Name: 3 eind Sequencing bibliotheek voorbereiding met A-seq2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Leer de A-seq2 methode voor het in kaart brengen van mRNA 3'-einden en polyadenylering. Dit protocol helpt onderzoekers bij het kwantificeren van genexpressie en transcript isoformen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken mevrouw Béatrice Dimitriades voor hulp bij de cultuur van de cel. Dit werk werd gesteund door de Zwitserse National Science Foundation subsidies #31003A_170216 en 51NF40_141735 (NCCR RNA &#38; ziekte).

<ol><li>Jan, C. H., Friedman, R. C., Ruby, J. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation%2C+regulation+and+evolution+of+Caenorhabditis+elegans+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation, regulation and evolution of Caenorhabditis elegans 3'UTRs.</a> Nature. 469 (7328), 97-101 (2011).</li>
<li>Spies, N., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27+UTR-isoform+choice+has+limited+influence+on+the+stability+and+translational+efficiency+of+most+mRNAs+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">3' UTR-isoform choice has limited influence on the stability and translational efficiency of most mRNAs in mouse fibroblasts.</a> Genome Res. 23 (12), 2078-2090 (2013).</li>
<li>Hoque, M., Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+alternative+cleavage+and+polyadenylation+by+3%27+region+extraction+and+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of alternative cleavage and polyadenylation by 3' region extraction and deep sequencing.</a> Nat. methods. 10 (2), 133-139 (2013).</li>
<li>Martin, G., Gruber, A. R., Keller, W., Zavolan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+pre-mRNA+3%E2%80%99+end+processing+reveals+a+decisive+role+of+human+cleavage+factor+I+in+the+regulation+of+3%27+UTR+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of pre-mRNA 3’ end processing reveals a decisive role of human cleavage factor I in the regulation of 3' UTR length.</a> Cell Rep. 1 (6), 753-763 (2012).</li>
<li>Gruber, A. R., Martin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+3%27+UTR+shortening+has+a+limited+effect+on+protein+abundance+in+proliferating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Global 3' UTR shortening has a limited effect on protein abundance in proliferating T cells.</a> Nat. Commun. 5, 5465(2014).</li>
<li>Kivioja, T., Vähärautio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+absolute+numbers+of+molecules+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers.</a> Nat. methods. 9 (1), 72-74 (2011).</li>
<li>Gruber, A. J., Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+analysis+of+3%27+end+sequencing+data+sets+reveals+novel+polyadenylation+signals+and+the+repressive+role+of+heterogeneous+ribonucleoprotein+C+on+cleavage+and+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive analysis of 3' end sequencing data sets reveals novel polyadenylation signals and the repressive role of heterogeneous ribonucleoprotein C on cleavage and polyadenylation.</a> Genome Res. 26 (8), 1145-1159 (2016).</li>
<li>Lingner, J., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-end+labeling+of+RNA+with+recombinant+yeast+poly%28A%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3'-end labeling of RNA with recombinant yeast poly(A) polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (12), 2917-2920 (1993).</li>
<li>Quail, M. A., Kozarewa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat. methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li>
<li>Analytics, C. Anaconda Software Distribution. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://continuum.io">https://continuum.io</a> (2016).</li>
<li>Lab, H. FASTX-Toolkit - Hannon Lab. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html</a> (2017).</li>
<li>Dobin, A., Davis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Robinson, J. T., Thorvaldsdóttir, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Ozsolak, F., Platt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7265/full/nature08390.html">Direct RNA sequencing.</a> Nature. 461 (7265), 814-818 (2009).</li>
<li>Yao, C., Biesinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+analyses+of+CstF64-RNA+interactions+in+global+regulation+of+mRNA+alternative+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide analyses of CstF64-RNA interactions in global regulation of mRNA alternative polyadenylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (46), 18773-18778 (2012).</li>
<li>Lin, Y., Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-depth+map+of+polyadenylation+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An in-depth map of polyadenylation sites in cancer.</a> Nucleic Acids Res. 40 (17), 8460-8471 (2012).</li>
<li>Shepard, P. J., Choi, E. -A., Lu, J., Flanagan, L. A., Hertel, K. J., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+and+dynamic+landscape+of+RNA+polyadenylation+revealed+by+PAS-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Complex and dynamic landscape of RNA polyadenylation revealed by PAS-Seq.</a> RNA. 17 (4), 761-772 (2011).</li>
<li>Fu, Y., Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+genome-wide+profiling+of+tandem+3%27+UTRs+among+human+breast+cancer+and+normal+cells+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Differential genome-wide profiling of tandem 3' UTRs among human breast cancer and normal cells by high-throughput sequencing.</a> Genome Res. 21 (5), 741-747 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De veelheid van kern- en ondersteunende factoren die bij pre-mRNA 3' eind verwerking betrokken zijn wordt weerspiegeld in een dienovereenkomstig complexe polyadenylatie landschap. Polyadenylatie is bovendien ook inspelen op veranderingen in andere processen zoals transcriptie, egaliseren en lamineren. 3' eind decollete sites in pre-mRNAs worden normaal gesproken aangeduid op basis van de karakteristieke poly(A) staarten die worden toegevoegd aan de 5'-splitsingsproducten. De meeste methoden gebruiken oligo(dT) inleidingen van variabele lengte waarmee de specifieke omzetting van poly (A)-met mRNAs te cDNAs in een omgekeerde transcriptie reactie. Een gemeenschappelijk probleem van deze aanpak is interne priming aan A-rijke sequenties resulterend in artefactuele decollete sites. Twee methoden die gericht zijn op het omzeilen van dit artefact in de fase van de bereiding van de monsters zijn voorgesteld. In de 3P-seq methode 1, adapters ligatuur zijn specifiek verbonden aan de uiteinden van poly(A) staarten met hulp van een splint oligo gevolgd door gedeeltelijke RNase T1 spijsvertering en omgekeerde transcriptie met TTP in de reactie als de enige deoxynucleotide. De resulterende poly(A)-poly(dT) heteroduplexes zijn dan verteerd met RNase H en zijn de overgebleven fragmenten van RNA sequenced, geïsoleerd en afgebonden aan adapters. Een eenvoudiger en elegante methode, 2P-seq, die gebruikmaakt van een aangepaste volgorde primer overslaan het resterende traject van het oligo(dT) in de sequencing-reactie werd gemeld door de dezelfde auteurs 2. In een verwante methode, 3' leest 3, een ongewoon lange primer van 5 ons en 45 Ts, ook met een Biotine is gegloeid te gefragmenteerde RNA, gevolgd door strenge wast om te selecteren voor de molecules van RNA met de staart van de poly(A) van meer dan 50 nucleotiden. Hoewel 3' leest drastisch de frequentie van interne priming vermindert, doet het niet volledig elimineren het 3. Protocollen voor directe RNA sequencing hebben ook voorgesteld, maar de resulterende leest zijn kort en hebben een hoge foutenpercentage en deze aanpak is niet verder ontwikkelde 18,19,20. De PolyA-Seq en de gecommercialiseerd Quant Seq protocollen combineren oligo(dT) gebaseerd priming met een willekeurige priming stap voor de cDNA tweede onderdeel synthese 20. Het gebruik van de sjabloon switch omgekeerde transcriptie reactie met de reverse-transcriptase Moloney lymfkliertest Leukemie Virus (MMLV) leidt tot de generatie van cDNAs met de linkers in één stap en daardoor geen adapter-Dimeren kunnen worden weergegeven in de PAS-Seq en SAPAS methoden 21 , 22.
De A-seq2-methode gepresenteerd hier opvalt in het gebruik van een cleavable nucleotide (dU) binnen een biotinyleerd oligo(dT) primer. Deze wijziging combineert het nut van het verrijken van oligo(dT) gekruist, polyadenylated doelstellingen met de verwijdering van de meeste van de oligo (dT)25 sequentie van de geïsoleerde fragmenten voordat bibliotheken zijn bereid en het behoud van drie t's, die wijzen op de voorafgaande aanwezigheid van de staart van de poly(A). Daarentegen laat methoden die gebruikmaken van RNase H Schakel poly(A) uit de RNA-moleculen willekeurig als verschillende. Aangezien A-seq2, sequencing van 3' eind van de anti-zin-strengen gebeurt, wordt decollete sites voorspeld dat na het motief van de NNNNTTT aan het begin van ruwe volgorde leest bevinden. De gerandomiseerde tetramers dienen niet alleen om basis bellen maar ook in de eliminatie van PCR versterking artefacten. Langere UMIs kunnen ook worden ondergebracht. De mogelijkheid van interne priming blijft in A-seq2 en rekenkundig is gericht, eerst door teruggooi 3' eindigt met een genomically-gecodeerde, A-rijke downstream volgorde, en vervolgens door het teruggooien van 3' eind clusters die kon worden verklaard door interne priming op de A-rijke poly(A) signaal zelf. Een recente analyse van poly(A) sites uniek afgeleid door een groot aantal protocollen geeft aan dat de sites die uniek voor A-seq2 zijn de verwachte nucleotide distributie en locatie in de genen, vergelijkbaar met andere 3' eind rangschikken protocollen.
Een cruciale stap in de A-seq2 is de selectie van polyadenylated RNA en de verwijdering van ribosomaal RNAs en diverse kleine RNAs. Dit gebeurt meest gemakkelijk door een mRNA-isolatie kit met oligo (dT)25 magnetische kralen. In principe geeft totaal RNA geïsoleerd met fenol met oplossingen ook hoge kwaliteit RNA dat kan verder worden onderworpen aan selectie door de mRNA-isolatie kit of agarose oligo (dT). Een stap die kan worden gevarieerd in A-seq2 is de behandeling met alkalische hydrolyse, die kan worden ingekort of uitgebreid tot het verkrijgen van RNA fragmenten van verschillende grootte. Kritische is ook dat de toevoeging van 3' dATP aan 3' einden van RNA fragmenten door de polymerase van poly(A) efficiënt is. In het protocol beschreven hier, wordt deze behandeling toegepast op alle fragmenten van RNA, om te voorkomen dat concatemerization tijdens de afbinding reactie. Tot slot, wij stellen vast dat hoewel RNA ligase 1 gewoonlijk als een RNA-ligase gebruikt wordt, ligates het ook efficiënt één gestrande DNA, zoals wij hier hebben gedaan om een adapter aan het einde 5' van de moleculen van cDNA afbinden.
A-seq2 is dus een efficiënte en eenvoudig te implementeren protocol voor de identificatie van pre-mRNA 3' eind verwerking van sites. Toekomstige ontwikkelingen eventueel verdere vermindering van de complexiteit van het protocol en de hoeveelheid benodigde materiaal. De bijbehorende set voor computationele gegevensanalyse verder de homogene verwerking van 3' eind sequencing leest verkregen met een breed scala aan protocollen inschakelen.

De vangst en de sequencing van mRNA 3' einden maakt de studie van mRNA verwerking en de kwantificering van de genexpressie. Als gevolg van hun poly(A) staarten, kan eukaryote mRNAs gezuiverd worden efficiënt uit de cel Totaal lysates met kraal-geïmmobiliseerd oligo-deoxythymidine (oligo(dT)) moleculen, die kan ook prime cDNA synthese. Deze benadering heeft echter twee nadelen. Eerst, kunnen stukken van de A's die intern de uitgeschreven zijn ook prime cDNA synthese, resulterend in valse poly(A) sites. De rek van de tweede, homogene poly(A) vormen specifieke uitdagingen voor de sequencing, afgezien van niet informatief voor transcript identificatie. Verschillende benaderingen hebben voorgesteld te omzeilen deze beperkingen, zoals omgekeerde transcriptie via poly(A) staarten gevolgd door RNase H spijsvertering (3 P-seq 1), gebruik van een primer van de aangepaste volgorde die eindigt op 20 Ts (2 P-seq 2), preselectie van De fragmenten van RNA met de staart van de poly(A) van meer dan 50 nucleotiden met een CU5T45 primer gevolgd door RNase H spijsvertering (3' leest 3), en het gebruik van een primer oligo-dT, waarin de 3'-adapter in een haarspeld (A-seq 4).
De onlangs ontwikkelde methode A-seq2- 5 wil omzeilen sequencing via poly(A) en op hetzelfde moment te minimaliseren van het aantal Dimeren die worden gegenereerd door de zelf-Afbinding van adapters, met name die zich voordoen wanneer de molaire concentratie van adapters opweegt tegen de concentratie invoegen. Dit probleem kan worden geëlimineerd wanneer beide adapters als ligatuur zijn verbonden aan het zelfde type van polynucleotide eindigt zoals A-seq2, waar de 3'-adapters als ligatuur zijn verbonden aan het einde 5' van de fragmenten van RNA en de adapters 5' aan 5' einden van de cDNAs na omgekeerde transcriptie. De methode meer is handiger dan onze eerder voorgestelde A-seq - in die volgorde in de 5'-tot-3 was ' richting waardoor juist gecontroleerd RNA fragmentatie-, terwijl het handhaven van een hoge nauwkeurigheid van de identificatie poly(A). Ongeveer 80% van de gesequenceerd luidt in typische monsters kaart uniek aan het genoom en leiden tot identificatie van meer dan 20.000 poly(A) site clusters, meer dan 70% van die overlapping met geannoteerde 3' UTRs.
Kortom, begint het A-seq2-protocol met mRNA fragmentatie en Afbinding van omgekeerde-aanvulling 3' adapters aan de 5' einden van de fragmenten van RNA. Poly (A)-met RNAs worden vervolgens reverse transcriptie met een 25 nucleotide (nt) lange oligo(dT) primer waarin een nucleotide anker aan de 3'-eind, een dU op positie 4 en een Biotine eind 5', waardoor binding van cDNA aan magnetische daar kralen. Allermeest naar de primer, met inbegrip van de biotine, wordt verwijderd uit de cDNA door decollete in dU door de gebruiker enzym mix, met Uracil DNA glycosylase (UDG) en het DNA glycosylase-lyase Endonuclease VIII. Deze reactie laat intact uiteinden voor de afbinding van een 5'-adapter, en drie Ts links na splitsing blijven ter gelegenheid van de locatie van de poly(A) staart. Omdat zowel 5' en 3' adapters zijn aangesloten door afbinding aan geadresseerden 5' einden, worden geen adapter-Dimeren gegenereerd. Vier nucleotide willekeurige-mers geïntroduceerd aan het begin van leest cluster resolutie staat op volgorde van de state-of-the-art instrumenten en kan ook dienen als moleculaire eenduidig (UMI) voor het detecteren en verwijderen van PCR versterking artefacten. De grootte van het UMI kan verder worden verhoogd, zoals in andere studies 6gedaan. Het protocol genereert leest dat complementair is aan mRNA 3' einden, allemaal beginnen met een gerandomiseerde tetrameer gevolgd door 3 Ts. verwerking van luidt dat de 3 diagnostische Ts hebben op hun einde begint 5' met de correctie van PCR versterking artefacten door zijn afgewikkeld exploitatie van de UMIs, verwijdering van 3' adapter sequenties, en reverse complementatie. Leest dat hebben afkomstig van oligo(dT) priming op interne A-rijke sites is kunnen zijn ook rekenkundig geïdentificeerd en verwijderd. De valse sites ontbreken doorgaans een van de 18 goed gekarakteriseerd en geconserveerde poly(A) signalen die moeten gelegen ~ 21 nucleotiden stroomopwaarts van de schijnbare decollete site 7.
Het protocol vereist ongeveer 8 h hands-on tijd, niet tellen celkweek en de nachtelijke ligations. De bijbehorende Lees analyse software een zeer nauwkeurige poly(A) site identificatie mogelijk maakt. Vanaf de site van poly(A) clusters gemaakt op basis van 4 monsters verder benadrukt in dit manuscript (twee biologische replicatieonderzoeken van controle siRNA en si-HNRNPC-testgroep cellen) 84% overlapping met een geannoteerde gen, en daarvan 75% overlappen met een 3-' UTR, en 86% met ofwel een 3' UTR of een terminal exon. De Pearson-correlatiecoëfficiënt van expressie van 3' einden in de analysemonsters is 0.92 en waarden van meer dan 0,9 worden meestal verkregen met de methode. A-seq2 is dus een handige methode die zeer reproduceerbare resultaten geeft.

<table><tbody><tr><td>Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose, ultra puur</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Cordycepin trifosfaat (3&rsquo; dATP)</td><td>SIGMA</td><td>C9137</td><td></td></tr><tr><td>DNA laag bind buisjes, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>SIGMA</td><td>D8637</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td><td>Ambion</td><td>AM61012</td><td></td></tr><tr><td>GR-Green kleurstof</td><td>Excellgen</td><td>EG-1071</td><td>gebruik 1:10.000 verdunning</td></tr><tr><td>HiSeq 2500 of NextSeq 500 volgende generatie sequencers</td><td>Illumina</td><td>informeer bij leverancier</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart DNA polymerase mix</td><td>KAPA/Roche</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease vrij water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymerase, gist</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>74225Z25KU</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymerase, E.coli</td><td>New England Biolabs</td><td>M0276L</td><td></td></tr><tr><td>Polynucleotide kinase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Gel Extractie Kit</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR zuivering Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extractie Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RNA ligase 1, hoge concentratie</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M</td><td>bevat PEG-8000</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute RNA opruimingskit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0279</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus, ribonuclease remmer</td><td>Promega</td><td>N2618</td><td></td></tr><tr><td>Superscript IV reverse transcriptase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>USER enzymmix</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505</td><td></td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 magnetisch rek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Verwarmde mixer met verwarmde deksel</td></tr><tr><td>MicroSpin kolommen</td><td>GE-Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline hydrolyse buffer, 1,5 x</td><td></td><td></td><td>Meng 1 deel 0,1 M Na2CO3 en 9 delen 0,1 M NaHCO3. Voeg EDTA toe tot 1 mM. Pas pH aan tot 9,2. Bewaar aliquots bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>5x poly(A) polymerase buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>100 mM Tris-HCl, pH 7,0, 3 mM MnCl2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mg/ml geacetyleerd BSA, 50% glycerol</td></tr><tr><td>Biotine binding buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris&shy;Cl pH 7,5, 2 M NaCl, 0,1% NP&shy;40</td></tr><tr><td>TEN buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris&shy;Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,02% NP&shy;40</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Volgorde</td></tr><tr><td>Oligonucleotiden volgens Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits, voor GA-IIx en Hiseq2000/2500 sequencers</td><td>Microsynth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>revRA3 (RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&rsquo; amino&shy; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&shy; 3&rsquo;</td></tr><tr><td>revDA5</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5&rsquo; amino&shy; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3&rsquo;</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, RT primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3' (V = G, A of C)</td></tr><tr><td>PCR primer voorwaarts, RP1</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAG TCCGA 3'</td></tr><tr><td>PCR primer achterwaarts, RPI1, streepjescode in vet</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 
ATCGTGATGTGACTGGAGTTCCT 
TGGCACCCGAGAATTCCA 3'</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Oligonucleotiden volgens Illumina TruSeq HT-Small RNA Sample Prep Kits, voor HiSeq2000/2500 en NextSeq500 sequencers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-rev3A (DNA/RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5'-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG 
CTCTTCCrGrAUrC-3'</td></tr><tr><td>HT-rev5A</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
CTTCCGATCTNNNN 3'</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, RT primer</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3'</td></tr><tr><td>PCR primers voorwaarts (D501-506)</td><td>Microsynth of Illumina</td><td></td><td>5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACA CGACGCTCTTCCGATCT -3'</td></tr><tr><td>PCR primers achterwaarts (D701-D712)</td><td>Microsynth of Illumina</td><td></td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCGATC-3'</td></tr><tr><td>Documentatie voor Illumina multiplexing:</td><td>Illumina</td><td></td><td>https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td></tr></tbody></table>

3' eind sequencing bibliotheek voorbereiding met a-seq2

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in de afgelopen tien jaar is gebleken een complex en dynamisch scala aan pre-mRNA decollete en polyadenylatie reacties. mRNAs met lang 3' onvertaald regio's (UTRs) worden gegenereerd in gedifferentieerde cellen overwegende dat delende cellen bij voorkeur express chat-kopieën met korte 3' UTRs. We beschrijven het A-seq-protocol, nu bij de tweede versie, die werd ontwikkeld om de kaart van de polyadenylatie sites genoom-brede en bestuderen van de verordening van pre-mRNA 3' eind verwerking. Ook maakt dit huidige protocol gebruik van de polyadenylate (poly(A)) staart die tijdens de biogenese van meest zoogdieren mRNAs te verrijken voor volledig verwerkte mRNAs worden toegevoegd. Een DNA-adapter met deoxyuracil op de vierde positie kan de precieze verwerking van mRNA 3' eind fragmenten voor het rangschikken. Exclusief de celcultuur en de nachtelijke ligations, het protocol vereist ongeveer 8 h hands-on tijd. Samen met het vindt u een easy-to-use softwarepakket voor de analyse van de afgeleide sequencing-gegevens. A-seq2 en de bijbehorende analysesoftware zorgen voor een efficiënte en betrouwbare oplossing voor de toewijzing van pre-mRNA 3' eindigt in een brede waaier van voorwaarden, van 106 of minder cellen.

Poly (A)-bevattende RNA werd geïsoleerd uit gekweekte cellen, gefragmenteerd door alkalische hydrolyse en cDNAs werden gemaakt door reverse transcriptie met oligo(dT) inleidingen. De resulterende cDNA werd geïmmobiliseerd op daar kralen, gekloofd dU was in de reactie van de specifieke excisie uracil, adapters werden afgebonden aan 5' en 3' einden van het fragment gekloofd en de inserts waren gesequentieerd. Figuur 1 toont een grafische schets van het experiment.
Voor HeLa en HEK293 cellen waren 106 cellen voldoende om het identificeren van de poly(A) sites voor de overgrote meerderheid van de eiwit-codeert genen aan het einde van de procedure. Echter, voor andere soorten cellen of weefsels die kan het nodig zijn om te testen de verzadiging in het aantal sites van de geïdentificeerde poly(A) als het aantal cellen die worden gebruikt in het experiment zijn verhoogt. Representatieve resultaten van de pilot PCR stap en van het fragment van DNA analyse van het monster vóór sequencing zijn afgebeeld in Figuur 2.
Figuur 3 toont de voorbewerkend stappen van de computationele analyse, vanaf het fastq bestand verkregen van de sequencer en eindigend met de kwaliteit-gecontroleerd, adapter-bijgesneden leest die zijn klaar om te worden toegewezen aan het genoom. Figuur 4 toont de stappen van de analyse die beginnen met de toewijzing van de luidt als volgt aan de overeenkomstige genoom en einde waarbij de catalogus met mRNA 3' eind verwerking van sites die worden geïdentificeerd in een bepaalde monster. Wanneer meerdere monsters worden geanalyseerd, worden extra stappen uitgevoerd overeenkomen met de 3'-eind verwerking van sites die werden gevonden in individuele monsters en rapporteren hun overvloed in verschillende steekproeven. Deze stappen zijn afgebeeld in Figuur 5.
Dus, zodra monsters hebben zijn sequenced, de analyse van de resulterende sequencing lezen van bestanden (in fastq formaat) via de beschikbare processing pipeline is eenvoudig. Na het toevoegen van de informatie over de monsters naar de configuratie vijl, de uitvoering van de pijpleiding zal resulteren in twee hoofdtypen van uitvoerbestanden: 1) BED-bestanden met alle 3' eindigen verwerking sites geïdentificeerd in afzonderlijke monsters (b.v. " sample1.3pSites.noIP.bed.gz"), en 2) een BED-bestand met alle poly(A) site clusters (clusters.merged.bed) over alle monsters van de studie. De uitvoer bevat tevens de genoom coördinaten voor alle leesbewerkingen van elk individuele monster (bijvoorbeeld "sample1. STAR_out/aligned.sortedByCoord.out.BAM") die later kunnen worden bekeken in de browser van een genoom zoals IGV16. Visueel onderzoek van het Lees Profiel(en) geeft in het algemeen een eerste glimp van de verdeling van de poly(A)-locaties in het genoom en de veranderingen die zich voordoen bij de specifieke verstoringen die in de studie werden uitgevoerd. Bijvoorbeeld in Figuur 6 is het antwoord van een specifiek gen op de knock-down van het eiwit HNRNPC weergegeven.
Samenvattingen van deze genoom-brede distributies zijn ook beschikbaar (tabel 1). Specifiek, output-bestanden in de directory "graven/annotation_overlap" bevatten breuken van sites die met de specifieke kenmerken van de geannoteerde overlappen (uit het gtf-bestand opgenomen als invoer; geannoteerde zijn: 3' UTR, terminal exon, exon, intron, intergenic). Tot slot, voor elk monster, resultaten van individuele verwerking stappen worden ook opgeslagen (bijvoorbeeld "sample1.summary.tsv"). Dit omvat de aantallen: rauwe leest in elk monster, luidt dat de verwachte structuur voor de 5'-eind hebben, leest die achterblijven na het instorten van de volledige PCR duplicaten, kwalitatief hoogwaardige leest volgens de criteria die bij stap 9.2, leest die kaart uniek aan het genoom (na instorten die het gevolg is van sequencing fouten, zie stap 9.5), multi toewijzing leest (na instorten die het gevolg is van sequencing fouten, zie stap 9.5), rauwe (niet-geclusterde) 3' eind verwerking van sites in elk monster, raw 3' uiteinde verwerking sites zonder potentiële interne priming kandidaten, unieke 3' eind verwerking sites van alle monsters zonder interne priming kandidaten en laatste set poly(A) site clusters.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
Figuur 1: voornaamste stappen van het protocol van de A-seq2. Afzonderlijke stappen worden aangegeven aan de linkerkant van de figuur. Invoegen RNA fragmenten worden afgeschilderd als groene lijnen die rood voor cDNA na omgekeerde transcriptie; adapters zijn gekleurd in licht blauw of oranje. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
Figuur 2: Pilot PCR en eindproduct profiel. (een) Aliquots van de PCR reactie werden verzameld bij verschillende cycli en gescheiden op 2% agarose gel. Getallen aan de linkerkant geven grootte in de nucleotiden van de respectieve bands in de DNA-ladder. In dit experiment werden 12 cycli (*) gekozen voor de grootschalige PCR reactie. (b) voorbeeld van een monster na grootte selectie uitgevoerd op een fragment grootte analyzer onthullen een gemiddelde grootte van ongeveer 280 nucleotiden. Nummers aan de linkerzijde [FU] geven relatieve signaalsterkte. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
Figuur 3: overzicht van de voorbehandeling van sequencing leest. De fastq bestanden met leest die worden gegenereerd door de sequencing instrument-geassocieerde software worden verwerkt om te identificeren van kwalitatief hoogwaardige leest dat wordt toegewezen aan het overeenkomstige genoom. De figuur toont de input/output-specificatie van de afzonderlijke stappen in de pijplijn, met koppelingen naar de afzonderlijke stappen van het protocol wordt beschreven in sectie "Data processing". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
Figuur 4: overzicht van sequentie Lees verwerking, vanaf de stap van de toewijzing aan het genoom aan de generatie van individuele 3' eind verwerking sites. De figuur toont de input/output-specificatie van de afzonderlijke stappen in de pijplijn, met links naar de ide stappen van de ndividual van het protocol wordt beschreven in sectie "Data processing". De belangrijkste output-bestand dat wordt geleverd aan de gebruiker is gemarkeerd in vet. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
Figuur 5: overzicht van de stappen die worden genomen voor het genereren van clusters van mede gereglementeerde 3' eind sites sequencing. De figuur toont de input/output-specificatie van de afzonderlijke stappen in de pijplijn, met koppelingen naar de afzonderlijke stappen van het protocol wordt beschreven in sectie "Data processing". De belangrijkste output bestand is gemarkeerd in vet. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
Figuur 6: voorbeeld van de resultaten van het profiel van 3' eind verwerking leest langs de terminal exon van het NUP214 gen, getoond in de IGV 16 genome browser. A-seq2 leest waren bereid uit twee monsters van HEK 293 cellen, behandeld met een controle-siRNA of met een HNRNPC siRNA. Het luidt dat gedocumenteerd poly(A) sites die werden geannoteerd door middel van de analyse-pijpleidingen werden opgeslagen in BAM-indeling die werd gebruikt als invoer voor de IGV genome browser. De 3' einden van de Lees pieken toewijzen aan mRNA 3' einden die zijn geannoteerd in Ensembl. De profielen geven een intensiever gebruik van de lange 3' UTR isovorm op HNRNPC knock-down. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>si-Control repliceren 1</td>
			<td>si-Control repliceren 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>id: 29765</td>
			<td>id: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aantal ruwe leest</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aantal geldige leest na trimmen en filteren</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aantal unieke mapping leest</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aantal leest toewijzen aan meerdere loci</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aantal individuele 3' eindigen verwerking sites</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: voorbeeld van de uitvoer van de analyse-pijpleiding. Samenvattingen van leest die zijn verkregen bij afzonderlijke stappen.

Dit protocol beschrijft een methode voor de toewijzing pre-mRNA 3' eind verwerking van sites.

3' eind Sequencing bibliotheek voorbereiding met A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Het algemene doel van deze methode is het vastleggen en sequensen van de 3'-uiteinden van mRNA, waardoor studies naar mRNA-verwerking, in het bijzonder 3'-uiteindsplitsing en polyadenylering, evenals de kwantificering van genexpressie mogelijk worden. Het A-seq2-protocol en het gepresenteerde pakket voor data-analyse kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de generatie en functie van transcript-isoformen in verschillende celtypen en weefsels. De belangrijkste voordelen van de A-seq2-methode zijn dat het sequensen door lange poly(A)-strekkingen vermijdt en dat er geen adapterdimeren worden gegenereerd.Voor deze procedure worden cellen gebruikt die zijn uitgegroeid tot 80% confluentie. Verwijder het groeimedium en was de cellen eenmaal met PBS. Lyseer de cellen direct op de plaat door één milliliter lysisbuffer per putje toe te voegen en een rubberen spatel te gebruiken om het celmateriaal volledig van het platoppervlak los te maken.Gebruik een pipetpunt van één milliliter om het viskeuze lysaat uit elke put over te brengen naar een plastic buis van 15 milliliter. Meng het DNA met een spuit van één milliliter voorzien van een hypodermische naald van 23 gauge. Voer meerdere krachtige op-en-neergaande bewegingen met de zuiger uit, totdat het lysaat niet langer viskeus is.Breng het lysaat over in een buis van 1,5 milliliter. Centrifugeer bij 20 000 ×g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten om het debris te verwijderen. Verzamel de heldere supernatant van het lysaat.Voeg oligo d(T)25 magnetische kralen toe en resuspendeer het mengsel. Plaats de buisjes gedurende 10 minuten op een rotatiewiel. Plaats de buisjes vervolgens gedurende twee minuten op een magnetisch rek.Verwijder de heldere vloeistof. Voeg 0,8 milliliters buffer A toe aan elke buis en draai de buis twee tot drie keer 180 graden. Verwijder buffer A na de tweede wasstap.Voeg 0,8 milliliter buffer B toe aan elke buis en laat deze twee minuten in het rek staan. Om het gebonden mRNA van de beads te elueren, verwijdert u buffer B, voegt u 33 microliter water toe aan elke buis en resuspendeert u de beads. Verwarm gedurende vijf minuten op 75 graden Celsius op een verwarmingsblok.Centrifuge de buisjes onmiddellijk één seconde en plaats ze op het magnetische rek. Overbreng het supernatant naar een nieuwe buis. Voeg 66 µL alkalische hydrolysebuffer toe aan elke buis, meng en verhit gedurende precies vijf minuten op 95 °C op een warmteblok.Koel de buisjes onmiddellijk op ijs. Voer vervolgens RNA-isolatie uit met behulp van een RNA-opreinigingskit, zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg om met deze procedure te beginnen 14 µL van een polynucleotidekinase Master Mix toe aan elk RNA-monster.Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Laad na 30 minuten de kinasereacties op voorbereide spinzuilen. Centrifugeer de zuilen twee minuten bij 735 ×g.Gooi de kolommen weg en plaats de buisjes met de verzamelde reacties op ijs. Om de drie 3'-uiteinden van de RNA-fragmenten te blokkeren en concatemerisatie in daaropvolgende ligatiereacties te voorkomen, voegt u aan elk monster 17,5 µL van een poly(A)polymerase Master Mix toe. Meng en centrifugeer gedurende één seconde.Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Voeg na 30 minuten 32,5 µL water toe aan elke reactie en zuiver het RNA, zoals beschreven in het tekstprotocol. Start deze procedure door de reacties gedurende 10 minuten in een vacuümconcentrator te plaatsen om het volume te reduceren tot 6 µL.Voeg vervolgens aan elke reactie 24 µL van een RNA ligase Master Mix toe. Incubeer de reacties op een verwarmde mixer bij 24 °C gedurende 16 uur, met periodiek mengen bij 1000 RPM. Voeg de volgende dag aan elke reactie 17 µL water toe en meng.Purificeer het RNA, zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de eluenten gedurende drie minuten in een vacuümconcentrator om het volume te reduceren tot 11 µL. Breng de reacties over naar 200 µL PCR-buisjes voor de reverse transcriptie-reactie.Voeg één µL primer toe. Verhit gedurende vijf minuten bij 70 °C in een PCR-cycler en laat het vervolgens vijf minuten op kamertemperatuur staan. Voeg acht µL reverse transcription Master Mix toe aan elke buis en meng.Plaats de buisjes in een PCR-cycler. Verhit gedurende 10 minuten op 55 °C en vervolgens nogmaals 10 minuten op 80 °C. Bewaar op ijs.Bereid streptavidinekralen voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg de reverse transcriptie-reactie toe aan de kraaloplossing en incubeer deze 20 minuten bij vier graden Celsius op een rotatiewiel. Was de kralen met behulp van een magnetisch rek twee keer met biotinbindingbuffer en twee keer met TEN-buffer.Resuspendeer de beads in 50 µL TEN-buffer. Voeg twee µL uracil-DNA-glycosylase enzymmix toe en incubeer gedurende één uur bij 37 °C in een mixer, met tussentijdse menging. Voeg aan elke reactie 50 µL water, 11 µL RNase H-buffer en één µL RNase H toe.Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C. Plaats de buisjes in het magnetische rek en breng de vloeistof met het geknipte cDNA over naar een nieuw buisje. Zuiver het geknipte cDNA met een PCR-zuiveringskit, zoals beschreven in het tekstprotocol.Plaats het gezuiverde cDNA acht minuten in een vacuümconcentrator om dit te concentreren tot een volume van 7 µL. Om 5'-adapters aan de 5'-uiteinden van het geïsoleerde cDNA te ligeren, voegt u aan elk monster 23 µL van een RNA-ligase Master Mix toe en incubeert u dit 20 uur bij 24 °C. Voeg ten slotte aan elke reactie 70 µL water toe.Er wordt een pilot PCR uitgevoerd om het optimale aantal PCR-cycli te bepalen om library-amplificatie te bereiken binnen de exponentiële fase. Pipetteer het volgende in een PCR-buisje van 200 µL: 25 µL DNA-polymerasemix, 20 µL ligatiereactie, 2 µL water, 1,5 µL forward PCR-primer en 1,5 µL reverse PCR-indexprimer. Start de thermocycler met het volgende programma: drie minuten bij 95 °C, gevolgd door 20 cycli van 20 seconden bij 98 °C, 20 seconden bij 67 °C en 30 seconden bij 72 °C.Neem direct uit de thermocycler aliquots van zeven µL af na de aangegeven cycli. Scheid de producten op een 2% agarosegel en visualiseer de migratie van de PCR-producten. Bepaal het aantal cycli aan het begin van de exponentiële amplificatie, in dit voorbeeld 12 cycli, en gebruik dit aantal cycli voor een grootschalige PCR-reactie.Scheid de producten van de PCR-reactie op grote schaal op een 2% agarosegel en snijd de gelplakjes uit die DNA-producten van 200 tot 350 nucleotiden bevatten. Extraheer vervolgens het DNA uit de gelplakjes met de gel-extractiekit, zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze video worden alleen de belangrijkste computationele stappen getoond.Meer details zijn beschikbaar in het tekstprotocol. Begin met het klonen van de Git-repository en ga naar de nieuw aangemaakte directory. Maak een omgeving aan die de software bevat en activeer deze omgeving.Download de genoomsequentie van het organisme waarvan de A-seq2-gegevens zijn verkregen. Open het configuratiebestand en stel de invoerparameters in, zoals aangegeven in het tekstprotocol. Start de analyse.De respons van een specifiek gen, NUP214, op de knockdown van het HNRNPC-eiwit werd onderzocht door a-seq2-reads te analyseren van twee monsters HEK-293-cellen, behandeld met respectievelijk een controle-small interfering RNA of een HNRNPC-small interfering RNA. De reads die poly(A)-sites documenteerden die door de analysepipeline waren geannoteerd, werden opgeslagen in BAM-formaat, wat werd gebruikt als input voor de IGD-genoombrowser. De 3'-uiteinden van de read-pieken werden gemapt op mMRNA 3'-uiteinden die zijn geannoteerd in ensemble.De profielen wijzen op een verhoogd gebruik van de lange 3'-UTR-isovorm na HNRNCR-knockdown. Eenmaal beheerst, vereist het A-seq-protocol acht uur aan actieve werktijd of ongeveer twee tot drie dagen, exclusief de tijd voor de celkweek en de overnight-ligaties. Bij het uitvoeren van het protocol is het belangrijk om eerst een primer-set te ontwerpen die compatibel is met het sequencingsplatform dat op uw locatie wordt gebruikt.Zodra u de 3'-uiteinden van het mRNA heeft verkregen, kunnen andere methoden, zoals cross-linking en immunoprecipitatie, worden uitgevoerd om regulatoren van de 3'-uiteindverwerking van pre-mRNA te identificeren. A-seq2 heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van RNA-verwerking om de regulatie en de gevolgen van alternatieve polyadenylering in individuele celtypen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u bibliotheken van mRNA 3'-uiteinden genereert, uw sequensgegevens analyseert, nieuwe poly(A)-sites identificeert en het gebruik ervan kwantificeert.We hopen dat A-seq2 uw werk bij het bestuderen van de regulatie van mRNA-processing zal vergemakkelijken en zal leiden tot vele nieuwe inzichten.

3-end-sequencing-library-preparation-with-a-seq2

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een methode voor de bereiding van zowel de single lezen en gekoppeld end Illumina mRNA-Seq sequencing bibliotheken voor genexpressie analyse op basis van T7-RNA lineaire versterking. Dit protocol vereist slechts 10 nanogram van het starten van totaal RNA en genereert een uiterst consistente bibliotheken vertegenwoordigt hele transcripten.

Single Lees en Gepaarde End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken van 10 nanogram Totaal RNA

Het karakteriseren van microbiële gemeenschappen is een al lang bestaand doel in de milieumicrobiologie. Methoden voor next-generation sequencing maken nu de karakterisering van microbiële gemeenschappen mogelijk op een ongekende diepte met minimale kosten en arbeid. We beschrijven hier onze aanpak om bacteriële 16S ribosomale RNA-genen te sequencen met behulp van een tafelsequencer.

Next-generation sequencing van het 16S ribosomaal RNA Gene Amplicons

Er wordt een geïntegreerd systeem beschreven voor gerichte next-generation sequencing van oncologische monsters. Dit cross-platform systeem is geoptimaliseerd voor tumorbiopsies van lage kwaliteit en lage hoeveelheid, past zich aan lage DNA-inputs aan, omvat goed gekarakteriseerde multi-variant controles en beschikt over een nieuwe variant caller die wordt geïnformeerd door kwantitatieve pre-analytische kwaliteitscontrolemaatregelen.

Integratie van Nat en droog Bench Processen Optimaliseert Gerichte next-generation sequencing van lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumorbiopten

Gel-seq kan onderzoekers gelijktijdig bereiden bibliotheken voor beide DNA - en RNA-seq op de te verwaarlozen extra kosten vanaf 100-1000 cellen met behulp van een eenvoudige hydrogel-apparaat. Dit document stelt een gedetailleerde aanpak voor de fabricage van zowel het apparaat als het biologische protocol voor het genereren van gepaarde bibliotheken.

Gel-seq: Een methode voor de voorbereiding van de bibliotheek van de gelijktijdige Sequencing van DNA en RNA met Hydrogel Matrices

Volgende-generatie rangschikken (NGS) is een krachtig hulpmiddel voor genomische karakterisering die wordt beperkt door het hoge foutenpercentage van het platform (~0.5–2.0%). Wij beschrijven onze methoden van fout-gecorrigeerde sequentie die ons toelaten te ondervangen van het NGS foutenpercentage en mutaties op variant allel breuken zo zeldzaam als 0,0001 detecteren.

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

De identificatie van de fysieke interacties tussen genen en regelgevende elementen is uitdagend maar heeft bevorderd door chromosoom conformatie opname methoden. Deze wijziging van het 4C-seq-protocol PCR bias vermindert door het minimaliseren van de over-amplificatie van PCR sjablonen en maximaliseert de mappability van leest door het opnemen van een toevoeging restrictie-enzym digest stap.

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

Deze methode beschrijft de stappen om de kwaliteit en kwantiteit van sequentiegegevens te verbeteren die kunnen worden verkregen uit formeel vaste paraffine-embedded (FFPE) RNA-monsters. We beschrijven de methodologie om de kwaliteit van FFPE-RNA-monsters nauwkeuriger te beoordelen, sequencingbibliotheken voor te bereiden en de gegevens van FFPE-RNA-monsters te analyseren.

Optimalisatie voor sequencing en analyse van gedegradeerde FFPE-RNA Samples

Dit protocol biedt een eenvoudig te volgen workflow voor het uitvoeren van poly(A) RNA-zuivering, bisulfietconversie en bibliotheekvoorbereiding met behulp van gestandaardiseerde apparatuur voor een biologisch monster van belang.

Verrijking van mRNA en bisulfiet-mRNA-bibliotheekvoorbereiding voor sequencing van de volgende generatie

Dit artikel presenteert een protocol voor het uitvoeren van uitgebreide ruimtelijke transcriptomische profilering van gastheer-, viraal-, schimmel- en microbioom-RNA uit formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties met behulp van Stereo-seq, waarmee verschillende transcriptomen met hoge resolutie in kaart kunnen worden gebracht met behoud van weefselarchitectuur.

Uitgebreide ruimtelijke profilering van soortagnostische transcriptomen via stereo-seq

Bouw van een fosmid bibliotheek met milieu-genomisch DNA geïsoleerd uit de verticale diepte continuüm van een seizoensgebonden hypoxische fjord is beschreven. De resulterende kloon bibliotheek is geplukt in de 384-wells platen en gearchiveerd voor downstream-sequencing en functionele screening door de toepassing van een geautomatiseerd kolonie picking systeem.

Grote Plaats Milieu Genomic Library Production

Leer de A-seq2 methode voor het in kaart brengen van mRNA 3'-einden en polyadenylering. Dit protocol helpt onderzoekers bij het kwantificeren van genexpressie en transcript isoformen.

3' eind Sequencing bibliotheek voorbereiding met A-seq2

Meer video's verkennen