Name: Een methode om te beoordelen van Fc-gemedieerde Effector functies geïnduceerd door Influenza hemagglutinine specifieke antilichamen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Leer Fc-gemedieerde effectorfuncties meten bij influenza hemagglutinine-specifieke antilichamen. Deze methode gebruikt HEK293-cellen en ADCC-assays voor snelle evaluatie van antilichaameffectiviteit binnen 24 uur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd met de federale middelen van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, onder CEIRS contract P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

De voorgevormde in dit manuscript experimenten werden gedaan volgende Icahn School of Medicine van institutionele code van ethiek en verordeningen.
1. weergave van de Influenza Virus hemagglutinine via transfectie of infectie
Transfectie:
<ol><li>Plaat menselijke embryonale nier (HEK 293T) cellen bij een dichtheid van 2 x 10,4 cellen per putje in een witte Weefselkweek behandeld 96-wells-plaat en laat het zitten voor 4 uur in een incubator 37 °C (met 5% CO2).</li>
	<li>Cellen met 100 transfect ng van het DNA dat codeert voor virale hemagglutinine en 0.2 μL van transfectiereagens per putje in een totaal volume van 50 μl. Opmerking: Beide plasmide en transfectant reagens worden verdund in 1 x Opti-Minimum essentiële Media (MEM) verminderd Serum Medium.</li>
	<li>Na incubatie platen in een incubator van de 37 °C met 5% CO2 voor 18u, transfectie media te verwijderen.</li>
</ol>2. infectie
<ol><li>Plaat-A549 of Madin Darby canine nier cellen bij een dichtheid van 2 x 10,4 cellen per putje in een witte Weefselkweek behandeld 96-wells-plaat en groeien voor ten minste 18 h in een 37 °C incubator met 5% CO2.</li>
	<li>Verdunde virus in 1 x MEM en infecteren van cellen op een veelheid van infectie van 0,33 gedurende 1 uur in een incubator 37 °C met 5% CO2, 3 en 1. Totale volume moet gelijk zijn aan 100 μl. Opmerking: 10 x MEM is verdund met water te maken van een 1 x MEM werken voorraad voor virus verdunning hierboven vermeld.</li>
	<li>Na infectie, verwijder het entmateriaal en voeg 100 μl van 1 x MEM in de plaat in de afwezigheid van trypsine.</li>
	<li>Geïnfecteerde cellen gedurende 18 tot 24 uur in een incubator 37 °C met 5% CO2groeien.</li>
</ol>3. beoordeling van de FcRg/NFAT-gemedieerde activering van Luciferase activiteiten door Monoclonal antilichamen of Sera
<ol><li>Eerst vervangen door groei media van transfected of geïnfecteerde cellen 25 µL van assay media (1 x RPMI 1640 aangevuld met 4% (vol/vol) laag IgG foetale boviene sera).</li>
	<li>In een afzonderlijke 96-wells-plaat, viervoudige verdunningen van de antilichamen van belang vanaf 30 μg/mL met behulp van de media van de test uit te voeren. Verdunningen in triplicates uitvoeren en een indeling van de plaat in het volgende voorbeeld wordt geïllustreerd in figuur 1A. Zorg ervoor dat een besturingselement bevatten dat uitsluit van antilichaam (geen antilichaam control) en een achtergrond controle (assay buffer alleen). Opmerking: voor zowel de 'geen antilichamen tegen' achtergrond van besturingselementen en voeg 25 µL van assay buffer in plaats van antilichaam.</li>
	<li>25 μL van de serieel verdunde antilichamen van stap 3.2 overbrengen aan overeenkomstige putjes op plaat van transfected cellen of geïnfecteerde cellen.</li>
	<li>Incubeer plaat in een incubator van de 37 °C (met 5% CO2) gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Voeg toe 25 μL van de passende gemodificeerde effector Jurkat cel uiting lymfkliertest FcgRIV of menselijke FcgRIIIa (75.000 van cellen per putje). Totale volume voor elk goed moet 75 µL en de startende eindconcentratie van het antilichaam is bij 10 µg/mL (figuur 1B). Opmerking: Voor de achtergrond controle, toevoegen 25 µL van assay buffer in plaats van effector cellen. Om te onderzoeken antilichaam afhankelijk cel-gemedieerde fagocytose, kan een gewijzigde Jurkat cel uiting van de menselijke FcgRIIa worden gebruikt.</li>
	<li>Incubeer plaat in een incubator van de 37 ° C met 5% CO2 voor 6 uur.</li>
	<li>Dooi en warme luciferase substraat buffer in een water van 37 °C gedurende ongeveer 1 uur vóór gebruik. Opmerking: Om de luciferase substraat buffer, reconstrueren gelyofiliseerd luciferase assay substraat in assay buffer geleverd. De gereconstitueerde substraat buffer kan worden achtergelaten bij-30 °C tot-10 °C voor maximaal zes weken.</li>
	<li>Voeg 75 μl per putje van luciferase substraat buffer toe aan alle putjes met uitzondering van de achtergrond controle.</li>
	<li>Lezen op een luminometer.</li>
	<li>Vouw inductie met de volgende vergelijking berekenen: vouwen inductie = (waarde-achtergrond van de ingegeven waarde) / (geen mAb waarde-achtergrond-waarde).</li>
</ol>

<ol><li>Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+haemagglutination-inhibiting+antibody+in+protection+against+challenge+infection+with+influenza+A2+and+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses.</a> J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).</li>
<li>Throsby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosubtypic+neutralizing+monoclonal+antibodies+cross-protective+against+H5N1+and+H1N1+recovered+from+human+IgM%2B+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells.</a> PloS One. 3 (12), e3942(2008).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li>
<li>Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+solution+to+group+2+influenza+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A common solution to group 2 influenza virus neutralization.</a> PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).</li>
<li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li>
<li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microb+and+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Curr Top Microb and Immunol. , Chapter 408 (2014).</li>
<li>Impagliazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. , (2015).</li>
<li>Nachbagauer, R., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Microbiology+and+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microb+Infect%22%5BJournal%5D)">Clinical Microbiology and Infection.</a> Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).</li>
<li>Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+universal+influenza+virus+vaccine+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">Novel universal influenza virus vaccine approaches.</a> Current opinion in virology. 17, 95(2016).</li>
<li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+Stalk-Reactive+Antibodies+Are+Boosted+following+Sequential+Infection+with+Seasonal+and+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice.</a> J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).</li>
<li>Hai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+expressing+chimeric+hemagglutinins%3A+globular+head+and+stalk+domains+derived+from+different+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes.</a> J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).</li>
<li>Dunand, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Path%22%5BJournal%5D)">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Path. 12 (4), e1005578(2016).</li>
<li>DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+hemagglutinin+stalk-specific+antibodies+require+Fc%CE%B3R+interactions+for+protection+against+influenza+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo.</a> Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).</li>
<li>DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+anti-influenza+antibodies+require+Fc+receptor+engagement+for+in+vivo+protection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection.</a> J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).</li>
<li>Potter, C. W., Oxford, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+immunity+to+influenza+infection+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Determinants of immunity to influenza infection in man.</a> Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).</li>
<li>Memoli, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Antihemagglutinin+and+Antineuraminidase+Antibodies+as+Correlates+of+Protection+in+an+Influenza+A%2FH1N1+Virus+Healthy+Human+Challenge+Model%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model.</a> mBio. 7 (2), e00417(2016).</li>
<li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+cross-reactive+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+toward+2009+pandemic+influenza+A+virus+subtype+H1N1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1.</a> J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).</li>
<li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-Reactive+Influenza-Specific+Antibody-Dependent+Cellular+Cytotoxicity+Antibodies+in+the+Absence+of+Neutralizing+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies.</a> J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).</li>
<li>Jegaskanda, S., Wheatley, A. K., Kent, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScienceDirectAntibody-dependent+cellular+cytotoxicity+and+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">ScienceDirectAntibody-dependent cellular cytotoxicity and influenza virus.</a> Curr Opin Virol. 22 (C), 89-96 (2017).</li>
<li>Srivastava, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Dominant+Antibody-Dependent+Cell-Mediated+Cytotoxicity+Epitopes+on+the+Hemagglutinin+Antigen+of+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of Dominant Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Epitopes on the Hemagglutinin Antigen of Pandemic H1N1 Influenza Virus.</a> J Virol. 87 (10), 5831-5840 (2013).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+specificity+plays+a+critical+role+in+regulating+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+against+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Epitope specificity plays a critical role in regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza A virus.</a> PNAS. 113 (42), 11931-11936 (2016).</li>
<li>Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+activation+of+Fc-mediated+effector+functions+by+influenza+virus+hemagglutinin+antibodies+requires+two+points+of+contact%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Optimal activation of Fc-mediated effector functions by influenza virus hemagglutinin antibodies requires two points of contact.</a> PNAS. , 201613225(2016).</li>
<li>Benjamin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Broadly+Neutralizing+Human+Monoclonal+Antibody+Directed+against+a+Novel+Conserved+Epitope+on+the+Influenza+Virus+H3+Hemagglutinin+Globular+Head%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibody Directed against a Novel Conserved Epitope on the Influenza Virus H3 Hemagglutinin Globular Head.</a> J Virol. 88 (12), 6743-6750 (2014).</li>
<li>Ekiert, D. C., Kashyap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-neutralization+of+influenza+A+viruses+mediated+by+a+single+antibody+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop.</a> Nature. 488 (7417), 526-532 (2013).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+Neutralizing+Anti-Influenza+Virus+Antibodies%3A+Enhancement+of+Neutralizing+Potency+in+Polyclonal+Mixtures+and+IgA+Backbones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones.</a> J Virol. 89 (7), 3610(2015).</li>
<li>Kristensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Responses+with+Fc-Mediated+Functions+after+Vaccination+of+HIV-Infected+Subjects+with+Trivalent+Influenza+Vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine.</a> J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).</li>
<li>Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+cytotoxicity+to+influenza+virus-infected+cells.+II.+Requirement+for+antibody+and+non-T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+%28Baltimore%2C+Md.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes.</a> J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).</li>
<li>Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+detecting+virus-specific+antibodies+triggering+activation+of+Fc%CE%B3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcγ receptors.</a> J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).</li>
<li>de Vries, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus-specific+antibody+dependent+cellular+cytoxicity+induced+by+vaccination+or+natural+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza virus-specific antibody dependent cellular cytoxicity induced by vaccination or natural infection.</a> Vaccine. 35 (2), 238-247 (2017).</li>
<li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+reporter-based+ADCC+assay+with+frozen%2C+thaw-and-use+cells+to+measure+Fc+effector+function+of+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies.</a> J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).</li>
</ol>

Auteurs verklaren geen belangenconflicten.

De hier beschreven methode kan de gebruiker het vermogen meten van een HA-specifiek monoklonaal antilichaam aan de lymfkliertest FcγRIV. De doel-antigeen, influenza virus hemagglutinine, wordt uitgedrukt op het oppervlak van cellen na infectie door een virus of transfectie van plasmide DNA. De bepaling is verder vatbaar voor het gebruik van verschillende oppervlakte-uitgedrukt virale eiwitten in combinatie met andere FcγRs (mensen of RattenUitrustingen). Bovendien, wij zijn gewend sera monsters beoordelen het vermogen va...

Traditioneel is immuniteit geboden door de seizoensgebonden griepvaccin beoordeeld door de hemagglutination inhibitie (HI) assay1, die de aanwezigheid van antilichamen die gericht zijn op de receptor bindende site van het hemagglutinine meet. Deze antilichamen HI-actieve steriliserende immuniteit kunnen verlenen, maar zijn over het algemeen smal in hun breedte van bescherming, het verlenen van immuniteit aan slechts een select paar stammen van het influenzavirus. De isolatie en de karakterisering van de breed-reactieve monoclonal antilichamen die de hemagglutinine (HA herkent) stel voor dat de ontwikkeling van een universele griepvaccin ligt binnen handbereik2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. een van de belangrijkste doelen van een universele influenza vaccin is voor het opwekken van een sterke antistofrespons richting de geconserveerde gebieden van het influenza virus9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. in het algemeen reactief antilichamen die deze geconserveerde epitopes, samengesteld uit zowel neutraliseren en niet-neutraliserende antilichamen17,18 herkent, is aangetoond dat ze vereisen Fc-FcγR interacties voor optimale bescherming in vivo en markeer de bijdrage van Fc-gemedieerde immuniteit aan de algehele immune reactie op griep virus19,20.
Correlaten van bescherming zijn van cruciaal belang bij de beoordeling van immuniteit tegen infectie. Deze statistieken kunnen wetenschappers en clinici te schatten van de werkzaamheid van vaccins, de betekenis van de gegevens, en de cursus van behandeling. Het enige gevestigde correlaat van bescherming tegen besmetting van de griep-virus is de hemagglutination inhibitie-test. Een titer van 1:40 is geassocieerd met een vermindering van 50% in het risico van ziekte1,21 – en weerspiegelt de aanwezigheid van antilichamen die een remmende werking van agglutinatie richten op de receptor binden vindplaats op de bolvormige kop van de HA. Echter moet ook opgemerkt worden dat T-cel reacties een betere correlaat van bescherming tegen besmetting van het virus van de griep op de ouderen wellicht. Interessant, suggereert een recent rapport dat neuraminidase remming activiteit kan een betere voorspeller van immuniteit tegen influenza22. Gelukkig, typisch in vitro testen zoals neutralisatie of neuraminidase remming assays HA stengel - of neuraminidase-specifieke antilichamen kunnen meten. De meeste van deze conventionele in vitro tests, echter alleen rekening houden met de functie van de antigeen-bindende regio van het antilichaam en meten niet de rol van de Fc-regio. Daarnaast zijn de bijdrage van niet-neutraliserende antilichamen die via Fc receptor betrokkenheid in vivo beschermen niet gevonden17,18. Om te meten bescherming door antistoffen die Fc-gemedieerde immuniteit zoals antilichaam afhankelijk cel-gemedieerde cytotoxiciteit (ADCC induceren), is een robuust in vitro -assay nodig.
De onderstaande methode beoordeelt de mogelijkheid van lymfkliertest monoclonal antilichamen voor het opwekken van Fc-gemedieerde functies met behulp van een genetisch gemodificeerde Jurkat cellijn uiting geven aan een activeren RattenUitrustingen Typ 1 FcR, FcγRIV. De betrokkenheid van het antilichaam van de FcγR transduces intracellulaire signalering die triggers nucleaire factor van geactiveerde T-cellen-gemedieerde luciferase activiteit. De bepaling heeft diverse voordelen ten opzichte van traditionele technieken waarvoor isolatie en cultuur van primaire effector cellen en het gebruik van stroom cytometry gedetecteerd activering van Fc-gemedieerde effector functies19,23,24 ,25,26. Ten eerste kan het protocol beschreven hier gemakkelijk worden aangepast aan het nemen verschillende virale doelen, FcγRs en antilichamen van verschillende soorten (METMENSELIJKE en lymfkliertest). Ten tweede, het gebruik van een gemodificeerde cel Jurkat lijn uiting geven aan een FcγR met een luciferase verslaggever gen onder een nucleaire factor van geactiveerde T-cel (NFAT) voorziet in een groot formaat assay die gemakkelijk kan worden geanalyseerd met behulp van een afleesapparaat meten van luminescentie. Hier wordt de traditionele activering van primaire effector cellen vervangen door de inductie van NFAT-luciferase op antilichaam betrokkenheid van een FcγR op het oppervlak van de Jurkat-cel. Deze bepaling van de indeling 96-wells-plaat zorgt voor de meting van maximaal vier verschillende monsters in triplicates met zeven verdunningen – een aantal monsters dat kan erg onhandig zijn om met behulp van traditionele technieken. Er zijn extra punten te overwegen met deze test die kan invloed hebben op het ontwerp van experimenten en de interpretatie van de gegevens. De virale doelstelling moet worden uitgedrukt op het celoppervlak om erkenning van het antilichaam. Om te verhelpen dit, kan het doel antigeen (bijvoorbeeld een interne virale eiwitten) direct worden bekleed op het oppervlak van een plaat. Echter is dit nog niet grondig getest. Bovendien, de gemodificeerde cellijn van Jurkat spreekt slechts één type FcγR activeren en doet niet express eventuele remmende FcγRs, terwijl de primaire cellijnen express alle receptoren in een fysiologische context.
We hebben eerder deze test gebruikt om aan te tonen dat epitoop specificiteit in een polyclonal context een cruciale rol speelt bij het reguleren van de Fc-gemedieerde effector functies en dat optimale activatie van antilichaam afhankelijk cel-gemedieerde reactie twee punten van vereist Neem contact op met27,28. Hier beschrijven we een methode die het vermogen van de stengel-specifieke monoclonale antistoffen aan te gaan en het activeren van de RattenUitrustingen activeren FcγRIV beoordeelt. Hoewel er uitzonderingen29,30, een groot aantal grotendeels reactief antilichamen richten op de regio antigenisch geconserveerde stengel van het hemagglutinine en zo een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van een universele influenza vaccin.

<table><tbody><tr><td>A549-cellen&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>Adenocarcinomische humane alveolaire basale epitheliale cellen</td></tr><tr><td>HEK 293T-cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Menselijke embryonale niercellen</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11668019</td><td>Transfectie reagens</td></tr><tr><td>1X Opti-MEM Verminderd Serum Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>Witte weefselkweek behandelde 96-well plate</td><td>Corning, Inc.&nbsp;</td><td>3917</td><td>Assay platen</td></tr><tr><td>10X MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat-cel die muur FcgRIV tot expressie brengt</td><td>Promega</td><td>M1201</td><td>Kit bevat cellen, Bio-Glo Luciferase assay systeem, 1X RPMI en laag IgG serum</td></tr><tr><td>Jurkat-cel die menselijke FcgRIIIa tot expressie brengt</td><td>Promega</td><td>G7010</td><td>Kit bevat cellen, Bio-Glo Luciferase assay systeem, 1X RPMI en laag IgG serum</td></tr><tr><td>Jurkat-cel die menselijke FcgRIIa tot expressie brengt</td><td>Promega</td><td>G9901</td><td>Kit bevat cellen, Bio-Glo Luciferase assay systeem, 1X RPMI en laag IgG serum</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1 Multi-Mode lezer</td><td>Luminescentie plate lezer</td></tr><tr><td>Bio-Glo Luciferase Assay Systeem</td><td>Promega</td><td>G7940</td><td>Bevat luciferase assay buffer en luciferase assay substraat</td></tr><tr><td>Madin Darby honden niercellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>Honden niercellen</td></tr></tbody></table>

een methode om te beoordelen van fc-gemedieerde effector functies geïnduceerd door influenza hemagglutinine specifieke antilichamen

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antilichamen spelen een cruciale rol in de koppeling van de aangeboren en adaptieve immuunrespons tegen virale pathogenen via hun antigeen-bindende domeinen en Fc-regio's. Hier beschrijven we hoe meet je de activering van Fc effector functies door monoclonal antilichamen gericht op het influenza virus hemagglutinine met het gebruik van een genetisch gemanipuleerde Jurkat cellijn uitdrukken activeren van een type 1 Fc-FcγR. met behulp van deze methode, de bijdrage van specifieke Fc-FcγR interacties immunoglobulinen toekent, kan worden bepaald met behulp van een in vitro assay.

We laten zien dat een stengel-specifieke mAb, 6F12, maar niet de hoofd-specifieke een hoofd-specifieke mAb, PY102, was in staat om primaire natural killer cellen activeren door upregulating CD107a en interferon γ19. Om het model van het vermogen van een stengel-specifieke antilichaam om primaire menselijke NK-cellen activeren, laten we zien dat een stengel-specifieke mAb, 6F12, de gewijzigde Jurkat cel uiten de lymfkliertest FcγRIV door krachtig kunt activeren ~ 14-fold. Aan de andere kant, doen d...

Beschrijven we een methode voor het meten van de activering van Fc-gemedieerde effector functies door antilichamen die gericht het influenza virus hemagglutinine. Deze test kan ook worden aangepast voor de beoordeling van het vermogen van monoclonal antilichamen of polyclonal sera gericht op andere virale oppervlakte glycoproteïnen ertoe Fc-gemedieerde immuniteit.

Een methode om te beoordelen van Fc-gemedieerde Effector functies geïnduceerd door Influenza hemagglutinine specifieke antilichamen

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Het algemene doel van dit protocol is om het vermogen van een antilichaam of een serummonster om Fc-gemedieerde effectorfuncties te activeren te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de immunologie en vaccinologie door de activering van antilichaam-afhankelijke Fc-gemedieerde immuniteit te meten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het experiment binnen 24 uur kan worden voltooid, van de materiaaltervoorbereiding tot de data-analyse.Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Mark Bailey, promovendus uit het laboratorium van Peter Palese. Om de expressie van influenza-virushemagglutinine via transfectie te induceren, worden eerst menselijke embryonale nier 293-cellen geplaat genomiseerd in een witte, voor weefselkweek behandelde 96-wellplaat met een concentratie van 2 × 10⁴ cellen per well. Na vier uur bij 37 °C en 5% CO2 worden de cellen getransfecteerd met 100 ng DNA dat codeert voor viraal hemagglutinine en 0,2 µL transfectiereagens per well in een totaal volume van 50 µL 1X optimum-reduced serum medium.Voeg DNA-liposoomcomplexen toe aan elke put voor transfectie en plaats de plaat opnieuw in de incubator voor nog eens 18 uur. Om de expressie van influenza virus hemagglutinine via infectie te induceren, plaatst u A549-cellen in een witte, voor weefselkweek behandelde 96-well plaat met een concentratie van 2 × 10⁴ cellen per put voor een incubatie van ten minste 18 uur bij 37 °C en 5% CO2. Aan het einde van de incubatie verdunt u het influenzavirus tot een multiplicity of infection van drie in 100 µL 1X MEM-medium per put en infecteert u de A549-cellen gedurende één uur in de celkweekincubator.Vervang aan het einde van de incubatie het inoculum door 100 µL vers 1X MEM-medium zonder virus en plaats de cellen opnieuw in de incubator voor nog eens 18 tot 24 uur. Om de capaciteit van specifieke antilichamen van belang te bepalen om de hemagglutinine-expresserende cellen te targeten, vervangt u het supernatant van de viraal beïnvloede celculturen door 25 µL medium voor de Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity- of ADCC-assay. Voer vervolgens, in een aparte 96-wells plaat, vier volledige verdunningen van de betreffende antilichamen in triplikaat uit in vers ADCC-medium, beginnend bij 10 µg/mL volgens het schema, waarbij u erop let dat de achtergrondcontrole en de controle zonder antilichaam worden opgenomen.Wanneer alle antilichamen zijn verdund, brengt u 25 µL van het verdunde antilichaam over naar de overeenkomstige wells in de experimentele celplaat en plaatst u de plaat in de celkweekincubator. Voeg na 15 minuten 7,5 × 10⁴ gemodificeerde effector Jurkat-cellen die de juiste Fc-receptor tot expressie brengen toe per well in 25 µL ADCC-medium, voor een eindvolume van 75 µL ADCC-medium per well. Plaats de plaat gedurende zes uur terug in de celkweekincubator en ontdooi het luciferase-substraatbuffer in een waterbad van 37 °C tijdens het laatste uur van de incubatie.Zodra de buffer gereed is, voegt u 75 µL luciferase-substraatbuffer toe aan alle wells, behalve aan de well voor de achtergrondcontrole, en leest u de plaat af op een luminometer. De fold-inductie van antilichaam-afhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit in de getransfecteerde of geïnfecteerde celculturen kan vervolgens worden berekend. In dit experiment activeerde en modificeerde een stam-specifiek monoklonaal antilichaam Jurkat-cellen die murine Fc gamma receptor vier tot expressie brachten robuust met ongeveer 14-voudig in vergelijking met kop-specifieke monoklonale en controle-IgG-antilichamen.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een experiment opzet om de eigenschap van specifieke antilichamen van belang om Fc-gemedieerde immuniteit te activeren te beoordelen.

a-method-to-assess-fc-mediated-effector-functions-induced-influenza

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een eenvoudige slot blot methode werd ontwikkeld voor de kwantificering van influenza virale hemagglutinine en neuraminidase met behulp van universele antilichamen gericht hun meest geconserveerde sequenties geïdentificeerd door middel van bioinformatica analyses. Deze innovatieve aanpak kan een nuttig alternatief voor de kwantitatieve bepaling van alle virale hemagglutinine en neuraminidase.

Kwantitatieve analyses van alle Influenza A Virale Hemagglutinins en neuraminidases gebruik van Universal Antistoffen Type in de eenvoudige Slot Blot Assays

Deze methode beschrijft het gebruik van Infrared kleurstofinkt imaging systeem voor detectie van H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) vloeistof van geïnfecteerde muizen op een hoog gevoeligheid. Deze methodologie kan worden uitgevoerd in een 96 - of 384-wells plaat, vereist &lt;10 pi volume van testmateriaal en heeft het potentieel voor gelijktijdige screening van meerdere pathogenen.

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

The video demonstrates a hemagglutination inhibition assay for detecting serum antibodies against specific antigens. Confirmation of hemagglutination inhibition in the test well and hemagglutination in the control well is achieved through distinct visual patterns. This assay plays a crucial role in assessing immune response, vaccine effectiveness, and studying viral infections in virology and immunology.

The Hemagglutination Inhibition Assay to Detect Serum Antibodies Against a Target Antigen

This video demonstrates an assay measuring the antibody-mediated activation of T cell effector functions. Adding an influenza virus hemagglutinin (HA)-specific monoclonal antibody to transfected mammalian cells expressing HA results in the formation of immune complexes with HA. Upon introducing engineered T cells expressing Fc receptors and a luciferase reporter, the T cells are activated by the antibody-HA complexes, and this activation is detected by adding a luciferase substrate and...

Measuring the Activation of Fc-Mediated Effector Functions by HA Antibodies

This video demonstrates an assay measuring influenza neuraminidase (NA) inhibiting antibody titers in a serum sample. A serum sample containing antibodies against NA is added to a fetuin-coated microwell plate. Upon adding the virus, the antibodies prevent viral NA from cleaving fetuin and exposing its galactose moiety. A peroxidase-conjugated lectin is then added, which binds to the exposed galactose. The NA-inhibiting antibody titer is determined using a colorimetric test, where a peroxidase...

An Assay to Measure Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers

Met behulp van een gedrukte glycaan-microarray-strategie werd een conventionele 96-wells plaat assay geminiaturiseerd voor analyse van hemagglutinine aviditeit en specificiteit voor sialic acid bevattende receptoren van het influenza A-virus.

Geminiaturiseerde Glycan Microarray Assay voor het beoordelen van Avidity en specificiteit van influenza A-virus hemagglutinine

We beschrijven de enzym-gekoppelde lectin-assay (ELLA) voor het meten van influenza-neuraminidase (NA)-remmingsantilichaam-titers in sera. De assay gebruikt pinda-agglutinine om galactoseresiduen te kwantificeren die toegankelijk worden wanneer NA siaalzuur verwijdert van fetuïne-gecoate, 96-well platen.

Meten Influenza neuraminidase Remming antilichaamtiters door Enzyme-linked lectine Assay

De gepresenteerde protocollen beschrijven het uitvoeren van een hemagglutination inhibitie-test om te kwantificeren van influenza-specifieke antilichamen titers van serummonsters van influenza vaccinontvangers. De eerste bepaling bepaalt optimale virusantigeen concentraties door hemagglutination. De tweede test kwantificeert influenza-specifieke antilichamen titers door inhibitie van de hemagglutination.

Een geoptimaliseerde Hemagglutination inhibitie (HI) Assay te kwantificeren van Influenza-specifieke antilichamen Titers

Influenza A virussen (IAVs) zijn belangrijke menselijke respiratoire pathogenen. Om te begrijpen van de pathogeniteit van IAVs en om de preklinische testen van nieuwe vaccin benaderingen, zijn diermodellen nabootsen menselijke fysiologie vereist. Hier beschrijven we technieken om IAV pathogenese, humorale reacties en vaccin werkzaamheid met behulp van een muismodel van infectie te evalueren.

Influenza-A Virus Studies in een muismodel van infectie

We presenteren een protocol voor het gebruik van een proteïne-Microarray die is geconstrueerd door het afdrukken van influenza-antigenen op nitrocellulose gecoate dia's om gelijktijdig sonde serum te gebruiken voor meervoudige antilichaam isotypes tegen meer dan 250 antigenen van verschillende virusstammen, dus het meten van de breedte van serum antilichamen over virus subtypen mogelijk te maken.

Gebruik van een influenza antigeen Microarray voor het meten van de breedte van serum antilichamen over de virus subtypen

Dit artikel beschrijft protocollen voor het evalueren van de Tfh- en GC B-respons in het muismodel van influenzavirusinfectie.

Evaluatie van T Folliculaire HelperCellen en Kiemcentrum Respons Tijdens Influenza A Virus Infectie bij Muizen

Leer Fc-gemedieerde effectorfuncties meten bij influenza hemagglutinine-specifieke antilichamen. Deze methode gebruikt HEK293-cellen en ADCC-assays voor snelle evaluatie van antilichaameffectiviteit binnen 24 uur.

Een methode om te beoordelen van Fc-gemedieerde Effector functies geïnduceerd door Influenza hemagglutinine specifieke antilichamen (Video) | JoVE Journal

Een methode om te beoordelen van Fc-gemedieerde Effector functies geïnduceerd door Influenza hemagglutinine specifieke antilichamen

Meer video's verkennen