Name: Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme In Vitro van nitrosaminen door cytochroom P450s (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Leer een gevoelige methode voor het detecteren van nitrosamide-vorming in het metabolisme van nitrosaminen door cytochroom P450s in vitro. Deze techniek verbetert toxicologisch onderzoek naar kankerverwekkende mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de subsidie geen. CA-81301 van het National Cancer Institute. Wij danken Bob Carlson voor redactionele ondersteuning, Dr. Peter Villalta en Xun Ming voor de bijstandsverlening van de Spectrometrie van de massa in de analytische biochemie gedeelde Resource van de vrijmetselaars Cancer Center, en Dr. Adam T. Zarth en Dr. Anna K. Michel voor hun waardevolle discussies en input. De analytische biochemie gedeelde Resource wordt gedeeltelijk ondersteund door nationaal kanker instituut Cancer Center ondersteuning Grant CA-77598

1. materialen en algemene procedures <ol><li>Synthesize NNN 15 zoals hiervoor is beschreven. Verkrijgen van norcotinine, P450 2A6 Baculosomes NADPH regeneratie systeem, 0.5 x reactie buffer en alle andere chemicaliën of oplosmiddelen uit commerciële bronnen in het reagens rang.</li>
	<li>Record NMR spectra op een 500 MHz spectrometer. Verslag chemische verschuivingen als delen per miljoen (ppm). Gebruik van residuele oplosmiddelen pieken als interne verwijzingen voor 1 H-NMR (7.26 ppm CDCl 3) en 13 C-NMR (77,2 ppm CDCl 3). 
	Opmerking: Peak splitsen de volgende afkortingen gebruikt: s singlet, d = doublet, dd = = doublet van paren, dt = doublet van de drieling, dq = doublet van kwartetten, ddd = doublet van doublet van paren en m = multiplet.</li>
	<li>Hoge resolutie massa spectrometrie (HRMS) uitvoeren voor de geselecteerde verbindingen op een LTQ Orbitrap Velos en rapportgegevens als m/z.</li>
	<li>Gebruik polygram vooraf gecoat silicagel TLC platen (40 mm x 80 mm, 0.2 mm dik) met 254 nm fluorescerende indicator voor dunne-laag chromatografie (TLC). Visualiseren van TLC platen door UV lamp bestraling.</li>
	<li>Flash chromatografie uitvoeren op een 60 Å, 70-150 mesh silica gel met behulp van een glazen kolom van 1,5 cm x 15 cm.</li>
</ol> 2. Voorbereiding van de positieve controle nitrosamide (N &#8242;-nitrosonorcotinine, NNC) <ol><li>droge, in een oven's nachts (16 h, ~ 140 ° C), een 25 mL, Rondbodemkolf met een magnetische roer bar. In de ochtend, cool de kolf onder een stroom van N 2 terwijl het gebruiken van een waterpijp olie te houden van de N 2 stroom stem onder een zeepbel per seconde. 
	Let op: Na afkoeling geen voorzorgsmaatregelen te houden van de erlenmeyer onder N 2 zijn verplicht.</li>
	<li>In een zuurkast, norcotinine (31.8 mg, 0.196 mmol), azijnzuur-anhydride (5 mL) en azijnzuur (1 mL) toevoegen aan de afgekoelde maatkolf. Roer dit mengsel continu onder afkoeling tot 0 ° C met een water-ijsbad. 
	Let op: Azijnzuur-anhydride en azijnzuur zijn bijtende.</li>
	<li>Toevoegen NaNO 2 (33.3 mg, 0.483 mmol) in één gedeelte en continu roer het mengsel voor 2.5 h. reactie voortgang door TLC (100% EtOAc, R f = 0,19, zie stap 1.4). 
	Opmerking: Gedurende deze tijd, het mengsel zal worden steeds geel met af en toe borrelt.</li>
	<li>Quench de reactie door het gieten van het mengsel in ijskoude H 2 O (18 mL). Onmiddellijk pak de waterige oplossing met 18 mL CH 2 Cl 2 in een 100 mL separatory trechter. Pak de waterige laag ten minste 2 extra keer met CH 2 Cl 2 (9 mL elk).</li>
	<li>De gepoolde organics meer dan ~ 100 mg MgSO 4 voor 2 min. Filter droog en het concentreren van de oplossing door roterende verdamping een ruwe, gele olie opleveren. Verwarm het waterbad tot 30 ° C tijdens verdamping te verwijderen van de resterende azijnzuur. 
	Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken hier als de stof wordt opgelost in CH 2 Cl 2 en de oplossing die is opgeslagen in het donker bij 2-8 ° C.</li>
	<li>Zuiveren de ruwe compound door kolom-chromatografie (zie stap 1.5) met behulp van silica gel als de stationaire fase en 100% EtOAc als het eluens 16. 
	Let op: NNC en verwante nitrosamides moet voorzichtig behandeld worden als ze wordt aangenomen dat menselijke carcinogenen.</li>
	<li>Los van de pure stof in CDCl 3 en gebruiken van NMR (zie stap 1.2) om te bevestigen de structuur en de molarity van deze oplossing 17 bepalen. Bewaar deze oplossing in het donker bij 2-8 ° C totdat nodig. 
	Opmerking: Deze oplossing zal worden gebruikt als positieve controle in de in vitro assay (stap 3.5). NMR spectra en chemische shifts zijn beschikbaar in de ondersteunende informatie.</li>
	<li>Met een zuivere oplossing van de NNC, bevestigen de nauwkeurige parent massa en product ion massa bepalen door directe infusie op een hoge resolutie massaspectrometer (HRMS) onder parameters beschreven in stap 1.3 en 4.3. 
	Opmerking: Massa van het Product zal worden gebruikt voor het opsporen van dit samengestelde in de in vitro metabolisme assay (stap 4.3).</li>
</ol> 3. Een voorbeeld nitrosamine-P450 in vitro incubatie <ol><li>P450 2A6 Baculosomes, Vivid-NADPH-regeneratie systeem en 10 mM NADP + Stock oplossing verwijderen uit een vriezer-80 ° C en laat ze ontdooien op ijs. Eenmaal ontdooid, Verdun de Baculosomes en NADPH-regeneratie systeem 1:10 en 1:50, respectievelijk, in een enkele 1 mL-buis met 0,5 X reactie Buffer. Op dezelfde manier toevoegen 3 μL van de NADP + Stock oplossing aan 97 μL van 0,5 X reactie Buffer. 
	Opmerking: NADP + is lichtgevoelig. Bewaar deze oplossing beschermd door de container te wikkelen in aluminiumfolie. Enzym oplossingen zijn gevoelig voor bevriezen-ontdooien cycli; dit te beperken tot niet meer dan 2 cycli. Bereiden aliquots als nodig is voor toekomstige experimenten.</li>
	<li>Voor elke incubatie, voeg 50 μl van enzym-oplossing (met 5 pmol P450) tot een 1 mL tube met 40 μL van 4 μM NNN oplossing gemaakt met reactie Buffer. Vooraf Incubeer dit nieuwe mengsel gedurende 2 minuten bij 37 ° C met behulp van een waterbad en voeg vervolgens 10 μL van verdunde NADP +-oplossing. Incubeer het volledige systeem voor 1-30 min op 37 ° C. 
	Opmerking: Het gebruik van 5-min intervallen voor incubatie keer (bijvoorbeeld 5, 10, 15 min, etc.) zorgt voor een voldoende nitrosamide formatie tijdsverloop.</li>
	<li>Na de gewenste incubatietijd, doven door eerste toevoegen 10 μl van 3.0 N ZnSO 4 en vervolgens 10 μL van 3.0 N Ba(OH) 2. Vortex deze oplossing en een witte neerslag zal vormen. Centrifugeer het monster bij 8000 x g voor 4 min aan de neerslag pellet. 
	Opmerking: De procedure moet niet onderbreken bij deze stap als de gevormde nitrosamides hebben beperkte stabiliteit in waterige oplossingen. Lange pauzes kunnen leiden tot valse negatieven.</li>
	<li>Onmiddellijk Pipetteer het supernatant en 2 μL analyseren door vloeistofchromatografie positieve nanoelectrospray-ionisatie high-resolution tandem massaspectrometrie (LC-NSI +-HRMS/MS, stappen 4.1-4.3).</li>
	<li>Voor positieve controle incubations, verdampen een aliquoot gedeelte met 100 fmol van gesynthetiseerde NNC-oplossing in een buis 1 mL onder een stroom van N-2. Deze injectieflacon, de volledige enzymsysteem uit stap 3.2 toevoegen en ga verder zoals beschreven voor stappen 3.3-3.4.</li>
	<li>Voor de negatieve controle incubations, uitvoeren van het experiment beschreven (stap 3.2-3.4) behalve vervangen de 50 μl enzym oplossing met 0,5 X reactie buffer.</li>
</ol> 4. Voorbeeld van de parameters voor de detectie van de nitrosamide door LC-NSI +-HRMS/MS <ol><li>voor de LC-component, de volgende scriptingregel verloop in stap 4.2 toepassen op een systeem van de UPLC met behulp van een commerciële, hand boordevol 18 C18 (5 μm), 100 mm x 75 μm, 15 μm opening capillaire kolom.</li>
	<li>Met behulp van 5 mM, NH 4 OAc als oplosmiddel A en acetonitril als oplosmiddel B, laadt het monster op de kolom door op 5% B op 1 l/min van 0 - 5 min en dan vertraagt het debiet aan 0,3 μl/min daarna. Voer vervolgens een verloop van 5 tot 20% B meer dan 4 min, gevolgd door een oprit naar 55% B meer dan 10 min, en vervolgens opnieuw evenwichtsinstelling tot 5% B.</li>
	<li>Voeren de LC-NSI +-HRMS/MS op een LTQ Orbitrap. Monitor voor NNC door zowel volledige scan en MS 2 fragmentatie. Volledige scannen bij een resolutie van 60.000 en haal de nauwkeurige bovenliggende massa (192.07670) op een massale tolerantie van 5 ppm. Gebruik MS 2 fragmentatie te isoleren van bovenliggende ionen (2.0 amu) en de fragment door botsing-geïnduceerde dissociatie (CID) met de energie van een botsing van 25 eV, resolutie van 15.000, en scan tijd van 30 ms. Extract de nauwkeurige massa's voor product ionen van NNC (m/z 192 m/z 134.04739 en 162.07874) bij een massale tolerantie van 5 ppm.</li>
</ol>

<ol><li>Rom, W. N., Markowitz, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRom%2C+WN+%22Environmental+and+Occupational+Medicine%22">Environmental and Occupational Medicine</a>. , 4th ed, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. 1226-1239 (2007).</li>
<li>Preussmann, R., Stewart, B. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPreussmann%2C+R+%22Chemical+Carcinogens%2C+ACS+Monograph+182%22">Chemical Carcinogens, ACS Monograph 182</a>. Searle, C. E. 2, 2nd ed, American Chemical Society. 643-828 (1984).</li>
<li>Magee, P. N., Montesano, R., Preussmann, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMagee%2C+PN+%22Chemical+Carcinogens.+ACS+monograph+173%22">Chemical Carcinogens. ACS monograph 173</a>. Searle, C. E. , American Chemical Society. 491-625 (1976).</li>
<li>Zhu, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alaska+Native+smokers+and+smokeless+tobacco+users+with+slower+CYP2A6+activity+have+lower+tobacco+consumption%2C+lower+tobacco-specific+nitrosamine+exposure+and+lower+tobacco-specific+nitrosamine+bioactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Alaska Native smokers and smokeless tobacco users with slower CYP2A6 activity have lower tobacco consumption, lower tobacco-specific nitrosamine exposure and lower tobacco-specific nitrosamine bioactivation.</a> Carcinogenesis. 34 (1), 93-101 (2013).</li>
<li>Mesić, M., Revis, C., Fishbein, J. C. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja961178h">Effects of structure on the reactivity of alpha-hydroxydialkynitrosamines in aqueous solutions.</a> J. Am. Chem. Soc. 118, 7412-7413 (1996).</li>
<li>Mochizuki, M., Anjo, T., Okada, M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0040403900787478">Isolation and characterization of N-alkyl-N- (hydroxymethyl)nitrosamines from N-alkyl-N- (hydroperoxymethyl)nitrosamines by deoxygenation.</a> Tetrahedron Lett. 21, 3693-3696 (1980).</li>
<li>Guttenplan, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cytosol+on+mutagenesis+induced+by+N-nitrosodimethylamine%2C+N-nitrosomethylurea+and+%C3%A0-acetoxy-N-nitrosodimethylamine+in+different+strains+of+Salmonella%3Aevidence+for+different+ultimate+mutagens+from+N-nitrosodimethylmine%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Effects of cytosol on mutagenesis induced by N-nitrosodimethylamine, N-nitrosomethylurea and à-acetoxy-N-nitrosodimethylamine in different strains of Salmonella:evidence for different ultimate mutagens from N-nitrosodimethylmine.</a> Carcinogenesis. 14, 1013-1019 (1993).</li>
<li>Elespuru, R. K., Saavedra, J. E., Kovatch, R. M., Lijinsky, W. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/carcin/article-abstract/14/6/1189/297752/Examination-of-carbonyl-derivatives-of?redirectedFrom=fulltext">Examination of a-carbonyl derivatives of nitrosodimethylamine in ethylnitrosomethyamine as putative proximate carcinogens.</a> Carcinogenesis. 14, 1189-1193 (1993).</li>
<li>Chow, Y. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChow%2C+YL+%22ACS+Symposium+Series%22">ACS Symposium Series</a>. 101, American Chemical Society. 13-37 (1979).</li>
<li>von Weymarn, L. B., Retzlaff, C., Murphy, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2A6-+and+CYP2A13-catalyzed+metabolism+of+the+nicotine+delta5%27%281%27%29iminium+ion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">CYP2A6- and CYP2A13-catalyzed metabolism of the nicotine delta5'(1')iminium ion.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 343 (2), 307-315 (2012).</li>
<li>Bell-Parikh, L. C., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+cytochrome+P450+2E1-catalyzed+oxidation+of+ethanol+to+acetic+acid+via+acetaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetics of cytochrome P450 2E1-catalyzed oxidation of ethanol to acetic acid via acetaldehyde.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23833-23840 (1999).</li>
<li>Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Nagy, L. D., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+methyl+and+ethyl+nitrosamines+by+cytochrome+P450+2E1+and+2B1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidation of methyl and ethyl nitrosamines by cytochrome P450 2E1 and 2B1.</a> Biochemistry. 51 (50), 9995-10007 (2012).</li>
<li>Chowdhury, G., Calcutt, M. W., Guengerich, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+N-nitrosoalkylamines+by+human+cytochrome+P450+2A6%3A+sequential+oxidation+to+aldehydes+and+carboxylic+acids+and+analysis+of+reaction+steps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxidation of N-nitrosoalkylamines by human cytochrome P450 2A6: sequential oxidation to aldehydes and carboxylic acids and analysis of reaction steps.</a> J Biol Chem. 285 (11), 8031-8044 (2010).</li>
<li>Carlson, E. S., Upadhyaya, P., Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+nitrosamide+formation+in+the+cytochrome+P450-mediated+metabolism+of+tobacco-specific+nitrosamines%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Res+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of nitrosamide formation in the cytochrome P450-mediated metabolism of tobacco-specific nitrosamines.</a> Chem Res Toxicol. 29 (12), 2194-2205 (2016).</li>
<li>Amin, S., Desai, D., Hecht, S. S., Hoffmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+tobacco-specific+N-nitrosamines+and+their+metabolites+and+results+of+related+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of tobacco-specific N-nitrosamines and their metabolites and results of related bioassays.</a> Crit. Rev. Toxicol. 26, 139-147 (1996).</li>
<li>Clark, A. G., Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+chromatographic+technique+for+the+detection+of+dye-binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid chromatographic technique for the detection of dye-binding.</a> Anal Biochem. 89 (2), 317-323 (1978).</li>
<li>Pauli, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+purity+evaluation+and+the+potential+of+quantitative+%281%29H+NMR+as+a+purity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Importance of purity evaluation and the potential of quantitative (1)H NMR as a purity assay.</a> J Med Chem. 57 (22), 9220-9231 (2014).</li>
<li>van der Heeft, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microcapillary+column+switching+HPLC-electrospray+ionization+MS+system+for+the+direct+identification+of+peptides+presented+by+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A microcapillary column switching HPLC-electrospray ionization MS system for the direct identification of peptides presented by major histocompatibility complex class I molecules.</a> Anal Chem. 70 (18), 3742-3751 (1998).</li>
<li>White, E. H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01627a063">The Chemistry of the N-Alkyl-N-nitrosoamides. I. Methods of Preparation.</a> J. Am. Chem. Soc. 77, 6008-6010 (1955).</li>
<li>Patten, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cytochrome+P450+2A6+and+3A4+as+major+catalysts+for+N%27-nitrosonornicotine+alpha-hydroxylation+by+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Evidence for cytochrome P450 2A6 and 3A4 as major catalysts for N'-nitrosonornicotine alpha-hydroxylation by human liver microsomes.</a> Carcinogenesis. 18, 1623-1630 (1997).</li>
<li>Wong, H. L., Murphy, S. E., Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+2A-catalyzed+metabolic+activation+of+structurally+similar+carcinogenic+nitrosamines%3A+N%27-nitrosonornicotine+enantiomers%2C+N-nitrosopiperidine%2C+and+N-nitrosopyrrolidine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 2A-catalyzed metabolic activation of structurally similar carcinogenic nitrosamines: N'-nitrosonornicotine enantiomers, N-nitrosopiperidine, and N-nitrosopyrrolidine.</a> Chem. Res. Toxicol. 18, 61-69 (2004).</li>
<li>Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%2C+biology%2C+and+carcinogenicity+of+tobacco-specific+N-nitrosamines%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Biochemistry, biology, and carcinogenicity of tobacco-specific N-nitrosamines.</a> Chem. Res. Toxicol. 11, 559-603 (1998).</li>
<li>von Weymarn, L. B., Zhang, Q. Y., Ding, X., Hollenberg, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+8-methoxypsoralen+on+cytochrome+P450+2A13%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Effects of 8-methoxypsoralen on cytochrome P450 2A13.</a> Carcinogenesis. 26 (3), 621-629 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Ophelderen van het metabolisme van nitrosaminen is een essentieel onderdeel voor het begrip van hun carcinogeniteit. Aangezien de betrokken cytochroom P450s en andere metabole enzymen polymorf zijn, verder is toepassing van deze kennis kon potentieel identificeren hoog risico personen1,4. Nieuwe data geeft aan dat verdere oxidatie van α-hydroxynitrosamines, de vermoedelijke belangrijkste metabolieten van nitrosaminen betrokken in het DNA binden, nitrosamides is m...

N-nitrosaminen vormen een grote klasse van kankerverwekkende stoffen gevonden in het dieet, tabaksproducten en het algemene klimaat; ze kunnen ook endogeen worden gevormd in het menselijk lichaam1. Meer dan 300 N -nitroso verbindingen zijn getest en &#62; 90% werden geëvalueerd als kankerverwekkend in diermodellen2,3. Om te exposeren hun carcinogeniteit, moeten deze verbindingen eerst worden geactiveerd door cytochroom P450s1,2,3. Onderzoek toont aan dat cytochroom P450s gemakkelijk oxideren nitrosaminen naar α-hydroxynitrosamines (Figuur 1), die zeer reactieve verbindingen met half-leven van ~ 5 zijn s voordat spontaan ontbindend te alkyldiazohydroxides. De laatste kan DNA na het verlies van H2O en N2alkylate. De resulterende DNA adducten, als herstelde, mutaties, die als kritische onco- of tumor suppressor genen, tot kanker ontwikkeling1 leidenkunnen veroorzaken. Om deze reden veel moeite heeft zijn uitgegeven om het verwerven van een volledig begrip van de metabole routes, DNA adducten, en stroomafwaarts metabolieten van cytochroom P450 oxidatie van kankerverwekkende nitrosaminen. Deze kennis heeft potentiële toepassing in individuele kanker risico beoordeling4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56312/56312fig1.jpg"> 
Figuur 1: Algemeen en voorgestelde metabolisme van nitrosaminen. Nitrosaminen (1) zijn geoxideerd door P450s tot α-hydroxynitrosamines (2) die spontaan tot alkyldiazohydroxides (3 ontleden). Deze verbindingen kunnen binden aan DNA aan formulier die DNA adducten. Het is veronderstelde dat 2 zijn verder geoxideerd door P450s tot nitrosamides 4. Deze kunnen direct binden aan DNA aan formulier nieuwe DNA adducten of worden gehydrolyseerd tot 3 aan formulier die bekende DNA adducten. R1 en R2 vertegenwoordigen een alkyl-groep. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56312/56312fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Hoewel de α-hydroxynitrosamine hypothese is stevig ondersteund door uitgebreide gegevens, zijn er enkele tegenstrijdigheden; een groot probleem is de korte halfwaardetijd van α-hydroxynitrosamines5,6. Het is bekend dat deze stoffen worden geproduceerd op het membraan van het endoplasmatisch reticulum en later nucleaire DNA alkylate. Gezien hun leven voor een paar seconden, is het puzzelen hoe deze tussenproducten overleven de vereiste reizen al het cytosol. Een hypothese is dat een deel van de α-hydroxynitrosamines processively zijn geoxideerd tot nitrosamides7,8, die zijn vrij stabiel in vergelijking9. Dit gebeurt vermoedelijk via retentie van α-hydroxynitrosamines in de cytochroom P450 actieve site. Precedent voor dit soort oxidatie gesignaleerd met nicotine10, alcoholen11en eenvoudige alkylnitrosamines12,13. Daarnaast zijn de nitrosamides direct-acting kankerverwekkende stoffen2,3. Op basis van hun reactiviteit9, worden deze verbindingen verondersteld tot DNA adducten identiek zijn aan die welke voortvloeien uit α-hydroxynitrosamines samen met nieuw, onontgonnen DNA adducten (Figuur 1). Dus deze hypothese verklaart niet alleen het vervoer via het cytosol, maar ook de vorming van DNA schade aan producten.
In deze paper wordt een algemeen protocol voor de beoordeling van het in vitro cytochroom P450-gemedieerde conversie van nitrosaminen naar nitrosamides beschreven. De eerder gerapporteerde conversie van N′- nitrosonornicotine (NNN) naar N′- nitrosonorcotinine (NNC) door cytochroom P450 2A6 is tentoongesteld als een voorbeeld14. Toepassing van dit protocol tot een brede waaier van substraat-enzym systemen zal medebepalend zijn voor het belang van nitrosamides in algemene nitrosamine metabolisme.

<table><tbody><tr><td>Norcotinine</td><td>AKoS GmbH (Steinen, Germany)</td><td>CAS 17708-87-1, AKoS AK0S006278969</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuuranhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242845</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431311</td><td></td></tr><tr><td>Bariumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>433373</td><td></td></tr><tr><td>D-Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151823</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Methyleenchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34856</td><td></td></tr><tr><td>Natriumnitriet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>ViVid CYP2A6 Blue Screening Kit</td><td>Life Technologies</td><td>PV6140</td><td></td></tr><tr><td>Zinksulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221376</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL buizen</td><td>Fisher</td><td>AB0533</td><td></td></tr><tr><td>100 mL ronde bodemfles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z510424</td><td></td></tr><tr><td>125 mL Erlenmeyer kolf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4980125</td><td></td></tr><tr><td>125 mL Scheider</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z261017</td><td></td></tr><tr><td>25 mL ronde bodemfles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278262</td><td></td></tr><tr><td>500 MHz NMR Spectrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-22R Centrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC vials</td><td>ChromTech</td><td>CTC&ndash;0957&ndash;BOND</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magneet roerstaaf</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z127035</td><td></td></tr><tr><td>NMR buis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274682</td><td></td></tr><tr><td>P1000, P200 en P10 pipetten</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roterende verdamper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z691410</td><td></td></tr><tr><td>RSLCnano UPLC systeem</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schuddende waterbad</td><td>Fisher</td><td>FSSWB15</td><td></td></tr><tr><td>Roerplaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6795420</td><td></td></tr><tr><td>PicoFrit Kolom</td><td>New Objective</td><td>PF3607515N5</td><td></td></tr><tr><td>Luna C18, 5 um</td><td>Phenomenex</td><td>535913-1</td><td></td></tr></tbody></table>

een algemene methode voor het opsporen van nitrosamide-formatie in het metabolisme in vitro van nitrosaminen door cytochroom p450s

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

N-nitrosaminen zijn een gevestigde groep van milieu kankerverwekkende stoffen, waarvoor cytochroom P450 oxidatie activiteit vertonen. De aanvaarde mechanisme van metabole activering omvat vorming van α-hydroxynitrosamines die spontaan aan DNA alkylerend agentia ontleden. Accumulatie van DNA-beschadiging en de resulterende mutaties kan uiteindelijk leiden tot kanker. Nieuw bewijs geeft aan dat α-hydroxynitrosamines kan worden verder geoxideerd tot nitrosamides processively door cytochroom P450s. Omdat nitrosamides over het algemeen stabieler dan α-hydroxynitrosamines zijn en kan ook DNA alkylate, kan nitrosamides een rol spelen in carcinogenese. In dit verslag beschrijven we een algemeen protocol voor de evaluatie van de nitrosamide productie van in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen. Dit protocol maakt gebruik van een algemene aanpak van de synthese van de relevante nitrosamides en een in vitro cytochroom P450 metabolisme bepaling met behulp van vloeibare chromatografie-nanospray ionisatie-hoge resolutie tandem massaspectrometrie voor de detectie. Deze methode ontdekt N′- nitrosonorcotinine als een minder belangrijke metaboliet van N′- nitrosonornicotine in de voorbeeld-studie. De methode heeft hoge gevoeligheid en selectief moeten nauwkeurige detectie van de massa. Toepassing van deze methode op een breed scala aan nitrosamine-cytochroom P450 systemen zal medebepalend zijn voor de algemene strekking van deze transformatie. Omdat cytochroom P450s polymorf zijn en in activiteit variëren, zou een beter begrip van de vorming van de nitrosamide helpen bij het individuele kanker risico-evaluatie.

Gebaseerd op het werk van witte et al. 19, norcotinine was nitrosoderivaten aan NNC netjes en in hoog rendement (80-92%) tot een standaard voor het experiment in vitro . Structurele bewijs voor een succesvolle reactie was verkregen van spectroscopische analyses, met inbegrip van 1H-NMR, 13C-NMR, GEZELLIGE en HSQC (ondersteunende informatie) samen met HRMS die bevestigd de bovenliggende massa [M + H]+ binnen 5 ppm v...

Α-hydroxylatie van kankerverwekkende nitrosaminen door cytochroom P450s is de geaccepteerde metabolische weg die produceert van DNA-beschadiging tussenproducten, die leiden mutaties tot. Nieuwe gegevens blijkt evenwel verdere oxidatie te nitrosamides kan optreden. We beschrijven een algemene methode voor het opsporen van nitrosamides vervaardigd uit in vitro cytochroom P450-gekatalyseerde metabolisme van nitrosaminen.

Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme In Vitro van nitrosaminen door cytochroom P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Het algemene doel van deze methodologie is om te bepalen of Cytochrome P450's n nitrosaminen processief kunnen oxideren tot n nitosamides in vitro. Deze methode komt de toxicologie ten goede door te evalueren of nitosaminen direct worden gemetaboliseerd tot nitrosamiden. Omdat nitrosamiden relatief stabiel zijn in gealkyleerd DNA, kunnen ze een rol spelen in carcinogenese.Het grote voordeel van deze techniek is het gebruik van een zeer gevoelige massaspectrometer die detectielimieten geeft die lager zijn dan eerder bereikt voor vergelijkbare in vitro nitrosamine-metabolisme-assays. Om deze procedure te beginnen, plaatst u een ronde bodemkolf van 25 milliliter, met een magnetische roerder, in een oven. Droog gedurende 16 uur bij 140 graden Celsius.Transfer de kolf vervolgens naar een afzuigkap en koel deze af onder een stroom stikstofgas. Voeg 31,8 milligram norcotinine, vijf milliliter azijnzuuranhydride en een milliliter azijnzuur toe aan de kolf en begin met roeren. Breng de kolf over in een ijs-waterbad.Voeg 33,3 milligram natriumnitriet toe. Blijf roeren gedurende 2,5 uur en giet vervolgens de reactie in 18 milliliter ijswater om de reactie te stoppen. Breng de oplossing onmidd

a-general-method-for-detecting-nitrosamide-formation-vitro-metabolism

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Dit protocol beschrijft de bereiding van een synthetisch tRNA substraat voor...

In vitro tRNA methylatie test met de Entamoeba histolytica DNA en tRNA methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzym

Elektronen paramagnetische resonantie (EPR) spectroscopie werd gebruikt om stikstofoxide te detecteren van runderen aorta endotheelcellen en superoxide radicaal anion van menselijke neutrofielen met behulp van ijzer (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamaat, Fe...

Detectie van stikstofoxide en superoxide radicaal anion door Electron Paramagnetische Resonantie Spectroscopie van cellen met behulp van Spin Traps

De endogene productie van stikstofoxide (NO) regelt diverse biologische functies. Het wordt steeds duidelijker dat verstoring of ontregeling van NO op basis van signalering is betrokken bij vele ziekten bij de mens. Methoden voor het kwantificeren van relevante NO metabolieten kunnen nieuwe diagnostische of prognostische biomarkers voor ziekte bij de mens.

Analytische technieken voor het testen van stikstofoxide biologische activiteit

Stikstofmonoxide (NO) is een belangrijk signaalmolecuul bij vasculaire homeostase. NO-productie in vivo is te laag voor directe meting. Chemiluminescentie biedt nuttige inzichten in de NO-cyclus via het meten van zijn precursoren en oxidatieproducten, nitriet en nitraat. De bepaling van nitriet/nitraat in lichaamsweefsels en -vloeistoffen wordt uitgelegd.

Het meten van nitriet en nitraat, metabolieten in de stikstofoxide pathway, in biologische materialen met behulp van de chemoluminescentiemethode

Metabole competentie van in vitro systemen is een belangrijke voorwaarde voor de biotransformatie en dispositie van drugs en toxische stoffen. In dit protocol beschrijven we de toepassing van referentie- metabole probes fase I metabolisme in celkweken beoordelen.

Massaspectrometrie en luminogene gebaseerde benaderingen voor karakteriseren Fase I Metabolic competentie van<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Cultures

Een selectieve en gevoelige vloeistofchromatografie-tandem-massaspectrometrie (LC-MS / MS) methode gekoppeld aan een efficiënte vaste fase-extractie op een microplaat van 96-putjes met gemengde modus kation-uitwisseling (MCX) 96-putjes werd ontwikkeld voor het meten van vrije 3-nitrotyrosine ( 3-NT) in menselijke urine met hoge doorvoer, die geschikt is voor klinische toepassingen.

Integratie van Gefinatiseerde Solid Phase Extraction en LC-MS / MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Menselijke Urine voor Klinische Toepassingen

Evaluatie van de potentie van milieu chemische stoffen en drugs, enzymatisch worden bioactivated op tussenproducten genereren covalente DNA adducten, is een belangrijk gebied in de ontwikkeling van kanker en de behandeling ervan. Methoden worden beschreven voor samengestelde activering aan formulier die DNA, evenals de technieken voor de detectie en kwantificering adducten.

Vorming van covalente DNA adducten door enzymatisch geactiveerde kankerverwekkende stoffen en Drugs In Vitro en hun vastberadenheid door 32P-postlabeling

Presenteren we een methode voor het detecteren van 3-nitrotyrosine chemische wijzigingen van atmosferische eiwitten met 6 mm diameter rondes gesneden uit lucht sampler voorfilters met behulp van een krachtige vloeibare chromatografie-elektrochemische detector (HPLC-ECD).

Detectie van 3-Nitrotyrosine in de atmosferische omgeving via een High-performance Liquid Chromatography-elektrochemische Detector systeem

Hier presenteren we protocollen voor het detecteren van stikstofmonoxide en zijn biologisch relevante derivaten met behulp van op chemiluminescentie gebaseerde assays met een hoge gevoeligheid.

Chemiluminescentie-gebaseerde assays voor de detectie van stikstofmonoxide en zijn derivaten van autoxidatie en nitrosated compounds

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Leer een gevoelige methode voor het detecteren van nitrosamide-vorming in het metabolisme van nitrosaminen door cytochroom P450s in vitro. Deze techniek verbetert toxicologisch onderzoek naar kankerverwekkende mechanismen.

Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme In Vitro van nitrosaminen door cytochroom P450s (Video) | JoVE Journal

Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme In Vitro van nitrosaminen door cytochroom P450s

Meer video's verkennen