Name: Beoordeling van de anticoagulatie en anti-inflammatoire eigenschappen van endotheliale cellen met behulp van 3D-celkweek en niet-vertonen volbloed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Leer een in vitro-model voor coagulatie met endotheelcellen en niet-geanticoaguleerd bloed. Deze methode toont anticoagulante eigenschappen en helpt bij cardiovasculair onderzoek naar stolling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (SNSF, Grant No. 320030_156193). De auteurs bedanken Dr. Benoît Werlen voor het verstrekken van het Biosilon microcarrier kralen. Wij danken ook Prof. Hans Peter Kohler en Prof. André Haeberli voor hulp bij het opzetten van de microcarrier-bead model.

Duits landras varkens (wild type gekweekt in een lokale boerderij en transgene gefokt bij het Instituut van de fokkerij van de moleculaire en biotechnologie, Ludwig-Maximilians-Universiteit, München, Duitsland), met een gewicht van 30 kg tot 40 kg, werden gebruikt Deze studie. Alle dieren waren gehuisvest onder standaardomstandigheden met water en voedsel ad lib. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de U.K. dieren Act (wetenschappelijke procedures) en de NIH-gids voor de zorg en gebruik van proefdieren, evenals het recht van de Zwitserse dierenbescherming. Alle dierproeven is naleving van de richtsnoeren voor het aankomen. Het Comité van de dierproeven van de kantonnale veterinaire dienst (kanton van Bern, Zwitserland) procedures afgekeurd op alle dierlijke, toestemming niet. BE70/14. Experimentele protocollen werden verfijnd volgens de principes van 3R en state-of-the-art anesthesie en pijnbehandeling werden gebruikt om te minimaliseren van het aantal dieren en het verminderen van de blootstelling van de dieren aan stress en pijn tijdens de experimenten.
 bloed werd getrokken uit gezonde individuen door gesloten systeem Venapunctie volgens Zwitserse richtsnoeren op het gebied van jurisdictie en ethiek van het universitair ziekenhuis van Bern. De uitdrukking &#34; niet-vertonen bloed &#34; betekent dat het bloed niet behandeld is met een antistollingsmiddel.
 de volgende stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Vertrouwdheid met fundamentele cel cultuur steriele techniek vereist is.
 1. isolatie van PAEC Opmerking: thoracale aorta segmenten van 6 tot 10 cm werden verkregen van euthanized Duits landras varkens van 3 tot en met 6 maanden van leeftijd (gebruikt voor andere experimenten in vivo) en onmiddellijk omgezet in een fles van 500 mL met transportmedium (DMEM + 1% penicilline/streptomycine).
<ol><li>Vooraf jas een 6-well plaat met fibronectine 12,5 µg Mo/mL in PBS 1 x en breng dit in een incubator bij 37 ° C voor 1 h.</li>
	<li>Vooraf warm steriel PBS 1 x en cel cultuur medium (DMEM).</li>
	<li>Nemen de varkens aorta uit transportmedium.</li>
	<li>Plaats van de aorta op een polystyreen plaat.</li>
	<li>Spoelen met warme PBS zachtjes vooraf.</li>
	<li>De aorta Overlangs snijden en op te lossen met naalden.</li>
	<li>Warme cel kweekmedium toevoegen op het oppervlak van de innerlijke schip.</li>
	<li>Gecombineerd fibronectine-cel kweekmedium en toevoegen van verse cel kweekmedium (DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 0,4% van Endothelial cel groei Medium Supplement Mix).</li>
	<li>Geniet een wattenstaafje in het kweekmedium cel. De kiem van katoen, wol op de top van het innerlijke vaartuig oppervlak wisser voorzichtig en langzaam in dezelfde richting.</li>
	<li>De cellen in een put van 6-well-plate ronde door ronde wrijf.</li>
	<li>Hetzelfde doen voor de rest van de putten.</li>
	<li>Controleer cellen onder de Microscoop en plaats van de 6-well-plaat in de incubator bij 37 ° C, 5% CO 2.</li>
	<li>Het medium wijzigen op de tweede dag en het weer elke 2-3 dagen.</li>
	<li>Cellen zijn gonna be confluente, trypsinize cellen als ze zaad in een maatkolf van T75 (PAEC P1).</li>
</ol> 2. Karakterisering van het PAEC <ol><li>vooraf jas een chamberslide 8-well met fibronectine 12,5 µg Mo/mL in PBS 1 x en breng dit in een incubator bij 37 ° C voor 1 h.</li>
	<li>5 x 10 4 cellen/goed zaad en na een nacht bebroeden in de incubator bij 37 ° C.</li>
	<li>Wassen van de cellen tweemaal met PBS ++ (PBS aangevuld met CaCl 2 en MgCl 2), 300 μl per putje.</li>
	<li>Herstellen van cellen met 3,7% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, 200 μl per putje.</li>
	<li>Wassen van cellen 3 keer met PBS ++, 300 μl per putje.</li>
	<li>Toevoegen van 300 μL van PBS 1 x-3_% BSA (buffer met blokkerend) en laat 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Toepassen van primaire antilichamen (anti-VE-cadherine, anti-CD31, anti-vWF) verdund in PBS 1x-1%BSA-0.05% wasmiddel, 160 μl per putje en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>3 keer wassen met PBS ++ (200 μl per putje).</li>
	<li>Secundaire antilichamen en DAPI verdund in PBS 1x-1%BSA-0.05% wasmiddel, 160 μl per putje, toepassen en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>3 keer wassen met PBS ++ (200 μl per putje).</li>
	<li>Monteren van dia's met glycerol gebaseerde montage medium en controleer of endothelial cel markeringen expressie onder een fluorescentie Microscoop. 
	Opmerking: Cultuur varkens aorta endotheliale cellen in een T175 kolf (DMEM lage glucose medium + 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 0,4% van Endothelial cel groei Medium Supplement Mix) tot 90% samenvloeiing is bereikt. (dichtheid 1 x 10 6 cellen zaaien, samenvloeiing van 90% overeen met ongeveer 5 x 10 6 cellen).</li>
</ol> 3. Coating van Microcarrier kralen <ol><li>Meng 7 mL microcarrier kralen met 42 mL van collageen oplossing in een tube van 50 mL (100 μg/mL verdund in een azijnzuur-oplossing van 0,2%) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen kralen twee keer met 25 mL PBS pH 7.4 (Voeg 25 mL PBS, goed mengen met de pipet en wacht totdat de kralen zijn neergestreken vervolgens negeren de bovendrijvende substantie en herhaal) en één keer met 25 mL van DMEM medium.</li>
	<li>Dekken de kralen in de 50 mL tube met 10mL medium 199 aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 1% L-Glutamine, 0,4% van Endothelial cel groei Medium Supplement Mix en 25 μL van heparine (5000 IU/mL) en laat de equilibratietijd voor 10 min voor verder gebruik.</li>
</ol> 4. Het verzamelen van cellen <ol><li>het kweekmedium cel verwijderen uit de kolf van de T175 met PAEC en voeg 5 mL PBS pH 7.4.</li>
	<li>Verwijderen PBS van de kolf T175.</li>
	<li>Voeg 5 mL van de Trypsin-0.05% EDTA en incubeer gedurende 3-4 minuten bij 37 ° C.</li>
	<li>De cellen verzamelen door het spoelen van de kolf met 15 mL cel kweekmedium en spoel de suspensie in een tube van 50 mL.</li>
	<li>Centrifugeren cellen op 1.200 x g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur, verwijderen van overtollige medium en resuspendeer de pellet in 5 mL cel kweekmedium.</li>
</ol> 5. Zaaien van de cellen in de maatkolf van de roerder <ol><li>Voeg toe 20 mL cel kweekmedium aan de celsuspensie en resuspendeer.</li>
	<li>Toevoegen van 20 mL cel kweekmedium (w/o cellen) in de maatkolf van 500 mL magneetroerder.</li>
	<li>De cellen toevoegen aan de gewassen microcarrier kralen uit stap 3.3 en meng zorgvuldig met serologische Pipetteer 25 mL.</li>
	<li>Het mengsel kralen/cel Pipetteer in de kolf magnetische spinner.</li>
	<li>De 50 mL tube met 10 mL van cel voedingsbodem voor het verzamelen van de resterende cellen spoelen.</li>
	<li>Toevoegen van een extra 85 mL van cel voedingsbodem in de maatkolf van spinner en leg deze in de incubator's nachts bij 37 ° C op een shaker (100 x g, mengen interval: 3 min elke 45 min).</li>
	<li>Voeg 50 mL cel kweekmedium (total volume 200 mL) en blijven roeren voor extra 24 uur bij 37 ° C op een shaker (100 x g, mengen interval: 3 min elke 45 min).</li>
	<li>Toevoegen kleurloze RPMI medium (aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 1% L-Glutamine, 0,4% van Endothelial cel groei Medium Supplement Mix en 25 μL van heparine) tot 320 mL totale volume is bereikt.</li>
	<li>Vervangen het medium elke oud medium 48 h: verwijderen 100 mL en voeg 100 mL vers aangevuld kleurloze RPMI.</li>
	<li>Cultuur de cellen gedurende 5 tot 7 dagen. De tijd hangt af van de staat van de samenvloeiing van de cel beklede parels.</li>
</ol> 6. Samenvloeiing verificatie <ol><li>200 μL van cel beklede kralen met behulp van een precisiepipet verzamelen en ze vervolgens overbrengen naar een polypropyleen buis.</li>
	<li>Wassen van de parels 3 keer met 600 μL van PBS 1 x (toevoegen van PBS, kantelen de buis en meng voorzichtig om te voorkomen, detachement van de cellen de kralen wachten om te settelen, negeren van de PBS en herhaal).</li>
	<li>Bevestigen de kralen gedurende 10 minuten door toevoeging van 200 μL van parapicric zuur.</li>
	<li>Wassen 3 keer met 600 μL van PBS 1 x.</li>
	<li>Toevoegen DAPI verdund in PBS 1 x en incubeer gedurende 10 min.</li>
	<li>Overbrengen van de kralen op een glasplaatje en breng een dekglaasje aan met behulp van op basis van glycerol montage middellange.</li>
	<li>Visualiseren de kralen onder een confocal microscoop.</li>
</ol> 7. Experimentele Procedure <ol><li>verwijderen van de cel beklede parels uit de kolf van de magneetroerder (procedures hoeft niet te worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden) serologische Pipetteer 10 mL en ze vervolgens overbrengen naar polypropyleen tubes van 12 mL ronde onderkant.</li>
	<li>Laat de parels gaan zitten (ongeveer 1-2 min) en verwijderen van de overtollige middellange.</li>
	<li>Toevoegen van meer kralen aan de buizen totdat elke buis precies 2 mL gesteld kralen bevat.</li>
	<li>Voeg 5 mL duidelijk RPMI aan elke buis toe en meng zorgvuldig gebruik te maken een serologisch pipet 10 mL.</li>
	<li>Laat de kralen settelen en het verwijderen van overtollige middellange.</li>
	<li>Herhaalt u de procedure wassen één meer tijd met RPMI en verwijder alle overtollige middellange.</li>
</ol> 8. Incubatie met Non-vertonen bloed <ol><li>zorgvuldig en langzaam (met behulp van jet noch vacutainers) bloed trekken vrijwilliger gezonde en verzamel het in 9 mL neutrale polypropyleen buizen (geen antistollingsmiddel).</li>
	<li>Breng langzaam 8 mL bloed met een serologische pipet 10 mL in elk van de polypropyleen tubes met 2 mL cel beklede kralen (het totale volume zullen 10 mL). Vermijd altijd ruwe behandeling van bloed of kralen ter voorkoming van vroegtijdige EG activering. De procedure duurt 1-2 min.</li>
	<li>Zorgvuldig het mengsel van de bloed/kraal om te zorgen voor gelijke mengen en verzegel het GLB met paraffine film kantelen.</li>
	<li>Plaats de buizen op een horizontale kantelbare tafel (met zachte kantelbare instellingen alleen) binnen een 37 ° C incubator en record stolling tijden.
	<ol><li>Op vaste tijdstippen, bijvoorbeeld na 10, 20, 30, 50, 70, 90 min, verwijderen van ten minste 1,5-2 mL bloed-kraal mix serum of plasma p.a.. 
		Opmerking: voor 6 tijdstippen raden we hebben meer dan 3 wordt gerepliceerd binnen een groep van cellen, zoals de bloedmonsters in verschillende buisjes gebeuren zal.</li>
		<li>Voor de verzameling van het serum, laat het bloed stollen. Het verzamelen van het plasma, EDTA of toevoegen citraat 2 mL buizen voor het toevoegen van bloedmonsters.</li>
		<li>Slaan de buizen op ijs, centrifugeer bij 2.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en bewaren van serum/plasma bij 80 ° C tot gebruik. 
		Opmerking: Informatie over materialen vindt u in de Tabel van materialen</li></ol></li></ol>

<ol><li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).</li>
<li>Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+recalcified+citrated+whole+blood+-+a+pragmatic+approach+for+thromboelastography+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Anesthesia%22%5BJournal%5D)">The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children.</a> Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).</li>
<li>Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Suppression+of+the+Coagulation+of+Nonanticoagulated+Whole-Blood+in-Vitro+by+Human+Umbilical+Endothelial-Cells+Cultivated+on+Microcarriers+Is+Not+Dependent+on+Protein-C+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation.</a> Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).</li>
<li>Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+suppress+prothrombin+activation+in+nonanticoagulated+whole+blood+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro.</a> J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).</li>
<li>Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+protection+and+complement+inhibition+in+xenotransplantation%3A+a+novel+in+vitro+model+using+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood.</a> Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).</li>
<li>Cowan, P. J., d'Apice, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+activation+and+coagulation+in+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Complement activation and coagulation in xenotransplantation.</a> Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).</li>
<li>Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx%3A+composition%2C+functions%2C+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization.</a> Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).</li>
<li>Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-coagulation+crosstalk+on+cellular+and+artificial+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces.</a> Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).</li>
<li>Bongoni, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Expression+of+Human+CD46+on+Porcine+Endothelium%3A+Effect+on+Coagulation+and+Fibrinolytic+Cascades+During+Ex+Vivo+Human-to-Pig+Limb+Xenoperfusions%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions.</a> Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).</li>
<li>Miyazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+shear+stress+can+initiate+both+platelet+aggregation+and+shedding+of+procoagulant+containing+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles.</a> Blood. 88, 3456-3464 (1996).</li>
<li>Wuensch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Sequences+of+the+Porcine+THBD+Gene+Facilitate+Endothelial-Specific+Expression+of+Bioactive+Human+Thrombomodulin+in+Single-and+Multitransgenic+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs.</a> Transplantation. 97, 138-147 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier gepresenteerde model is geschikt voor coagulatie gerelateerde studies zodat de analyse van de verschillende aspecten van coagulatie en de wisselwerking daarvan met EG. 8 in xenotransplantatie onderzoek is het een nuttig systeem om te testen de anticoagulatie eigenschappen van verschillende genetisch gemanipuleerde varkens ECs na incubatie met menselijk bloed 9.
De belangrijkste stappen van het protocol zijn die zorgen voor volledige cel d...

De vasculaire endotheel bestaat uit een monolayer van endotheliale cellen (EG) die lijn de lumen van bloedvaten. In een fysiologische toestand, rustige EG zijn verantwoordelijk voor het onderhoud van een antistollingsmiddel en anti-inflammatoire milieu. 1 dit is bemiddeld door de uitdrukking van antistollingsmiddel en anti-inflammatoire eiwitten op het oppervlak van de EG. Bijvoorbeeld, EG activering veroorzaakt door ischemie/reperfusie letsel of vasculaire afwijzing van (xeno-) getransplanteerde organen resultaten in een verandering van het endotheel oppervlak van een antistollingsmiddel en anti-inflammatoire staat naar een Pro-coagulant en pro-inflammatoire staat. 1
Om te bestuderen van de boeiende en complexe interactie tussen het endotheel en bloedstolling factoren, in vitro modellen die als nabootsen dicht mogelijk zijn de situatie in vivo zeer wenselijk. Een gemeenschappelijke beperking die conventionele in vitro coagulatie assays kenmerkt is het gebruik van vertonen bloed waardoor de analyse van stolling-gemedieerde effecten moeizame en zelfs recalcification citrated volbloed niet reproduceren resultaten kunnen worden verkregen met niet-vertonen van vers bloed. 2 bovendien, in traditionele flat-bed cel cultuur systemen is het onmogelijk om te exploiteren de anticoagulatie-eigenschappen van het endotheel als een voldoende endothelial celoppervlak per bloed volume kan niet worden bereikt. De hier gepresenteerde model overwint deze beperkingen door het kweken van de EG op het oppervlak van de sferische microcarrier kralen, zodat een EG oppervlak-te-bloed ratio van &#62; 16 cm2/mL kan worden bereikt, die is vergelijkbaar met de situatie in kleine arteriolen of aderen, en die werd beschreven als toereikend zijn voor "natuurlijke" antistolling van het bloed door het oppervlak van de EG. 3 , 4 volbloed kan worden gebruikt zonder toegevoegde anticoagulantia in deze instelling. Bloedmonsters kunnen worden genomen tijdens het experiment en cytokines, stollingsfactoren en oplosbare aanvulling activering markeringen kunnen worden gedetecteerd en kan worden gekwantificeerd. EG-gecoate microcarrier kralen, kunnen bovendien door confocale microscopie voor aanvulling en immunoglobuline depositie, alsmede de uitdrukking van de EG-markeringen voor activering te worden geanalyseerd. Een andere interessante toepassing omvat het testen van geneesmiddelen die worden verondersteld om te voorkomen dat endothelial cel activatie en dus coagulatie. 5 dit model niet volledig het vervangen van dierproeven, maar biedt een methode om te testen specifieke functionele hypothesen ex vivo cuvetten en dus vermindering van het aantal proefdieren bij het basisonderzoek op ischemie/reperfusie letsel of (xeno) transplantatie.
Het beschreven model werd gebruikt om na te bootsen van een xenotransplantatie bepalen in welke varkens aorta endotheliale cellen (PAEC) worden geteeld op de kralen microcarrier en geïncubeerd met hele, niet-vertonen menselijk bloed. Verschillende transgene PAEC, uitvoering van verschillende menselijke genen zoals CD46 voor de regulering van het complementsysteem en/of thrombomodulin (hTBM) voor de regulering van de stolling systeem, werden geanalyseerd voor hun anticoagulatie-eigenschappen. Endothelial cel activatie, aanvulling en stolling systemen zijn strak gecontroleerde en met elkaar verbonden. 6 daarom is het belangrijk om te begrijpen hoe de verschillende transgene cellen gedragen na blootstelling aan menselijk bloed met betrekking tot de adhesie molecuul expressie en cytokine release, vergieten van de glycocalyx en verlies van anticoagulatie eiwitten. 7

<table><tbody><tr><td>PAEC</td><td></td><td></td><td>Geïsoleerd uit varkens aorta in ons Lab</td></tr><tr><td>Microcarrier beads (Biosilon)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160-250</td><td></td></tr><tr><td>Collageen I, bovien</td><td>Gibco</td><td>A10644-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma</td><td>M7528</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td></td></tr><tr><td>Neutrale buizen</td><td>Sarstedt</td><td>02.1726.001</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen buizen</td><td>Simport</td><td>T406-2A</td><td></td></tr><tr><td>Rolkolven</td><td>Tecnomara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biologische roerder</td><td>Brouwer</td><td>MCS-104S</td><td></td></tr><tr><td>Ratten anti CD31</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB33871</td><td>Verdunning 1:100</td></tr><tr><td>Geit anti-rat IgG-Cy3</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-166-003</td><td>Verdunning 1:500</td></tr><tr><td>Geit anti VE-cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6458</td><td>Verdunning 1:100</td></tr><tr><td>Konijn anti vWF</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>Verdunning 1:100</td></tr><tr><td>Dk anti Gt IgG &ndash; Alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11055</td><td>Verdunning 1:500</td></tr><tr><td>Geit anti Konijn - FITC</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>Verdunning 1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-25MG-F</td><td>Verdunning 1 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Concentratie: 10% in celkweekmedium</td></tr><tr><td>Adapter</td><td>Sarstedt</td><td>14.1205</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Beeldanalyse software</td><td>Image J</td><td></td><td>Beschikbaar gratis op: https://imagej.net</td></tr><tr><td>Endotheelcel Groei Medium SupplementMix</td><td>PromoCell</td><td>C-39216</td><td>2 mL in 500 mL van DMEM</td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Concentratie: 1% in celkweekmedium</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>Concentratie: 1% in celkweekmedium</td></tr><tr><td>Heparine natricum</td><td>Drossa Pharm AG</td><td></td><td>Stockconcentratie: 5000 U.I./ mL</td></tr><tr><td>Chamberslides</td><td>Bioswisstec AG</td><td>30108</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 x 2H2O</td><td>Merck</td><td>2382.0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x6 H2O</td><td>Merck</td><td>1.5833.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Axon Lab AG</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Bovien Serum Albumine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Glycergel montage medium</td><td>Dako</td><td>C0563</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van de anticoagulatie en anti-inflammatoire eigenschappen van endotheliale cellen met behulp van 3d-celkweek en niet-vertonen volbloed

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endotheliale cellen zijn cruciaal voor de natuurlijke antistolling van circulerende bloed. Bijgevolg leidt endothelial cel activatie tot bloedstolling. Dit verschijnsel is waargenomen in veel klinische situaties, zoals orgaantransplantatie in aanwezigheid van pre-gevormde antistoffen anti-donor, met inbegrip van xenotransplantatie, evenals in ischemie/reperfusie letsel. Teneinde dierproeven volgens 3R normen (vermindering, vervanging en verfijning), in vitro model voor het bestuderen van het effect van endothelial cel zou activering op de bloedstolling zeer wenselijk zijn. Gemeenschappelijke flatbed systemen van endothelial celcultuur bieden echter een oppervlak-te-volume verhouding van 1-5 cm,2 van endotheel per mL bloed, dat niet voldoende voor natuurlijke, endotheel-gemedieerde antistolling is. Kweken van endotheliale cellen op microcarrier kralen kan verhogen de oppervlak-te-volume verhouding tot 40-160 cm2/mL. Deze verhoogde ratio is voldoende om ervoor te zorgen de "natuurlijke" antistolling volbloed, zodat het gebruik van anticoagulantia kan worden vermeden. Hier is een in vitro microcarrier gebaseerde systeem beschreven te bestuderen van de gevolgen van genetische modificatie van varkens endotheliale cellen voor stolling van hele, niet-vertonen menselijk bloed. In de beschreven assay, primaire varkens aorta endotheliale cellen, ofwel wild-type (WT) of transgene voor menselijke CD46 en thrombomodulin, werden geteeld op microcarrier kralen en vervolgens blootgesteld aan vers getrokken niet-vertonen menselijk bloed. Dit model zorgt voor de meting en kwantificering van cytokine release evenals activering markers van aanvulling en coagulatie in het bloedplasma. Daarnaast werden beeldvorming van geactiveerde endothelial cel en de afzetting van immunoglobulinen, aanvulling- en stolling eiwitten op de endothelialized parels uitgevoerd door confocale microscopie. Deze test kan ook worden gebruikt voor het testen van geneesmiddelen die worden verondersteld om te voorkomen dat endothelial cel activatie en dus coagulatie. Op de top van zijn potentieel om het aantal proefdieren voor dergelijke onderzoeken, is de beschreven test gemakkelijk uit te voeren en consequent reproduceerbaar.

Na 7-10 dagen van cultuur in de spinner kolf (Figuur 1) waren de cellen confluente, die betrekking hebben op het gehele oppervlak van de microcarrier parels (Figuur 2). Verificatie van de confluency staat is een belangrijke stap, omdat een niet-heuvels enkelgelaagde van de EG op de microbeads zal leiden tot een duidelijke afname in de bloedstolling tijd, gezien de microcarrier parels oppervlak is sterk Pro-coagulant (bloedstollin...

We presenteren een in vitro model waarmee de studie en analyse van coagulatie in hele, niet-vertonen bloed. Antistolling in het systeem is afhankelijk van de natuurlijke anticoagulation effect van gezonde endotheliale cellen en endothelial cel activatie zal resulteren in de bloedstolling.

Beoordeling van de anticoagulatie en anti-inflammatoire eigenschappen van endotheliale cellen met behulp van 3D-celkweek en niet-vertonen volbloed

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Het algemene doel van deze assay is om de antistollende eigenschappen van endotheelcellen te beoordelen met behulp van volledig niet-antigecoguleerd bloed. Deze methode kan worden gebruikt om onderzoeksvragen te beantwoorden die gerelateerd zijn aan cardiovasculair onderzoek, onderzoek naar transport en chirurgie. In essentie kan deze methode worden ingezet voor alle vragen die betrekking hebben op anti-immuniteit en de activatie van endotheelcellen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat volbloed zonder anticoagulantia kan worden gebruikt, aangezien anticoagulatie wordt gegarandeerd door endotheelcellen. Om het protocol te starten, mengt u zeven milliliter microcarrier-beads met 42 milliliter coagulantoplossing in een buis van 50 milliliter en incubeert u de beads gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was na incubatie de beads met 25 milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS en spoel de beads door ze herhaaldelijk op en neer te pipetteren.Wacht tot de kraaltjes naar de bodem van de buis zijn gezakt voordat het supernatant wordt weggegooid en de procedure wordt herhaald. Was de kraaltjes vervolgens één keer met 25 milliliters Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM. Dek de kraaltjes daarna af met 10 milliliters medium 199 en laat ze 10 minuten equilibreren voordat ze verder worden gebruikt.Verwijder het celkweekmedium uit de T175-fles met PAEC en voeg vijf milliliter PBS toe. Verwijder vervolgens de PBS uit de T175-fles en vervang deze door vijf milliliter trypsine met 0,05% EDTA. Incubeer de cellen gedurende drie tot vier minuten bij 37 °C.Verzamel de cellen door de kolf te spoelen met 15 milliliters celcultuurmedium en breng de suspensie over naar een 50 milliliter buis. Centrifugeer de cellen; verwijder na centrifugatie het overtollige medium en resuspendeer het pellet in vijf milliliters celcultuurmedium. Voeg 20 milliliters celcultuurmedium toe aan de celsuspensie en resuspendeer de cellen.Voeg 20 milliliters celkweekmedium zonder cellen toe aan een magnetische roerfles van 500 milliliter. Voeg de cellen toe aan de gewassen microcarrier-beads en meng de oplossing voorzichtig met een serologische pipette van 25 milliliter. Breng het mengsel van beads en cellen over in de magnetische roerfles.Spoel de buis met 10 milliliters celcultuurmedium om de resterende cellen te verzamelen. Voeg nog 85 milliliters celcultuurmedium toe aan de spinnerflask. Plaats de flask overnacht in de incubator bij 37 degree celsius op een schudapparaat.Voeg 50 milliliters celkweekmedium toe voor een totaalvolume van 200 milliliters. Blijf nog 24 uur roeren op een schudapparaat. Voeg kleurloos Rockwell Park Memorial Institute of RPMI-medium toe, totdat een totaalvolume van 320 milliliters is bereikt.Vervang elke 48 uur 100 milliliters van het oude medium door 100 milliliters vers, aangevuld kleurloos RPMI. Kweek de cellen gedurende vijf tot zeven dagen, afhankelijk van de confluentiestatus van de celgecoate beads. Verwijder de celgecoate beads met een serologische pipette van 10 milliliter uit de magnetische roerkolf en breng ze over in ronde polypropylene buisjes van 12 milliliter.Na één tot twee minuten, wanneer de kraaltjes zijn bezonken, wordt het overtollige medium verwijderd. Voeg meer kraaltjes toe aan de buisjes totdat elk buisje precies twee millimeter kraaltjes bevat. Voeg vervolgens vijf milliliter helder RPMI toe aan elk buisje en meng de oplossing voorzichtig met een serologische pipette van 10 milliliter.Laat de kraaltjes bezinken en verwijder het overtollige medium. Herhaal de wasprocedure nogmaals met RPMI en verwijder al het overtollige medium. Neem voorzichtig en langzaam bloed af van een gezonde vrijwilliger en verzamel dit in een neutraal polypropyleen buisje van negen milliliter, zonder antistollingsmiddel.Breng langzaam acht milliliter bloed over in elke polypropyleenbuis die twee milliliter celgecoate beads bevat, om een totaalvolume van 10 milliliter te verkrijgen. Zorg ervoor dat het bloed en de beads voorzichtig worden gehanteerd om voortijdige EC-activatie te voorkomen. Kantel het bloed-beadmengsel voorzichtig om een gelijkmatige menging te garanderen en sluit de dop af met paraffinefilm.Plaats de buisjes op een horizontale kippeltafel met milde instellingen in een incubator van 37 °C en noteer de stollingstijden. Verwijder op vastgestelde tijdsintervallen ten minste 1,5 tot 2 mL van het bloed-beadmengsel voor serum- of plasma-analyse. Laat het bloed stollen voor de winning van serum.Centrifugeer de buizen tot slot 10 minuten bij 2.500 G bij vier graden Celsius. Bewaar het serum of plasma bij 80 graden Celsius tot gebruik. Microcarrier-beads die zijn gekleurd voor CD31 en kernen tonen duidelijk confluentie.Door visuele observatie werd vastgesteld dat een verlenging van de stollingstijd kon worden waargenomen wanneer een monolaag van EC aanwezig was op het oppervlak van de microcarrier-beads. Een significante toename van de stollingstijd werd waargenomen bij de aanwezigheid van porcine aortale endotheelcellen, PAEC GalTKO/hCD46/hTBM, op microcarrier-beads, wat wijst op een succesvolle modulatie van zowel het complementsysteem als het stollingssysteem. Zodra de methode onder knie is, kan de incubatie van beads gecoat met endotheelcellen met niet-anticoagulatiebehandeld menselijk bloed in ongeveer zes uur worden voltooid.De feitelijke duur van het experiment hangt hoofdzakelijk af van de stollingstijd, die tijdens het experiment wordt waargenomen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de microbeads volledig bedekt zijn met endotheelcellen en om voortijdige activering van menselijk bloed te voorkomen.

assessment-anticoagulant-anti-inflammatory-properties-endothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een methode om cultuur een endotheelcel monolaag het gehele inwendige oppervlak van een 3D microfluïdische apparaat met microvasculaire grootte kanalen (&lt;30 pm) beschreven.

Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten

Microfluïdische stromingskamers geëtst door fotolithografie en vervaardigd uit PDMS worden toegepast op functionele resultaten in verband met EG-dysfunctie en ontsteking te onderzoeken. In een representatief experiment het vermogen van differentiële schuifspanning moduleren monocyte celhechting aan cytokine geactiveerd EC monolagen wordt aangetoond.

On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering

De toegankelijkheid van betrouwbare modellen om vasculaire bloedinteracties bij mensen te onderzoeken ontbreekt. We presenteren een in vitro model van gekweekte primaire humane endotheelcellen gecombineerd met menselijk volbloed om cellulaire interacties zowel in het bloed (ELISA) als in het vasculaire compartiment (microscopie) te onderzoeken.

A Novel In vitro Model voor het bestuderen van de interactie tussen menselijk volbloed en endotheel

We rapporteren een in vitro methode die de kwantificering van het werkelijke aantal adhesieve cellen binnen een endotheelcelmonolaag mogelijk maakt.

Kwantificering van endotheelcellen Hechtvermogen<em&gt; In Vitro</em

Vasculaire endotheel bepaalt strak leukocyte werving. Onvoldoende leukocyte extravasation draagt bij tot de inflammatoire ziekten bij de mens. Daarom is zoeken naar nieuwe regelgevende elementen van endothelial activering om te ontwerpen van verbeterde therapieën voor inflammatoire aandoeningen. Hier beschrijven we een uitgebreide methodologie om te karakteriseren roman endothelial regelgevers die leukocyte handel tijdens ontsteking kunnen wijzigen.

Screening tests karakteriseren roman Endothelial toezichthouders die betrokken zijn bij de ontstekingsreactie

Het behoud van de bloeddrukbarriere dekking is de sleutel voor de homeostase van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft in vitro technieken om de fundamentele en pathologische processen te definiëren die de bloeddrukbeperking moduleren.

In Vitro- analyses voor het beoordelen van bloed-hersenbarrière Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Hier presenteren we een nieuwe toepassing van de bepaling van de aorta ring waar prelabelled mesenchymale cellen zijn mede gekweekte met rat aorta afkomstige endothelial netwerken. Deze nieuwe methode kunt visualisatie van mesenchymale stromale cellen (MSCs) homing en integratie met endothelial netwerken, kwantificering van netwerkeigenschappen en evaluatie van MSC immunophenotypes en gen-expressie.

De aorta Ring mede cultuur Assay: Een handig hulpmiddel om te beoordelen van het potentieel van de Angiogenic van mesenchymale stromale cellen In Vitro

Dit manuscript beschrijft het gebruik van transgene reporter muizen en andere beheerprogramma routes van fluorescente kleurstoffen in angiotensine II-geïnduceerde hypertensie met behulp van intravital videomicroscopie van bloedvaten te evalueren van de activering van immune cellen en hun mogelijkheid te rollen en zich houden aan het endotheel.

Visualiseren van leukocyten rollen en hechting in angiotensine II-geïnfundeerd muizen: technieken en valkuilen

Driedimensionaal co-Culture spheroid-systeem voor angiogenese is ontworpen om de fysiologische angiogenese na te bootsen. Co-Culture sferoïden worden gevormd door twee humane vasculaire celprecursoren, ecfcs en MSCS, en ingebed in collageen gel. Het nieuwe systeem is effectief voor het evalueren van angiogene modulatoren en verschaft relevantere informatie aan de in vivo studie.

Driedimensionaal angiogenese-assay systeem met co-Culture Spheroids gevormd door endotheliale kolonie vormende cellen en mesenchymale stamcellen

We presenteren een in vitro vasculaire ziekte model om hele bloed interacties met patiënt-afgeleide endotheel te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om tromboogene eigenschappen van primaire endotheelcellen onder verschillende omstandigheden te bestuderen. De methode is vooral geschikt om in situ tromboïgeniteit en antistollingstherapie te evalueren tijdens verschillende fasen van stolling.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Hier presenteren we een nieuw protocol om de gerichte afzetting van medicijndragers aan endotheelcellen in gefabriceerde, reële, driedimensionale menselijke slagadermodellen onder fysiologische stroom te bestuderen en in kaart te brengen. De gepresenteerde methode kan dienen als een nieuw platform voor het richten van medicijndragers binnen het vasculaire systeem.

In vitro 3D-celgekweekte arteriële modellen voor het bestuderen van vasculaire drugtargeting onder stroom

Leer een in vitro-model voor coagulatie met endotheelcellen en niet-geanticoaguleerd bloed. Deze methode toont anticoagulante eigenschappen en helpt bij cardiovasculair onderzoek naar stolling.

Beoordeling van de anticoagulatie en anti-inflammatoire eigenschappen van endotheliale cellen met behulp van 3D-celkweek en niet-vertonen volbloed (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van de anticoagulatie en anti-inflammatoire eigenschappen van endotheliale cellen met behulp van 3D-celkweek en niet-vertonen volbloed

Meer video's verkennen