Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme In Vitro van nitrosaminen door cytochroom P450s
25 september 2017
Α-hydroxylatie van kankerverwekkende nitrosaminen door cytochroom P450s is de geaccepteerde metabolische weg die produceert van DNA-beschadiging tussenproducten, die leiden mutaties tot. Nieuwe gegevens blijkt evenwel verdere oxidatie te nitrosamides kan optreden. We beschrijven een algemene methode voor het opsporen van nitrosamides vervaardigd uit in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen.
Het algemene doel van deze methodologie is om te bepalen of Cytochrome P450's n nitrosaminen processief kunnen oxideren tot n nitosamides in vitro. Deze methode komt de toxicologie ten goede door te evalueren of nitosaminen direct worden gemetaboliseerd tot nitrosamiden. Omdat nitrosamiden relatief stabiel zijn in gealkyleerd DNA, kunnen ze een rol spelen in carcinogenese.
Het grote voordeel van deze techniek is het gebruik van een zeer gevoelige massaspectrometer die detectielimieten geeft die lager zijn dan eerder bereikt voor vergelijkbare in vitro nitrosamine-metabolisme-assays. Om deze procedure te beginnen, plaatst u een ronde bodemkolf van 25 milliliter, met een magnetische roerder, in een oven. Droog gedurende 16 uur bij 140 graden Celsius.
Transfer de kolf vervolgens naar een afzuigkap en koel deze af onder een stroom stikstofgas. Voeg 31,8 milligram norcotinine, vijf milliliter azijnzuuranhydride en een milliliter azijnzuur toe aan de kolf en begin met roeren. Breng de kolf over in een ijs-waterbad.
Voeg 33,3 milligram natriumnitriet toe. Blijf roeren gedurende 2,5 uur en giet vervolgens de reactie in 18 milliliter ijswater om de reactie te stoppen. Breng de oplossing onmiddellijk over in een afscheidingsnelheid die 18 milliliter DCM bevat, en extraheer de waterige oplossing.
Extraheer de waterige laag nog twee keer, gebruik elke keer 9 milliliter DCM. Droog vervolgens de gepoolde organica gedurende twee minuten over 100 milligram magnesiumsulfaat. Na het filteren, gebruik een roterende verdamper om de oplossing bij 30 graden Celsius te concentreren tot een ruwe gele olie.
Zuiver het ruwe compound door middel van kolomchromatografie zoals beschreven in het tekstprotocol. Los vervolgens het zuivere compound op in één milliliter gedeutereerd chloroform. Bevestig met NMR de structuur en molariteit van de oplossing zoals beschreven in het tekstprotocol.
Bewaar deze oplossing in het donker bij een temperatuur tussen twee en acht graden Celsius totdat deze nodig is. Bevestig vervolgens de nauwkeurige oudermassa en bepaal de product-ionenmassa's van de zuivere NNC-oplossing door directe infusie op een hoog-resolutie massaspectrometer, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om te beginnen, haal de benodigde reagentia uit een vriezer van 80 graden Celsius en laat ze op ijs ontdooien.
Eenmaal ontdooid, verdun de Baculosomes in NADPH-regeneratiesysteem 1-10 en 1-50 respectievelijk in een een-milliliterbuis met een 0,5-sterkte reactiebuffer. Voeg vervolgens drie microliter van de NADP-stockoplossing toe aan een een-milliliterbuis die 97 microliter van een 0,5-sterkte reactiebuffer bevat. Voor elke incubatie, bereid een een-milliliterbuis voor door 40 microliter van een vier micromolaire NNN-oplossing gemaakt met reactiebuffer toe te voegen.
Voeg 50 microliter enzymoplossing toe die vijf picomolen P450 2A6 bevat aan elke buis. Preincubeer in een waterbad gedurende twee minuten bij 37 graden. Voeg vervolgens 10 microliter verdunde NADP+-oplossing toe aan elke buis.
Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende een periode van één tot 30 minuten. Voeg vervolgens eerst 10 microliter 3,0 normale zinksulfaatoplossing toe en vervolgens 10 microliter 3,0 normale bariumhydroxideoplossing om de reactie te stoppen. Vortex de oplossing om een wit precipitaat te vormen.
Centrifugeer vervolgens gedurende vier minuten bij achtduizend G's. Verzamel onmiddellijk de supernatant en analyseer twee microliters met vloeistofchromatografie positieve nano-elektrospray-ionisatie hoog-resolutie tandem massaspectrometrie. In deze studie wordt norcotinine schoner en met een hoge opbrengst naar NNC genitroseerd, waardoor een standaard ontstaat voor gebruik in het in vitro-experiment.
Het succes van de reactie wordt bevestigd door spectroscopische analyse, inclusief hoog-resolutie tandem massaspectrometrie, die bevestigde dat de massa van de ouder binnen vijf delen per miljoen van de theoretische waarde ligt. Tandem massaspectrometrie-fragmentatie van NNC wordt vervolgens gebruikt om de meest voorkomende product-ionenmassa's te bepalen. Zoals te zien is, zijn de twee meest voorkomende product-ionen 134 en 162, met nauwkeurige massadetectie tot op vijf decimalen.
Het gesynthetiseerde NNC wordt vervolgens gebruikt als standaard voor de in vitro P450-metabolisme-assay. Onder de gebruikte omstandigheden, eluteert synthetisch NNC ongeveer 17,5 minuten, met goed opgeloste pieken in zowel de ouder-ion als product-ion kanalen. In overeenstemming met de positieve controle, wordt NNC-vorming gezien in de één minuut, vijf minuten en 10 minuten incubaties.
Als correct uitgevoerd, kan de nitrosamide-synthese in de spectroscopische analyse ongeveer zes uur duren. Evenzo, zou de in vitro-test met meerdere incubaties niet meer dan acht uur moeten duren. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar risicobeoordeling voor tabaksgerelateerde kankers, omdat meting van nitrosamide-gerelateerde biomarkers informatief kan zijn over individuele nitrosamine-activering.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat enzym-incubaties snel moeten worden verwerkt. Nitrosamiden hydrolyseren onder deze omstandigheden en mogen niet lang wachten voordat ze worden geanalyseerd met massaspectrometrie. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u nitrosamide-standaarden bereidt en evalueert of ze in vitro worden gevormd door het juiste nitrosamine cytochroom P450-systeem.
Vergeet niet dat werken met NNN, NNC of verwante kankerverwekkende stoffen gevaarlijk kan zijn. Deze verbindingen moeten altijd worden behandeld in een afzuigkap terwijl u een laboratoriumjas, veiligheidsbril en handschoenen draagt. Bovendien moet al het kankerverwekkende afval goed worden bewaard en geëtiketteerd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de metabole route van nitrosaminen door cytochroom P450's, met de focus op de oxidatie tot nitrosamiden. De methodologie is erop gericht de procesiviteit van deze reactie in vitro te bepalen, wat implicaties kan hebben voor het begrip van carcinogenese.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Toxicologie
- Kankeronderzoek
- Biochemie
Achtergrond
- Nitrosamines zijn bekende carcinogenen die kunnen leiden tot DNA-schade.
- Cytochroom P450's zijn enzymen die diverse verbindingen metaboliseren, waaronder nitrosamines.
- Nitrosamiden, gevormd uit nitrosamines, zijn stabiel en kunnen bijdragen aan carcinogenese.
- Eerdere methoden waren onvoldoende gevoelig voor het detecteren van het metabolisme van nitrosamines.
Doel van de studie
- Om de metabole omzetting van nitrosaminen naar nitrosamiden door cytochroom P450's te evalueren.
- Om de implicaties van de stabiliteit van nitrosamiden bij DNA-alkylering te beoordelen.
- Om detectiemethoden voor het metabolisme van nitrosaminen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een zeer gevoelige massaspectrometer voor detectie.
- In vitro assays om de metabole route te bestuderen.
- Bereiding van reactiemengsels in een gecontroleerde omgeving.
- Monitoring van reactieproducten om nitrosamiden te identificeren.
Belangrijkste resultaten
- Aangetoond dat cytochroom P450's nitrosamines kunnen oxideren tot nitrosamiden.
- Een methode vastgesteld met lagere detectielimieten voor het metabolisme van nitrosamines.
- Bewijs geleverd voor de potentiële rol van nitrosamiden bij carcinogenese.
- De significantie van deze metabole route in de toxicologie benadrukt.
Conclusies
- De studie bevestigt de metabole omzetting van nitrosaminen naar nitrosamiden.
- De bevindingen suggereren dat verder onderzoek naar de implicaties voor het kankerrisico noodzakelijk is.
- De ontwikkelde methodologie kan toekomstige toxicologische beoordelingen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
De detectie van nitrosamidevorming tijdens het door cytochroom P450 gemedieerde nitrosaminemetabolisme vult een kritisch gat in de toxicologische risicobeoordeling en mechanistische risicoreductie voor carcinogeniteit. Massaspectrometrie met hoge gevoeligheid maakt een nauwkeurige kwantificering van mineure metabolieten mogelijk, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij vroege gevarenidentificatie. Deze workflow dient als basis voor beslissingen op portefeuilleniveau over de voortgang van verbindingen en veiligheidsprofielen in pipelines in de ontdekkingsfase.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het onderzoeken van metabole activatiepaden voor carcinogenen afgeleid van nitrosaminen mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de rol van nitrosamiden bij DNA-alkylering te verduidelijken.
- Biedt functioneel bewijs voor targetvalidatie bij toxicologie-gestuurde triage van verbindingen.
Screening & assayontwikkeling
- Stelt gevalideerde in vitro-systemen vast voor reproduceerbare detectie van nitrosamide-metabolieten.
- Levert kwantitatieve read-outs met een hoge gevoeligheid voor downstream screening-workflows.
- Faciliteert assay-standaardisatie en hergebruik van platformen over verschillende nitrosamine-P450-combinaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sychroniseert de detectie van metabole biomarkers met translationele risicobeoordeling voor carcinogeniciteit.
- Maakt continuïteit mogelijk van in vitro ontdekking tot preklinische toxicologistudies.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling op basis van mechanistisch bewijs.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het vroege continuüm van discovery naar preklinisch onderzoek, waarbij een brug wordt geslagen tussen de elucidatie van metabole routes en de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Discovery Biology: Biedt robuuste hypothesetoetsing voor metabolische activatie en pathway-verduidelijking.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de detectie en vergelijking van metabolieten.
- Analytics: Maakt gebruik van hoge-resolutie massaspectrometrie voor gevoelige en nauwkeurige meting van metabolieten.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro bevindingen met preklinische biomarkerstrategieën voor carcinogeen risico.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Biedt een generaliseerbare workflow voor diverse evaluaties van nitrosaminen en P450-systemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij carcinogeniteitsbeoordelingen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de detectie van metabolieten met schaalbare, reproduceerbare protocollen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risico-identificatie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van kandidaatverbindingen mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in enzymologie, analytische chemie en massaspectrometrie.
- Vereist toegang tot LC-MS/MS-instrumentatie met hoge resolutie en gevalideerde standaarden.
- Stelt standaardisatie tussen teams vereist voor de reproduceerbaarheid van assays en de vergelijkbaarheid van gegevens.
- Protocollen moeten worden aangepast voor verschillende nitrosamine-substraten en P450-isovormen.
- Zorgvuldige behandeling en snelle verwerking zijn essentieel vanwege de instabiliteit van nitrosamiden.
