3' eind Sequencing bibliotheek voorbereiding met A-seq2

Het algemene doel van deze methode is om mRNA drie-primaire uiteinden vast te leggen en te sequencen, waardoor studies van mRNA-verwerking mogelijk worden, met name drie-primaire uiteinde splitsing en polyadenylering, evenals de kwantificering van genexpressie. Het A-seq2-protocol en de gegevensanalysepakket die hier worden gepresenteerd, kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de generatie en functie van transcript-isovormen in verschillende celtypen en weefsels. De belangrijkste voordelen van de A-seq2-methode zijn dat deze sequencing door lange poly(A)-strekken vermijdt en dat er geen adapter-dimeren worden gegenereerd.

Cellen die tot 80% confluency worden gekweekt, worden gebruikt voor deze procedure. Verwijder het groeimedium en was de cellen eenmaal met PBS. Lyseer de cellen direct op de plaat door per put een milliliter lyseringsbuffer toe te voegen en een rubberen spatel te gebruiken om het celmateriaal volledig los te maken van het plaatoppervlak.

Gebruik een pipettip van één milliliter om het viskeuze lysate van elke put over te brengen in een 15 milliliter plastic buis. Deel het DNA met een eenmillilitersprijs gemonteerd op een 23 gauge hypodermische naald. Voer verschillende krachtige op en neer bewegingen van de plunjer uit, totdat het lysate niet meer viskeus is.

Breng het lysate over in een 1,5 milliliter buis. Draai bij 20.000 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten, om het puin te verwijderen. Verzamel het heldere supernatant van het lysate.

Voeg toe aan oligo d (T) 25 magnetische kralen en resuspendeer het mengsel. Plaats de buizen op een roterend wiel gedurende 10 minuten. Plaats vervolgens de buizen gedurende twee minuten op een magnetische rek.

Verwijder de heldere vloeistof. Voeg 0,8 milliliter buffer A toe aan elke buis en draai de buis 180 graden twee tot drie keer. Verwijder buffer A van de tweede wasbeurt.

Voeg 0,8 milliliter buffer B toe aan elke buis en laat het twee minuten op de rek. Om het gebonden mRNA van de kralen te elueren, verwijder buffer B, voeg 33 microliter water toe aan elke buis en resuspendeer de kralen. Verwarm gedurende vijf minuten tot 75 graden Celsius op een verwarmd blok.

Spin onmiddellijk de buizen gedurende één seconde en plaats ze op de magnetische rek. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis. Voeg 66 microliter alkalische hydrolysebuffer toe aan elke buis, meng en verwarm gedurende exact vijf minuten tot 95 graden Celsius op een verwarmde blok.

Chill onmiddellijk de buizen op ijs. Vervolgens, voer RNA-isolatie uit met behulp van een RNA-opruimingskit, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om deze procedure te starten, voegt u aan elk RNA-monster 14 microliter van een polynucleotidekinase Master Mix toe.

Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Na 30 minuten, laadt u de kinasereacties op voorbereide spinkolommen. Draai de kolommen bij 735 keer g gedurende twee minuten.

Gooi de kolommen weg en plaats de buizen met verzamelde reacties op ijs. Om de drie-primaire uiteinden van RNA-fragmenten te blokkeren om hun concatemerisatie in volgende ligatiereacties te voorkomen, voegt u aan elk monster 17,5 microliter van een poly(A)polymerase Master Mix toe. Meng en draai gedurende één seconde.

Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Na 30 minuten, voegt u 32,5 microliter water toe aan elke reactie en zuivert u het RNA, zoals beschreven in het tekstprotocol. Begin deze procedure door de reacties gedurende 10 minuten in een vacuümconcentrator te plaatsen, om het volume te verminderen tot zes microliter.

Voeg vervolgens aan elke reactie 24 microliter van een RNA-ligase Master Mix toe. Incubeer de reacties op een verwarmde mixer bij 24 graden Celsius gedurende 16 uur, met intermitterende menging bij duizend RPM. Voeg op de volgende dag 17 microliter water toe aan elke reactie en meng.

Zuiver het RNA, zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de eluites gedurende drie minuten in een vacuümconcentrator, om het volume te verminderen tot 11 microliter. Breng de reacties over naar 200 microliter PCR-buizen voor de omgekeerde transcriptiereactie.

Voeg één microliter primer toe. Verwarm gedurende vijf minuten bij 70 graden Celsius in een PCR-cycler en laat vervolgens vijf minuten op kamertemperatuur staan. Voeg acht microliter van een omgekeerde transcriptie Master Mix toe aan elke buis en meng.

Plaats de buizen in een PCR-cycler. Verwarm gedurende 10 minuten tot 55 graden Celsius en gedurende nog eens 10 minuten tot 80 graden Celsius. Houd op ijs.

Bereid streptavidinekralen voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg de omgekeerde transcriptiereactie toe aan de kralenoplossing en incubeer gedurende 20 minuten op een roterend wiel bij vier graden Celsius. Gebruik een magnetische rek om de kralen twee keer te wassen met biotinebindingsbuffer en twee keer met TEN-buffer.

Resuspendeer de kralen in 50 microliter TEN-buffer. Voeg twee microliter uracil DNA glycosylase enzymmix toe en incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius in een mixer, met intermitterende menging. Voeg 50 microliter water, 11 microliter RNase H-buffer en één microliter Rnase H toe aan elke reactie.

Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius. Plaats de buizen op de magnetische rek en breng het vocht dat het gekliefde cDNA bevat over naar een nieuwe buis. Zuiver het gekliefde cDNA met behulp van een PCR-zuiveringskit, zoals beschreven in het tekstprotocol.

Plaats het gezuiverde cDNA gedurende acht minuten in een vacuümconcentrator om het te concentreren tot een volume van zeven microliter. Om vijf-primaire adapters aan de vijf-primaire uiteinden van het geïsoleerde cDNA te liggen, voegt u aan elk monster 23 microliter van een RNA-ligase Master Mix toe en incubeert u gedurende 20 uur bij 24 graden Celsius. Voeg ten slotte 70 microliter water toe aan elke reactie.

Een piloot-PCR wordt uitgevoerd om