Monster extractie en gelijktijdige chromatografische kwantificatie van Doxorubicine en mitomycine C na Drug Delivery van de combinatie in nanopartikels met Tumor-dragende muizen
October 5th, 2017
Dit protocol beschrijft een efficiënte en handige analytische proces van extractie van het monster en gelijktijdige bepaling van meerdere drugs, Doxorubicine (DOX), mitomycine C (MMC) en een cardio-toxisch DOX metaboliet, doxorubicinol (DOXol), in de biologische monsters uit een preklinische borst tumor model behandeld met nanoparticle formuleringen van synergetische drug combinatie.
Het algemene doel van dit analytisch protocol is om tegelijkertijd de twee anti-kankergeneesmiddelen Doxorubicine en Mitomycine C, die worden getransporteerd door polymeer-lipide hybride nanodeeltjes, en de metaboliet van Doxorubicine, Doxorubicinol, in biologische matrices te extraheren en te kwantificeren met behulp van een eenvoudige en robuuste reverse phase hogedrukvloeistofchromatografie methode. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van nanogeneeskunde te beantwoorden, zoals hoe een effectief nanocarriersysteem te ontwerpen op basis van de nanofarmacokinetiek van geneesmiddelcombinaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om tegelijkertijd drie geneesmiddelverbindingen in dezelfde biologische matrix te kwantificeren, zonder dat de mobiele fase van HPLC hoeft te worden gewijzigd.
Deze methode kan dus inzicht bieden in de biologische gedragingen van Doxorubicine, Mitomycine C en Doxorubicinol in primaire borsttumoren. Het kan ook worden toegepast op andere kankersoorten die met vergelijkbare geneesmiddelen worden behandeld. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat efficiënte stapsgewijze voorbereidingsstappen moeilijk te leren zijn.
Om met deze procedure te beginnen, verzamel en bevries het gehele bloed, de belangrijkste organen en de borsttumor zoals beschreven in het tekstprotocol. Weeg snel de bevroren weefsels en noteer het gewicht in het laboratorium notitieboekje. Breng ze vervolgens over in een ronde bodemconische buis van 13 milliliter.
Voeg vervolgens tussen één en vijf milliliter ijskoud cellysebuffer toe. Homogeniseer het weefsel met behulp van een elektrische handhomogenisator met een op- en neergaande beweging op ijs bij 18.000 tpm. Was daarna de 10 millimeter gezaagde tandgeneratorsonde van de homogenisator met gedestilleerd gedeïoniseerd water.
Was de sonde met 70%ethanol en vervolgens opnieuw met gedestilleerd gedeïoniseerd water. Breng 50 microliter weefselmembraan of geheel bloed over naar een 1,5 milliliter polypropyleen microcentrifugebuis. Spike vervolgens met vijf microliter van een interne standaard van 2.000 nanogram per milliliter 4-MethylUmbelliferone.
Voeg een ijskoud extractiemiddel toe dat 150 microliter acetonitril en 100 microliter vijf millimolair ammoniumacetaat bevat. Vortex het mengsel krachtig gedurende twee minuten. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 3.000 g en vier graden Celsius.
Transfer vervolgens 200 microliter van de supernatant naar een nieuwe, voorgekoelde microcentrifugebuis. Gebruik een trage stroom stikstofgas om het supernatant bij 60 graden Celsius te verdampen met bescherming tegen licht. Herstel vervolgens het droge residu met 100 microliter ijskoud methanol.
Vortex krachtig gedurende 30 seconden. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 3.000 g en vier graden Celsius. Breng vervolgens het supernatant over in een HPLC-vijlinsert.
Plaats de monsterbuisjes in een autosamplerbakje voor injectie. Bereid om te beginnen de HPLC-mobiele fase zoals beschreven in het tekstprotocol. Stel de initiële omstandigheden van de samenstelling van de mobiele fase in op 16,5% H2O en 83,5% acetonitril.
Stel de Isocratische stroomsnelheid in op 1,0 milliliter per minuut. Scheid vervolgens de geneesmiddelen met behulp van de in het tekstprotocol beschreven gradiëntmobiele faseconditie. Stel vervolgens de UV-detector in op twee kanalen: een op 310 nanometer voor interne standaard 4-MethylUmbelliferone en de andere op 360 nanometer voor Mitomycine C. Stel vervolgens het eerste kanaal van de fluorescentiedetector in op een excitatiegolflengte van 365 nanometer en een emissiegolflengte van 445 nanometer voor 4-MethylUmbelliferone.
Stel het tweede kanaal in op een excitatiegolflengte van 480 nanometer en een emissiegolflengte van 560 nanometer voor Doxorubicine en Doxorubicinol. Gebruik om te beginnen de autosampler om 15 microliter van het monster te injecteren. De geprogrammeerde gradiëntmobiele fasesamenstelling verandert automatisch door de samenstelling van acetonitril gedurende achttien minuten te verhogen van nul.
Na achttien minuten wordt de mobiele faseconditie opnieuw ingesteld op de initiële toestand en opnieuw geëquilibreerd voor de volgende injectie. Noteer na elke monsterrun de pieken van de geneesmiddelverbindingen en hun retentietijden. Gebruik vervolgens de HPLC-software om het oppervlakteonder de curve voor de geneesmiddelverbindingen te integreren.
Bereken het percentage geneesmiddelterugwinning en de verhouding van de oppervlakte onder de curve tussen elk geneesmiddel en de interne standaard, zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze procedure worden twee antikankergeneesmiddelen, Doxorubicine en Mitomycine C, samen met de Doxorubicine-metaboliet, Doxorubicinol, zonder biologische interferentie gedetecteerd. HPLC-analyse toont aan dat elk geneesmiddel goed gescheiden is van de andere.
De ontwikkelde HPLC-methode vertoont minder dan 15% variatie in intra- en interdagprecisie en nauwkeurigheid voor elk van de onderzochte geneesmiddelen, zowel in heel bloed als in verschillende biologische matrices, wat uitstekende reproduceerbaarheid aangeeft. De farmacokinetiek en biodistributie van langdurige circulatie of pegylering gebaseerde co-levering van Doxorubicine en Mitomycine C worden vervolgens bepaald. In het bloed wordt gezien dat de geneesmiddelconcentraties die worden afgeleverd door polymeer-lipide hybride nanodeeltjes in de loop van de tijd minstens zes keer hoger zijn dan in de gelijkwaardige vrije geneesmiddeloplossingen.
In een orthotopische borsttumor kunnen polymeer-lipide hybride nanodeeltjes Doxorubicine en Mitomycine C tegelijkertijd leveren in hun synergetische geneesmiddelverhouding. In vergelijking met een vrije geneesmiddeloplossing wordt gezien dat nanodeeltjes een verhoogde tumoraccumulatie hebben. Dit komt door de verlengde systemische circulatie, waardoor de nanodeeltjes de verhoogde permeabiliteit en retentie-effecten van de tumor kunnen benutten.
De verdere kwantitatieve bepaling van de vorming van Doxorubicinol in de borsttumor gedurende 24 uur, samen met verhoogde tumorapoptose, geeft aan dat de biobeschikbaarheid van geneesmiddelen van cruciaal be
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een robuuste methode voor de gelijktijdige extractie en kwantificering van Doxorubicine, Mitomycin C en Doxorubicinol in biologische monsters. Met behulp van omgekeerde fase hoge prestatie vloeistof chromatografie, is deze techniek ontworpen voor toepassingen in nanogeneeskunde.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Nanogeneeskunde
- Kankertherapieën
- Analytische chemie
Achtergrond
- Doxorubicine en Mitomycin C zijn belangrijke middelen tegen kanker.
- Doxorubicinol is een cardio-toxische metaboliet van Doxorubicine.
- Nanopartikelformuleringen kunnen de medicijnafgifte verbeteren.
- Het begrijpen van medicijninteracties is cruciaal voor een effectieve behandeling.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor de gelijktijdige kwantificering van meerdere medicijnen.
- Om onderzoek naar nanofarmacokinetiek te vergemakkelijken.
- Om inzicht te geven in het gedrag van geneesmiddelen in borsttumoren.
Gebruikte methoden
- Omgekeerde fase hoge prestatie vloeistof chromatografie (HPLC).
- Steekproefextractie uit biologische matrices.
- Gelijketijdige analyse van drie geneesmiddelverbindingen.
- Geen verandering van de mobiele fase vereist tijdens de analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle kwantificering van Doxorubicine, Mitomycin C en Doxorubicinol.
- Methode toonde efficiëntie in monstervoorbereiding.
- Inzichten verkregen in medicijninteracties in primaire borsttumoren.
- Mogelijke toepasbaarheid op andere kankersoorten.
Conclusies
- De methode is effectief voor het analyseren van medicijncombinaties.
- Visuele demonstraties verbeteren het leren van monstervoorbereiding.
- Deze aanpak kan de ontwerp van nanocarrier systemen informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This analytical method enables precise quantification of doxorubicin, mitomycin C, and doxorubicinol in biological matrices, supporting preclinical evaluation of nanoparticle-based drug combinations. By providing synchronized pharmacokinetic data, it informs the design of nanocarrier systems that enhance tumor accumulation and reduce systemic toxicity. The method addresses a critical gap in nanomedicine R&D by allowing direct comparison of free versus nanoparticle-delivered drug combinations in vivo.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying drug metabolites and parent compounds in tumor tissue.
- Operational Value: Supports mechanistic de-risking through simultaneous detection of efficacy and toxicity markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs for compound screening in complex biological matrices.
- Operational Value: Eliminates mobile phase changes during HPLC analysis, increasing throughput and reducing method variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker alignment by measuring drug exposure in tumors and cardiotoxic metabolites in heart tissue.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions via comparative pharmacokinetic profiling of nanoparticle versus free drug formulations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through preclinical validation, providing quantitative bioanalytical support for nanopharmacokinetic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying drug accumulation and metabolite formation in orthotopic tumor models.
- Screening: Ensures assay readiness through reproducible extraction and quantitation across whole blood, tumor, and heart tissues.
- Analytics: Generates chromatographic peak area ratios relative to internal standard, enabling cross-condition comparison of drug exposure.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by correlating tumor drug levels with enhanced apoptosis and reduced cardiotoxicity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating multiple nanocarrier formulations in oncology pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in nanocarrier design through simultaneous quantitation of drug combinations and metabolites.
- Operational Value: Standardized sample preparation and HPLC conditions ensure reproducibility across laboratories and studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing synergistic drug ratios and tumor-specific accumulation profiles.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nanoparticle formulations based on pharmacokinetic and biodistribution data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue homogenization, HPLC operation, and fluorescent/UV detection.
- Depends on access to refrigerated centrifuges, nitrogen evaporators, and autosampler-equipped HPLC systems.
- Necessitates standardization of extraction solvents and internal standard spiking across sample types.
- Must account for light sensitivity of doxorubicin and doxorubicinol during sample processing.
- Limited to analytes with compatible chromatographic behavior under isocratic and gradient conditions.
