelstelling, 1.4 nb).</li>
		<li>View 2° Alexa 488-geconjugeerde antilichaam fluorescentie via een 505 nm long pass filter. Bekijk de fluorescentie gegenereerd door excitatie van 2° Alexa 594-geconjugeerde antilichamen via een 595 nm long pass filter. Afbeeldingen digitaliseren met een PC uitgerust met een compatibele imagingsoftware. Omvatten van de bar van de schaal van de denkbaar software voor een latere anayse.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analyse van beelden met Fiji Opmerking: voordat u verdergaat met analyse, Fiji (beschikbaar vrij van de National Institutes of Health, Bethesda, MD) moet worden geïnstalleerd via https://imagej.net/Fiji/Downloads. De macro gebruikt in dit proces is ook voorzien in het Aanvullende bestand. Plaats van het macro-bestand in een gemakkelijk toegankelijke map.
<ol><li>Belasting een helderveld afbeelding van een geselecteerde sectie in Fiji. Ga naar Plugins &#8594; segmentatie &#8594; trainbaar Weka segmentatie.</li>
	<li>Om te bepalen van de cellulaire gebieden van de afdeling, trek een lijn op een vezel, en klik op &#34; toevoegen aan de klasse 1 &#34;. Vervolgens een lijn op de ruimte tussen de vezels trekken, en op &#34; toevoegen aan klasse 2 &#34; ter gelegenheid van de extracellulaire domeinen. Herhaal totdat er 5-10 labels in elke klasse zijn.
	<ol><li>Klik op trein classificatie. Op de resulterende rode en groene overlay, handmatig meer labels toevoegen (zie stap 4.2) onjuist gesegmenteerde stukken van de afbeelding, indien nodig. Herhaal totdat vezels (rood) op de juiste manier zijn gescheiden van de ruimte tussen de vezels (groen).</li>
	</ol></li> <li>Klik &#34; krijgen kans &#34; en sla de afbeelding op in een nieuw label map.</li>
	<li>Herhaal de bovenstaande procedure (stap 4.2-4.3) met de fluorescerende beeld genomen uit hetzelfde veld. Label immunostained vezels als &#34; klasse 1 &#34; en alle niet-belichting fluorescerende regio's als &#34; klasse 2 &#34;. De resulterende kans-kaart opslaan in dezelfde map waar de verwerkte helderveld afbeelding is opgeslagen.</li>
	<li>Open één van de eerder opgeslagen waarschijnlijkheid kaarten in Fiji. Een rechte lijn tekenen op de werkbalk van de schaal verstrekt door de imaging software. Ga naar het analyseren &#8594; schaal instellen. Wijzigen van de parameters (d.w.z., bekende afstand, lengte-eenheid) naar de bijbehorende waarden als gegeven door de schaal bar, controleer dan de &#34; Global &#34; vak op de standaardisering van de schaal voor elk beeld.</li>
	<li>Navigeer naar Plugins &#8594; macro's &#8594; uitvoeren &#8594; Tyagi et al. vezel kwantificering macro.ijm (Zie het Aanvullende bestand). Onmiddellijk, zal een ruit van de navigatie verschijnen. Open de afbeelding &#39; s host map; Er verschijnt een dialoogvenster. Voor elk dialoogvenster, veranderen de &#34; achtergrond &#34; dropdown waarde aan &#34; licht. &#34; Opmerking: de map wordt nu gevuld met beelden van de vezel omtrekken en spreadsheet-bestanden van de software van de resultaten (CSA en Feret diameter zijn meest relevant zijn voor kwantificeren van de vezel de morfologie; gemeten parameters kunnen worden aangepast in analyseren Set metingen). Vezel morfologie gegevens gegenereerd door de functie van de porie-analyse van Fiji zal automatisch worden overgedragen aan de spreadsheet-bestanden van de software voor beide TL en helder veld beelden.</li>
	<li>Berekenen van de Fractie van de vezels uiting geven aan een bepaalde MyHC in een veld door het verdelen van het aantal fluorescerende vezels in het veld door het aantal totale vezels in het beeld helder veld overeenkomstige.</li>
</ol>

<ol><li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li>
<li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li>
<li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="https://skeletalmusclejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13395-014-0027-1">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li>
<li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li>
<li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li>
<li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li>
<li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228866300_Skeletal_muscle_fiber_types_in_C57BL6J_mice">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen openbaar te maken.

Wij hebben hier nuttig richting voor de identificatie van skeletale spiervezel typen verstrekt. Daarbij beschrijven we een nieuw algoritme voor analyse van de gegevens.
Omdat onze resultaten grotendeels die van eerdere verslagen5,-8,10 te bevestigen en onze eigen handmatige metingen weerspiegelen, weergegeven het algoritme nauwkeurig te zijn. Nog steeds, ondervonden we sommige zeldzame experimentele v...

Het is gekend voor enige tijd dat skeletspier uit één vezels van vele typen1 bestaat. Aanvankelijk twee soorten vezels werden gekenmerkt op basis van hun contractiele eigenschappen en genoemd, naar behoren, slow-twitch (type I) en fast-twitch (type II). Deze categorieën werden verder onderscheiden op basis van glasvezel metabolisme. Daar typ ik vezels zijn rijk aan mitochondriën en afhankelijk van het oxidatieve metabolisme, ze werden toegelicht door krachtig positieve nicotinamide adenine dinucleotide-tetrazolium reductase (NADH-TR) diaphorase2 of succinaat dehydrogenase (SDH)3 kleuring. Daarentegen, type II vezels minder tentoongesteld en variabele graden van NADH-TR diaphorase of SDH kleuring en werden verdeeld in twee subgroepen van de fast-twitch (typt u IIA en IIB) enigszins ruw op basis van hun relatieve oxidatieve capaciteit. Dit onderscheid tussen vezels hebben effectiever zijn gevisualiseerd door myosin-ATPase kleuring wanneer type-I vezels donkere vlekken na een pre-incubatie bij pH 4.0 en type IIB vezels absorberen overhaaste volgende pre-incubatie bij pH 10.0 met type IIA vezels kleuring gearchiveerd4.
Meer recentelijk heeft immunohistochemische kleuring van myosin zware ketting (MyHC) isoforms ontpopt als een fijnere discriminator type vezel5. Type I, type II en type IIB vezels kunnen worden alle geïdentificeerd met precisie op basis van hun MyHC profiel. Bovendien, een ander type van de fast-twitch metabolisch intermediair vezel, IIX, typ geweest geïdentificeerde6. Hybride vezels uiting van meer dan één MyHC zijn ook bevestigde5,7,8. Sommige soorten zoals de kat en de baviaan bekend er niet uitdrukkelijke Type IIB MyHCs6. MyHC immunokleuring is momenteel de state-of-the-art beoordeling van spier samenstelling, wel de analyse van de gegevens die zijn verkregen via deze techniek omslachtig en tijdrovend zonder geautomatiseerde hulp. Te dien einde geweest een handvol semi-geautomatiseerde methoden voor het analyseren van deze gegevens ontwikkelde5,9,10. Hier presenteren we een relatief standaardprotocol voor de immunohistochemische identificatie van spiervezel-type5,7,8,10, samen met een semi-automatische roman algoritme dat versnelt de analyse van de morfologie van het type vezel en vezels met nauwkeurigheid.

<table><tbody><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td>5% in PBS</td></tr><tr><td>Hydrophobic Barrier Pap Pen</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>Immumount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>L'Oreal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope</td><td></td><td>Discontinued</td><td></td></tr><tr><td>SPOT RT/KE</td><td>SPOT Imaging Solutions</td><td>RT940</td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BA-F8 Primary Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td><td></td><td>monoclonal mouse IgG2b; 1:50</td></tr><tr><td>SC-71 Primary Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td><td></td><td>monclonal mouse IgG1; 1:50</td></tr><tr><td>BF-F3 Primary Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td><td></td><td>monoclonal mouse IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>6H1 Primary Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td><td></td><td>monoclonal mouse IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td><td>Invitrogen</td><td>A21145</td><td>goat anti-mouse; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>goat anti-mouse;1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td><td>Invitrogen</td><td>A21044</td><td>goat anti-mouse;1:200</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>isopentane</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td>cool with liguid nitrogen</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP665-1</td><td>10x, dilute to 1x</td></tr><tr><td>Kim wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666A</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-geautomatiseerde analyse van muis skeletspieren morfologie en vezel-achtige samenstelling

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Jarenlang waren best onderscheid tussen skelet spiervezel typen gevisualiseerd door myosin-ATPase kleuring. Meer recentelijk heeft immunohistochemische kleuring van myosin zware ketting (MyHC) isoforms ontpopt als een fijnere discriminator van fiber-type. Type I, type IIA, typ IIX en type IIB vezels kunnen nu worden geïdentificeerd met precisie op basis van het profiel van hun MyHC; Handmatige analyse van deze gegevens kan echter traag en omlaag-rechts vervelend. Snelle, nauwkeurige beoordeling van het type vezel samenstelling en morfologie is in dit verband een zeer wenselijk hulpmiddel. Hier presenteren we een protocol voor state-of-the-art immunohistochemische kleuring van MyHCs in bevroren secties muis stuk spier in concert met een nieuwe semi-automatische algoritme, dat versnelt de analyse van de morfologie van het type vezel en vezels verkregen. Zoals verwacht, de Musculus soleus weergegeven kleuring voor type I en type IIA vezels, maar niet voor type IIX of type IIB vezels. Aan de andere kant, de tibialis anterior spier bestond voornamelijk uit type IIX en type IIB vezels, een klein deel van het type IIA vezels en weinig of geen typ ik vezels. Meerdere afbeelding transformaties werden gebruikt voor het genereren van waarschijnlijkheid kaarten met het oog op het meten van de verschillende aspecten van de morfologie van de vezel (d.w.z., doorsnede (CSA), maximale en minimale Feret diameter). De waarden voor deze parameters vervolgens met handmatig verkregen waarden vergeleken werden. Geen significante verschillen werden waargenomen tussen beide modus van analyse met betrekking tot CSA, maximale of minimale Feret diameter (alle p &#62; 0,05), met vermelding van de nauwkeurigheid van onze methode. Dus kan onze immunokleuring analyse protocol worden toegepast op het onderzoek van de effecten op de spier samenstelling in vele modellen van veroudering en myopathie.

Stuk spieren (dat wil zeggen, tibialis anterior, soleus) ontleed van een mannelijke C57BL/6 muis van onbekende leeftijd waren flash bevroren door het zinken van een plastic mal de spier in LGO met samengestelde in vloeibare stikstof-gekoelde tolueen. Met behulp van een cryotome, waren 8-10 µm seriële secties Knip bij-20 ° C en vervolgens overgebracht naar verschillende positief-geladen glas dia's12.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

Immunohistochemische kleuring van myosin zware ketting isoforms heeft ontpopt als de state-of-the-art-discriminator van skeletale spiervezel-type (d.w.z., typ ik typ IIA, typ IIX, type IIB). Hier presenteren we een kleuring protocol samen met een nieuwe semi-automatische algoritme, dat vergemakkelijkt de snelle beoordeling van de morfologie van het type vezel en vezels.

Semi-geautomatiseerde analyse van muis skeletspieren morfologie en vezel-achtige samenstelling

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Het algemene doel van dit protocol is om gebruik te maken van geavanceerde immunohistochemie om skeletspiervezeltypen nauwkeurig en snel te identificeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de spierbiologie, zoals de vraag of veranderingen in het vezeltype worden veroorzaakt door het verlies van functionele eiwitten. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in vele modellen van spierziekten, kan deze ook worden toegepast in systemen zoals knock-in- en knock-outmodellen om de grotere impact van een enkel molecuul op de basisfunctie van de spier te onthullen.Begin met het aan de lucht drogen van bevroren coupes van muisspier op geladen objectglazen gedurende ongeveer een half uur. Teken na het drogen een rand rond de coupes op elk objectglas met een hydrofobe PAP-pen. Om vervolgens aspecifieke antilichaambinding te blokkeren, brengt u ongeveer 250 microliters 5% BSA in PBS aan binnen de getekende randen en incubeert u de objectglazen gedurende een uur bij kamertemperatuur.Bereid ondertussen een verdunning van 1:50 van het primaire antilichaam in 5% BSA PBS voor. Maak ongeveer 250 µL per objectglas en bewaar de antilichaamverdunning op ijs. Zuig na de blokkeringsperiode de blokkeringsoplossing van de objectglazen af en voeg aliquots van 250 µL van de antilichaamverdunning toe.Breng voor een negatieve controle 5% BSA in PBS aan zonder primair antilichaam. Plaats vervolgens vochtig filterpapier in de Petrischaal en dek deze af met aluminiumfolie om een incubatiekamer te vormen. Incubeer de objectglazen daarna gedurende 24 tot 48 uur bij vier graden Celsius in de kamer of in een soortgelijke omgeving met dezelfde luchtvochtigheid.Zuig na de incubatie met het primaire antilichaam de oplossing van de objectglazen af en was de objectglazen drie keer. Breng bij elke wasbeurt ongeveer 250 µL 5% BSA in PBS aan gedurende ongeveer 10 minuten. Bereid tijdens het wassen van de objectglazen verdunningen van 1:200 van de gezuiverde, fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen.Bereid ten minste 250 µL per objectglas voor en bewaar de oplossing in het donker en op ijs. Voeg na de derde wasbeurt 250 µL van de verdunning van het secundaire antilichaam toe aan de objectglazen. Incubeer de objectglazen vervolgens gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur in een donkere, vochtige omgeving.Zuig na de incubatie de antilichaamoplossing af en was de coupes drie keer zoals eerder beschreven. Nadat alle overtollige secundaire antilichamen zijn weggewassen, spoelt u de coupes met PBS en laat u ze 10 minuten aan de lucht drogen. Monteer de coupes tot slot met een niet-permanent, laagviskeus waterig monteermedium.Nadat het medium is opgedroogd, worden de randen van het dekglas afgedicht met nagellak en worden de preparaten overgebracht naar een ondoorzichtige bewaardoos. Reinig het dekglas met 70% ethanol voordat een preparaat wordt gefotografeerd. Maak vervolgens digitale beelden met een epifluorescentiemicroscoop.Select bij lage vergroting een gebied van interesse van één vierkante millimeter. Gebruik een longpassfilter van 505 nanometer om Alexa 488-geconjugeerde antilichamen te bekijken. Gebruik een longpassfilter van 595 nanometer om Alexa 594-geconjugeerde antilichamen te bekijken.Zodra de filters correct zijn ingesteld, start u met het verzamelen van digitale beelden. Zorg ervoor dat u een schaalbalk opneemt voor de daaropvolgende analyse. Installeer voor de analyse Fiji in de macro die bij deze publicatie wordt geleverd.Sla het macrobestand op in een gemakkelijk toegankelijke map. Laad nu een brightfield-afbeelding van een geselecteerde sectie en navigeer naar de optie voor trainbare weka-segmentatie. Om de cellulaire gebieden van de sectie aan te geven, trekt u een lijn over een vezel en klikt u op 'add to class one'.Teken vervolgens een lijn in de ruimte tussen de vezels om de extracellulaire domeinen te markeren en klik op 'toevoegen aan klasse twee'. Herhaal dit proces totdat er vijf tot 10 labels van elke klasse zijn gedefinieerd. Het kan lastig zijn om de interstitiële grenzen te markeren.Door de zoomfunctie te gebruiken, kunnen deze grenzen met grotere precisie worden gemarkeerd. Selecteer vervolgens de optie 'train classifier'. Voeg op de resulterende rode en groene overlay handmatig meer labels toe aan alle delen van de afbeelding die onjuist zijn gesegmenteerd door het automatische proces.Doe dit totdat de in het rood gemarkeerde vezels adequaat zijn gescheiden van de in het groen gemarkeerde tussenliggende ruimtes. Klik vervolgens op get probability en sla de afbeelding op in een nieuwe map. Herhaal nu het gehele proces met behulp van de fluorescentieafbeelding die is genomen van hetzelfde veld.Label de immuungekleurde vezels als klasse één en alle niet-fluorescerende regio's als klasse twee. Sla de resulterende waarschijnlijkheidskaart vervolgens op in dezelfde map waar de bewerkte brightfield-afbeelding is opgeslagen. Open nu een van de eerder opgeslagen waarschijnlijkheidskaarten in Fiji.Trek een rechte lijn op de schaalbalk die door de beeldsoftware wordt geleverd. Selecteer 'set scale' en voer de juiste waarden in op basis van de schaalbalk. Schakel vervolgens de globale optie in om de schaal voor elke afbeelding te standaardiseren.Voer nu de Tyagi-macro uit voor vezelkwantificering, waarna het navigatievenster verschijnt. Open vervolgens de map met de afbeeldingen. Wijzig in het bijbehorende dialoogvenster de waarde in het vervolgkeuzemenu voor de achtergrond naar licht.De functie 'set measurements' kan worden gebruikt om te definiëren welke parameters gemeten moeten worden. De CSA en de diameter van de uiteinden zijn de meest relevante maten voor het kwantificeren van de vezelmorfologie. Na het uitvoeren van de macro wordt de map gevuld met afbeeldingen van de vezelcontouren en spreadsheets met de metingen die zijn uitgevoerd door de poor analysis-functie.De musculus tibialis anterior en de musculus soleus werden geanalyseerd met de beschreven methoden, omdat deze hoofdzakelijk zijn opgebouwd uit respectievelijk snel samentrekkende of langzaam samentrekkende vezels. Met behulp van specifieke antilichamen werden verschillende myosin heavy chains geïdentificeerd. Een aanzienlijk deel van de spiervezels van de musculus soleus vertoonde expressie van type 1 en type 2A myosin heavy chains, en een behoorlijk deel van de overige vezels was positief voor type 2X. In contrast hiermee waren er vrijwel geen type 2B-vezels waarneembaar.Ter vergelijking bestonden gekleurde musculus tibialis anterior-spieren hoofdzakelijk uit myosin heavy chain-vezels van type twee B en type twee X, met kleinere bijdragen van vezels die type twee A-ketens tot expressie brachten en vrijwel geen vezels die type één-ketens tot expressie brachten. Morfometrische analyse van een musculus tibialis anterior-spier, gesonde met SC-71-antilichamen gericht tegen type twee A myosin heavy chain, leverde verschillende beeldtransformaties op die werden gebruikt voor het maken van waarschijnlijkheidskaarten. Uit deze eenvoudige geautomatiseerde analyse bleek dat de gegevens volledig vergelijkbaar waren met gegevens die waren gegenereerd middels veel tijdrovendere handmatige berekeningen.Samen leverde de analyse gegevens op van ongeveer 6.000 individuele vezels in totaal. De hoge gegevensdoorvoer maakte de statistische analyse veel haalbaarder. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u spiersecties immunokleurt en de meegeleverde semi-geautomatiseerde software gebruikt om de analyse van het type en de samenstelling van spiervezels te vergemakkelijken.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat spierweefsel regionaal heterogeen kan zijn en dat de analyse van meerdere spiervelden noodzakelijk is voor een nauwkeurige beoordeling van het type en de samenstelling van de spiervezels. In combinatie met deze procedure kunnen andere methoden, zoals Trichroom-kleuring, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of er fibrose optreedt parallel aan veranderingen in de samenstelling van het vezeltype.

semi-automated-analysis-mouse-skeletal-muscle-morphology-fiber-type

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Myo-mechanische analyse van geïsoleerde Skeletal Muscle

Zebravis zijn een opkomende systeem voor het modelleren van menselijke aandoeningen van de skeletspieren. We beschrijven een snelle en efficiënte methode om skeletspier myovezels isoleren van embryonale en larvale zebravis. Deze methode levert een high-density myofiber voorbereiding geschikt voor onderzoek met een enkelvoudige skeletspieren vezelmorfologie, eiwit lokalisatie, en spier-fysiologie.

Analyse van de embryonale en larvale zebravis Skeletal myovezels van Gedissocieerde Voorbereidingen

Hier presenteren we een protocol voor snelle spiervezels analyses, welke verbeterde kleuring kwaliteit en daardoor automatisch ophalen en kwantificering van vezelpopulaties door de vrij beschikbare software ImageJ mogelijk maakt.

Een Rapid Automated Protocol voor Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Dwarsdoorsneden Met behulp van zware keten van myosine Immunohistochemie

Het vermogen om neuromusculaire verbindingscomponenten nauwkeurig te detecteren is cruciaal bij het evalueren van wijzigingen in de architectuur vanwege pathologische of ontwikkelingsprocessen. Hier presenteren we een volledige beschrijving van een eenvoudige methode om hoogwaardige beelden te verkrijgen van neuromusculaire verbindingen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve metingen uit te voeren.

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

Toenemend bewijs geeft aan dat overmatige infiltratie van lipiden in de skeletspieren resulteert in lipotoxiciteit en diabetes. Hier presenteren we een compleet protocol, inclusief weefselverwerking, kleuring met Bodipy, beeldacquisitie en analyse, om de grootte, dichtheid en subcellulaire verdeling van lipidedruppels op een vezeltypespecifieke manier te kwantificeren.

Vezeltype en subcellulair-specifieke analyse van lipidedruppelgehalte in skeletspieren

Dit protocol demonstreert isolatie van één vezel uit gevriesdroogde menselijke skeletspier- en vezeltypeclassificatie volgens Myosin heavy chain (MHC) isovorm met behulp van de dot blotting-techniek. Geïdentificeerde MHC I- en II-vezelmonsters kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd op vezeltype-specifieke verschillen in eiwitexpressie met behulp van western blotting.

Vezeltype-identificatie van menselijke skeletspieren

We beschrijven een protocol om enzymatisch gedissocieerde vezels van verschillende lengtes en typen te verkrijgen uit zes spieren van volwassen muizen: drie daarvan zijn al beschreven (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) en drie van hen zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

Hier beschrijven we een uitgebreide methode voor het meten van mitochondriale oxidatieve fosforylering in verse gepermeabiliseerde skeletspiervezels van menselijke of muizenspieren. Deze methode maakt de real-time kwantificering van de mitochondriale ademhaling en de beoordeling van brandstofvoorkeur en metabole flexibiliteit mogelijk, met behoud van bestaande mitochondriale netwerken en membraanintegriteit.

Meting van mitochondriale ademhaling in skeletspiervezels van mens en muis door middel van respirometrie met hoge resolutie

Lokale injecties van een mitochondriale kleurstof, labelen terminale Schwann-celmitochondriën in vivo voor confocale microscopie. Deze methode maakt gebruik van proof of concept aangetoond in skeletspierweefsel van muizen met gezonde of zieke spieren om een hoogresolutie mitochondriale visualisatie te bieden.

Methoden voor in situ kwantificering van mitochondriale morfologie in spier- en terminale Schwann-cellen van muizen

Een straight-forward set van methoden te isoleren en bepalen de identiteit van de meest voorkomende eiwitten die worden uitgedrukt in de skeletspieren. Ongeveer 800 plekken zijn onderscheiden op een twee-dimensionale gel van 10 mg spieren, dit maakt voor de bepaling van gender-specifieke eiwitexpressie. Deze methoden geven gelijkwaardige resultaten in de meeste weefsels.

Skeletspieren Geslacht dimorfisme van Proteomics

Ontdek een semi-geautomatiseerde methode voor analyse van skeletspiervezels en morfologie bij muizen. Deze techniek versnelt de identificatie van vezelsubtypen en ondersteunt onderzoek naar spierziekten en functie.

Semi-geautomatiseerde analyse van muis skeletspieren morfologie en vezel-achtige samenstelling

Meer video's verkennen