3' eind Sequencing bibliotheek voorbereiding met A-seq2

Het algemene doel van deze methode is het vastleggen en sequensen van de 3'-uiteinden van mRNA, waardoor studies naar mRNA-verwerking, in het bijzonder 3'-uiteindsplitsing en polyadenylering, evenals de kwantificering van genexpressie mogelijk worden. Het A-seq2-protocol en het gepresenteerde pakket voor data-analyse kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de generatie en functie van transcript-isoformen in verschillende celtypen en weefsels. De belangrijkste voordelen van de A-seq2-methode zijn dat het sequensen door lange poly(A)-strekkingen vermijdt en dat er geen adapterdimeren worden gegenereerd.

Voor deze procedure worden cellen gebruikt die zijn uitgegroeid tot 80% confluentie. Verwijder het groeimedium en was de cellen eenmaal met PBS. Lyseer de cellen direct op de plaat door één milliliter lysisbuffer per putje toe te voegen en een rubberen spatel te gebruiken om het celmateriaal volledig van het platoppervlak los te maken.

Gebruik een pipetpunt van één milliliter om het viskeuze lysaat uit elke put over te brengen naar een plastic buis van 15 milliliter. Meng het DNA met een spuit van één milliliter voorzien van een hypodermische naald van 23 gauge. Voer meerdere krachtige op-en-neergaande bewegingen met de zuiger uit, totdat het lysaat niet langer viskeus is.

Breng het lysaat over in een buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer bij 20 000 ×g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten om het debris te verwijderen. Verzamel de heldere supernatant van het lysaat.

Voeg oligo d(T)25 magnetische kralen toe en resuspendeer het mengsel. Plaats de buisjes gedurende 10 minuten op een rotatiewiel. Plaats de buisjes vervolgens gedurende twee minuten op een magnetisch rek.

Verwijder de heldere vloeistof. Voeg 0,8 milliliters buffer A toe aan elke buis en draai de buis twee tot drie keer 180 graden. Verwijder buffer A na de tweede wasstap.

Voeg 0,8 milliliter buffer B toe aan elke buis en laat deze twee minuten in het rek staan. Om het gebonden mRNA van de beads te elueren, verwijdert u buffer B, voegt u 33 microliter water toe aan elke buis en resuspendeert u de beads. Verwarm gedurende vijf minuten op 75 graden Celsius op een verwarmingsblok.

Centrifuge de buisjes onmiddellijk één seconde en plaats ze op het magnetische rek. Overbreng het supernatant naar een nieuwe buis. Voeg 66 µL alkalische hydrolysebuffer toe aan elke buis, meng en verhit gedurende precies vijf minuten op 95 °C op een warmteblok.

Koel de buisjes onmiddellijk op ijs. Voer vervolgens RNA-isolatie uit met behulp van een RNA-opreinigingskit, zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg om met deze procedure te beginnen 14 µL van een polynucleotidekinase Master Mix toe aan elk RNA-monster.

Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Laad na 30 minuten de kinasereacties op voorbereide spinzuilen. Centrifugeer de zuilen twee minuten bij 735 ×g.

Gooi de kolommen weg en plaats de buisjes met de verzamelde reacties op ijs. Om de drie 3'-uiteinden van de RNA-fragmenten te blokkeren en concatemerisatie in daaropvolgende ligatiereacties te voorkomen, voegt u aan elk monster 17,5 µL van een poly(A)polymerase Master Mix toe. Meng en centrifugeer gedurende één seconde.

Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Voeg na 30 minuten 32,5 µL water toe aan elke reactie en zuiver het RNA, zoals beschreven in het tekstprotocol. Start deze procedure door de reacties gedurende 10 minuten in een vacuümconcentrator te plaatsen om het volume te reduceren tot 6 µL.

Voeg vervolgens aan elke reactie 24 µL van een RNA ligase Master Mix toe. Incubeer de reacties op een verwarmde mixer bij 24 °C gedurende 16 uur, met periodiek mengen bij 1000 RPM. Voeg de volgende dag aan elke reactie 17 µL water toe en meng.

Purificeer het RNA, zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de eluenten gedurende drie minuten in een vacuümconcentrator om het volume te reduceren tot 11 µL. Breng de reacties over naar 200 µL PCR-buisjes voor de reverse transcriptie-reactie.

Voeg één µL primer toe. Verhit gedurende vijf minuten bij 70 °C in een PCR-cycler en laat het vervolgens vijf minuten op kamertemperatuur staan. Voeg acht µL reverse transcription Master Mix toe aan elke buis en meng.

Plaats de buisjes in een PCR-cycler. Verhit gedurende 10 minuten op 55 °C en vervolgens nogmaals 10 minuten op 80 °C. Bewaar op ijs.

Bereid streptavidinekralen voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg de reverse transcriptie-reactie toe aan de kraaloplossing en incubeer deze 20 minuten bij vier graden Celsius op een rotatiewiel. Was de kralen met behulp van een magnetisch rek twee keer met biotinbindingbuffer en twee keer met TEN-buffer.

Resuspendeer de beads in 50 µL TEN-buffer. Voeg twee µL uracil-DNA-glycosylase enzymmix toe en incubeer gedurende één uur bij 37 °C in een mixer, met tussentijdse menging. Voeg aan elke reactie 50 µL water, 11 µL RNase H-buffer en één µL RNase H toe.

Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C. Plaats de buisjes in het magnetische rek en breng de vloeistof met het geknipte cDNA over naar een nieuw buisje. Zuiver het geknipte cDNA met een PCR-zuiveringskit, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Plaats het gezuiverde cDNA acht minuten in een vacuümconcentrator om dit te concentreren tot een volume van 7 µL. Om 5'-adapters aan de 5'-uiteinden van het geïsoleerde cDNA te ligeren, voegt u aan elk monster 23 µL van een RNA-ligase Master Mix toe en incubeert u dit 20 uur bij 24 °C. Voeg ten slotte aan elke reactie 70 µL water toe.

Er wordt een pilot PCR uitgevoerd om het optimale aantal PCR-cycli te bepalen om library-amplificatie te bereiken binnen de exponentiële fase. Pipetteer het volgende in een PCR-buisje van 200 µL: 25 µL DNA-polymerasemix, 20 µL ligatiereactie, 2 µL water, 1,5 µL forward PCR-primer en 1,5 µL reverse PCR-indexprimer. Start de thermocycler met het volgende programma: drie minuten bij 95 °C, gevolgd door 20 cycli van 20 seconden bij 98 °C, 20 seconden bij 67 °C en 30 seconden bij 72 °C.

Neem direct uit de thermocycler aliquots van zeven µL af na de aangegeven cycli. Scheid de producten op een 2% agarosegel en visualiseer de migratie van de PCR-producten. Bepaal het aantal cycli aan het begin van de exponentiële amplificatie, in dit voorbeeld 12 cycli, en gebruik dit aantal cycli voor een grootschalige PCR-reactie.

Scheid de producten van de PCR-reactie op grote schaal op een 2% agarosegel en snijd de gelplakjes uit die DNA-producten van 200 tot 350 nucleotiden bevatten. Extraheer vervolgens het DNA uit de gelplakjes met de gel-extractiekit, zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze video worden alleen de belangrijkste computationele stappen getoond.

Meer details zijn beschikbaar in het tekstprotocol. Begin met het klonen van de Git-repository en ga naar de nieuw aangemaakte directory. Maak een omgeving aan die de software bevat en activeer deze omgeving.

Download de genoomsequentie van het organisme waarvan de A-seq2-gegevens zijn verkregen. Open het configuratiebestand en stel de invoerparameters in, zoals aangegeven in het tekstprotocol. Start de analyse.

De respons van een specifiek gen, NUP214, op de knockdown van het HNRNPC-eiwit werd onderzocht door a-seq2-reads te analyseren van twee monsters HEK-293-cellen, behandeld met respectievelijk een controle-small interfering RNA of een HNRNPC-small interfering RNA. De reads die poly(A)-sites documenteerden die door de analysepipeline waren geannoteerd, werden opgeslagen in BAM-formaat, wat werd gebruikt als input voor de IGD-genoombrowser. De 3'-uiteinden van de read-pieken werden gemapt op mMRNA 3'-uiteinden die zijn geannoteerd in ensemble.

De profielen wijzen op een verhoogd gebruik van de lange 3'-UTR-isovorm na HNRNCR-knockdown. Eenmaal beheerst, vereist het A-seq-protocol acht uur aan actieve werktijd of ongeveer twee tot drie dagen, exclusief de tijd voor de celkweek en de overnight-ligaties. Bij het uitvoeren van het protocol is het belangrijk om eerst een primer-set te ontwerpen die compatibel is met het sequencingsplatform dat op uw locatie wordt gebruikt.

Zodra u de 3'-uiteinden van het mRNA heeft verkregen, kunnen andere methoden, zoals cross-linking en immunoprecipitatie, worden uitgevoerd om regulatoren van de 3'-uiteindverwerking van pre-mRNA te identificeren. A-seq2 heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van RNA-verwerking om de regulatie en de gevolgen van alternatieve polyadenylering in individuele celtypen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u bibliotheken van mRNA 3'-uiteinden genereert, uw sequensgegevens analyseert, nieuwe poly(A)-sites identificeert en het gebruik ervan kwantificeert.

We hopen dat A-seq2 uw werk bij het bestuderen van de regulatie van mRNA-processing zal vergemakkelijken en zal leiden tot vele nieuwe inzichten.