Evaluatie van vasculaire controlemechanismen met behulp van videomicroscopie van geïsoleerde resistentie slagaders van ratten
December 5th, 2017
Dit manuscript wordt beschreven in vitro videomicroscopie protocollen voor de beoordeling van de vasculaire functie in rat weerstand van de cerebrale bloedvaten. Het manuscript wordt ook beschreven technieken voor het evalueren van microvessel dichtheid met fluorescently geëtiketteerde lectine en weefsel perfusie met behulp van Laser Doppler flowmetrie.
Het algemene doel van deze procedure is om geïsoleerde weerstandsslagaders te gebruiken om de reactiviteit van bloedvaten op vasoactieve stimuli te testen. Het zal ook laten zien hoe veranderingen in gladde spiercontrolemechanismen en passieve mechanische eigenschappen kunnen worden beoordeeld. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van vasculaire biologie te beantwoorden met betrekking tot endotheel- en vasculaire gladde spiercontrolemechanismen in kleine weerstandsslagaders onder verschillende omstandigheden.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat kleine weerstandsslagaders kunnen worden geïsoleerd van de parenchymcellen-omgeving en op hun normale druk kunnen worden gehouden terwijl reacties op vasoactieve stimuli worden getest. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar therapie en diagnose van vasculaire disfunctie. Dit type manipulatie is niet mogelijk in vivo.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in perifere vaatziekten, kan deze ook worden toegepast op coronaire hartziekten. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, aangezien de microcannulatiestappen moeilijk te leren zijn vanwege de delicaatheid van de procedure en de noodzaak om schade aan de ader te voorkomen. Bereid op de dag van het experiment twee liter fysiologische zoutoplossing voor in een tweeduizend milliliter Erlenmeyer-kolf.
Wanneer u de 20X-bufferoplossing toevoegt, zorg ervoor dat de oplossing continu in evenwicht is met het gasmengsel en roer het met een magnetische roerbar. Bekijk vervolgens de pH terwijl u 0,28 gram mononatriumfosfaat aan het mengsel toevoegt. Pas eventueel de pH aan door druppels van zes normale zoutzuur of 6,5 normale natriumhydroxide-oplossing uit een Pasteur-pipet toe te voegen zodat de pH op 7,4 blijft.
Voeg vervolgens 1,98 gram glucose toe aan de fysiologische zoutoplossing. Bereid vervolgens 500 milliliter van een calciumvrije fysiologische zoutoplossing door de 20X-stamoplossing te verdunnen in gedeïoniseerd water. Voeg vervolgens 25 milliliter van de 20X-bufferoplossing toe in een Erlenmeyer-kolf en voeg 0,07 gram mononatriumfosfaat toe aan de oplossing terwijl u de pH van de oplossing in de gaten houdt en aanpast.
Gebruik tetrafluorethyleenbuis om een gastank met het juiste gasmengsel te verbinden met de orgaanbad. Laat het oplossing continu borrelen met een snelheid die voldoende is om een continue, maar niet turbulente, borrelende stroom van de oplossing die in de vaatkamer stroomt te garanderen. Plaats ook een kleine luchtsteen verbonden aan het evenwichtsgasmengsel in de vaatkamer om de gassamenstelling van de fysiologische zoutoplossing te helpen handhaven.
Plaats de fysiologische zoutoplossing in een tweeduizendmilliliter Mariotte-fles. Voeg een centrale glazen buis toe aan een stop om als reservoir te dienen dat de fysiologische zoutoplossing continu in het farmacologische orgaanbad levert dat de oplossing naar de vaatkamer levert. Plaats de opening van de centrale glazen buis in de Mariotte-fles op hetzelfde niveau als de bovenkant van de fysiologische zoutoplossing in het orgaanbad.
Dit zorgt voor een constante hydrostatische drukhoogte voor de levering van de fysiologische zoutoplossing in het orgaanbad. Gebruik een polyethyleenbuis verbonden met een J-vormige glazen buis om de fysiologische zoutoplossing van de Mariotte-fles naar het orgaanbad te leveren. Gebruik voor lumenale profusie polyethyleenbuis om de instroompijp te verbinden met een fysiologische zoutreservoir bestaande uit een 66-CC plastic spuit verhoogd tot een positie die de gewenste instroomdruk handhaaft.
Bewaak de druk door een druktransducer aan het systeem te verbinden via een stopcock. Verbind vervolgens de uitstroompijp naar een polyethyleenbuis naar een reservoir vergelijkbaar met het instroomreservoir om de fysiologische zoutoplossing door het vat te laten stromen als reactie op een drukgradiënt. Gebruik ook een vergelijkbare stopcock en druktransducerverbinding om de uitstroomdruk te bewaken.
Verwijder de hersenen van een Sprague Dawley-rat en plaats deze in de rugligging in een glazen petrischaal gevuld met ijskou fysiologische zoutoplossing. Plaats vervolgens de schaal onder een stereoscoop. Gebruik een paar Vannas-schaar en een Dumont nummer vijf fijne pincet om de middelste hersenslagaders uit de hersenen te verwijderen.
Reinig vervolgens eventueel resterend hersenweefsel van de middelste hersenslagader met behulp van het pincet. Breng de slagader over naar de vaatkamer door het voorzichtig aan het uiteinde van het verwijderde segment vast te houden en voorzichtig in de kamer te plaatsen. Draad vervolgens de hersenslagader op de instroommicropipet door het naar de basis van de pijp te trekken totdat de punt in het lumen van de ader komt.
Beveilig de slagader op de instroompijp door een lus te binden die is voorbereid van een enkele streng vezel die eerder is voorbereid van 10-0-draad rond de ader. Bevestig vervolgens het andere uiteinde van de middelste hersenslagader aan de uitstroompijp door een tweede draadlus rond het vat te strikken en gebruik de micrometer verbonden aan de instroompijphouder om de ader uit te rekken tot zijn in situ-lengte. Bind alle zijtakken af met enkele strengen die zijn voorbereid van 10-0-draad om een constante druk in de ader te handhaven.
Richt vervolgens een videomicroscoop in die bestaat uit een videocamera die is bevestigd aan een dissectiescoop die is verbonden met een videomicrometer en een televisiemonitor. Gebruik deze opstelling om de interne diameter van de ader te meten. Beoordeel de myogene toon en vaatreacties op vaatverwijdende stimuli door ervoor te zorgen dat de ader een geschikt niveau van actieve toon vertoont voorafgaand aan het experiment.
Gooi eventuele aders weg die geen actieve toon in rust vertonen, met uitzondering van vaten zoals kleine mesenteriële aders die normaal gesproken geen actieve rusttoon vertonen. Voeg vervolgens toenemende concentraties acetylcholine toe aan de vaatkamer en meet de vaatdiameters om de endotheelafhankelijke reactiviteit van de gecanuleerde weerstandsslagader te testen. In dit voorbeeld vertoont de ader endotheeldisfunctie zoals aangetoond door het falen
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit manuscript presenteert in vitro videomicroscopie protocollen voor het beoordelen van vasculaire functie in cerebrale weerstandsarteries van ratten. Het beschrijft ook technieken voor het evalueren van microvatdichtheid en weefselperfusie.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Vasculaire biologie
- Microvasculaire functie
- Endotheel en gladde spier controlemechanismen
Achtergrond
- Weerstandsarteries spelen een cruciale rol bij het reguleren van de bloedstroom.
- Het begrijpen van de reactiviteit van bloedvaten op vasoactieve stimuli is essentieel voor vaatonderzoek.
- Geïsoleerde slagaders kunnen inzichten geven in vasculaire functie zonder in vivo complicaties.
- Deze studie heeft tot doel de kennis van vasculaire disfunctie en de implicaties ervan voor therapie te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om de reactiviteit van bloedvaten in geïsoleerde weerstandsarteries te evalueren.
- Om veranderingen in gladde spier controlemechanismen te beoordelen.
- Om passieve mechanische eigenschappen van kleine weerstandsarteries te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- In vitro videomicroscopie protocollen.
- Fluorescentie gelabelde lectin voor evaluatie van microvatdichtheid.
- Laser Doppler Flowmetrie voor het beoordelen van weefselperfusie.
- Isolatie van weerstandsarteries om normale druk tijdens testen te handhaven.
Belangrijkste Resultaten
- Demonstreerde het vermogen om weerstandsarteries uit hun omgeving te isoleren.
- Toonde hoe reacties op vasoactieve stimuli effectief kunnen worden getest.
- Gaf inzichten in interacties tussen endotheel en vasculaire gladde spieren.
- Benadrukte de implicaties voor het diagnosticeren van vasculaire disfunctie.
Conclusies
- Deze techniek maakt een gedetailleerde studie van vasculaire functie in een gecontroleerde omgeving mogelijk.
- Het kan leiden tot vorderingen in het begrijpen van vaatziekten.
- De bevindingen kunnen therapeutische benaderingen voor vasculaire disfunctie informeren.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of vascular targets by isolating resistance arteries from confounding parenchymal influences, providing predictive confidence in endothelial and smooth muscle control mechanisms. It supports target validation in preclinical models by maintaining physiological pressure and allowing direct assessment of vasoactive responses. The approach bridges molecular reductionist findings with integrative vascular physiology, enhancing translational relevance for cardiovascular drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing endothelial-dependent and independent vasodilator pathways in isolated resistance arteries.
- Operational Value: Enables functional target validation by assessing changes in smooth muscle control mechanisms and passive mechanical properties under controlled conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying vascular phenotypes linked to specific genetic backgrounds, such as Renan allele regulation in salt-sensitive hypertension models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline vascular tone and reactivity profiles.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through pressure-controlled perfusion and video microscopy-based diameter measurements.
- Scalability: Highlights platform reuse across vascular beds and genetically engineered rat strains for consistent compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Discusses application to peripheral and coronary artery disease models through evaluation of endothelial dysfunction in genetically defined rat strains.
- Translational Continuity: Describes continuity from discovery through preclinical validation by using techniques applicable to both isolated vessels and in vivo perfusion assessments via Laser Doppler Flowmetry.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by distinguishing endothelial dysfunction from structural remodeling via calcium-free solution-induced maximal dilation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, supporting mechanistic insight before compound screening in vascular biology programs.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing of endothelial and vascular smooth muscle control mechanisms in small-resistance arteries under various conditions.
- Screening: Describes assay readiness through reproducible isolation and cannulation techniques that maintain arterial integrity for consistent vasoactive stimulus testing.
- Analytics: Highlights quantitative dependent variable measurements (internal diameter changes via video microscopy) that enable comparison of vasodilator and vasoconstrictor responses.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through parallel use of Laser Doppler Flowmetry for tissue perfusion and fluorescent lectin labeling for microvessel density in related vascular studies.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability across vascular beds and rat strains, reducing redundant model development in cardiovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in vascular control pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of isolated artery preparations for consistent pharmacological profiling.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by confirming target engagement in physiologically relevant ex vivo models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on confirmed endothelial function and smooth muscle responsiveness in disease-relevant genetic models.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in microvascular dissection, cannulation techniques, and video microscopy operation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including pressure-regulated perfusion systems, video microscopes with micrometers, and pressure transducers.
- Cross-team standardization requirements for arterial isolation, suture ligation, and pressure maintenance protocols across laboratories.
- Adaptation considerations across model systems, including adjustment of perfusion pressures and solution compositions for different vascular beds and species.
- Practical limitations supported by source material: delicate microcannulation steps require significant training to avoid endothelial or smooth muscle damage, and arteries lacking active resting tone (e.g., small mesenteric arteries) may be excluded from tone-dependent analyses.
