Mondelinge Biofilm bemonstering voor analyse van de Microbiome bij gezonde kinderen
December 31st, 2017
Veranderingen in de mondelinge microbiome tijdens jeugd zijn van toenemende belangstelling. Vergelijking van verschillende microbiome studies blijkt een gebrek aan gestandaardiseerde bemonstering protocollen. Beperkte ruimte maakt het geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie) van kinderen uitdagende bemonstering. Papieren punt bemonstering wordt hier in detail gepresenteerd als de methode van keuze voor dit gebied.
Het algemene doel van deze procedure is om een gestandaardiseerde methode te presenteren voor orale biofilm-bemonstering voor microbioomanalyse bij gezonde kinderen. Dit wordt bereikt door eerst instrumenten en materiaal voor te bereiden en te steriliseren. Vervolgens wordt het kind voorbereid op biofilm-bemonstering.
Vervolgens wordt biofilm-bemonstering uitgevoerd op drie locaties, de subgingivale sulcus, het slijmvlies van de vestibulaire vouw en speeksel. Ten slotte worden monsters systematisch opgeslagen. Uiteindelijk worden de orale microbioomanalyses uitgevoerd om klinische en wetenschappelijke vragen te beantwoorden.
Hallo, ik ben Elizabeth, en ik ben orthodontist. Mijn onderzoek richt zich op de veranderingen in het orale microbioom die gepaard gaan met orthodontische behandeling. Het bemonsteren van orale biofilm kan lastig zijn.
De ruimte in de subgingivale sulcus is beperkt, vooral bij kinderen. Bij vergelijking van onze microbioomgegevens met wereldwijd onderzoek, constateerden we een gebrek aan gestandaardiseerde bemonsteringsprotocollen. Met deze video zetten we de eerste stap om deze lacune te vullen.
Gekalibreerde en steriele papieren punten die meestal worden gebruikt in endodontische therapie, worden bij de eerste ringmarkering gesneden om hun lengte te standaardiseren. Na het snijden moeten papieren punten worden UV-geïrradieerd om DNA- en RNA-besmetting te voorkomen. De buizen voor opslag worden ook geautoclaveerd en UV-geïrradieerd.
Voor de biofilm-bemonstering moeten de tanden volledig worden schoongemaakt, beginnend met het aanbrengen van cacaoboter. Vervolgens worden de tanden geverfd met plaque-onthulling. Na het kleuren wordt de mond gespoeld met water.
De tanden worden goed geborsteld met een elektrische tandenborstel en water. Er wordt geen tandpasta aangebracht, omdat dit het orale biofilm zou veranderen. Er wordt een wang- en tongretractor gebruikt om de mond open en droog te houden.
Het plaatsen van de retractor vereist bekwame en vaste handen, om ongemak voor het kind te minimaliseren en om de procedure zo kort mogelijk te houden. Er worden steriele tandtangen gebruikt en de bemonsteringslocatie blijft gedurende de procedure onaangetast. De tanden worden schoongemaakt en gedroogd met steriele wattenstaafjes om absorptie van supragingivaal vocht tijdens de papierpuntbemonstering te voorkomen.
Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt voor biofilm-bemonstering in de mondholte. Vanwege de beperkte ruimte in de subgingivale sulcus van kinderen, is papierpuntbemonstering de methode bij uitstek. Papierpunten worden tangentief tot een gedefinieerde lengte van vier millimeter gedurende 20 seconden ingebracht.
Er moet speciale aandacht worden besteed om het junctionale epitheel niet te traumatiseren. Papierpunten worden vervolgens op de derde markering gesneden tot een gestandaardiseerde lengte van vier millimeter. Papierpunten kunnen ook gelijktijdig in dezelfde locatie worden ingebracht of monsters kunnen uit verschillende locaties worden gecombineerd.
Het droge veldapparaat wordt verwijderd voor bemonstering van slijmvlies en speeksel. Papierpunten kunnen op dezelfde manier worden toegepast om slijmvliesbiofilm in de vestibulaire vouw te bemonsteren. Salivair biofilm kan worden verzameld door niet-geïnduceerde speeksel te spugen.
Afhankelijk van het onderzoeksontwerp worden papierpunten opgeslagen als afzonderlijke, gepoolde of parallelle monsters. Een kleurgecodeerd opslagsysteem vergemakkelijkt verder monsterbeheer. Ten slotte worden de monsters voor microbioomanalyses bewaard bij minus 80 graden Celsius.
Er zijn verschillende commerciële kits ontwikkeld voor de snelle en nauwkeurige identificatie van parodontopathogene bacteriën. Papierpunten worden naar gespecialiseerde laboratoria gestuurd. DNA-extractie, -voorbereiding en -analyse worden vervolgens binnen drie uur uitgevoerd.
Het DNA kan ook worden gebruikt in onderzoek voor microbioomstudies. Next generation sequencing resulteert bijvoorbeeld in volledige microbioomgegevens. De algehele relatieve abundantie van bepaalde bacteriesoorten kan worden geanalyseerd, evenals veranderingen in de microbiota door veranderende omstandigheden.
Deze staafgrafiek en heatmap tonen de relatieve abundantie in de subgingivale microbiota op het niveau van de fylum en op het niveau van de orde. Verschillen in de microbiële samenstelling in de tijd, vergelijkingen tussen of binnen individuen of verschillende bemonsteringsmethoden worden gepresenteerd in histogrammen. Deze figuur toont de resultaten van een vergelijking van twee bemonsteringsmethoden, Modus A en Modus B, op verschillende taxonomische niveaus.
Statistische analyse van de waarden die zijn gemaakt met next generation sequencing kan worden gepresenteerd in tabellen. Verschillende tijdstippen zoals getoond in deze tabel kunnen worden geanalyseerd op verschillende taxonomische niveaus. P-waarden worden berekend om significante bevindingen te bewijzen.
Ten slotte kan het orale microbioom op het OTU-niveau worden gevisualiseerd met hoofdcoördinaatanalyses. Deze figuur toont intra- en interindividuele verschillen in vijf proefpersonen. Een clustering van bepaalde groepen kan verschuivingen in de microbioomsamenstelling laten zien.
Deze 3D-animatie toont de resultaten van een case-controlestudie. Rode stippen zijn de gevallen. Blauwe stippen zijn de controles.
Een duidelijke clustering van de gevallen na orthodontische interventie bij T3, de grote rode stippen, visualiseert een verschuiving in het microbioom. Blauwe stippen die de controlegroep tonen, zijn gelijkmatig verdeeld. Deze methode kan inzicht geven in klinische biofilm-bemonstering in de subgingivale sulcus van gezonde kinderen.
We kozen voor papierpunten als het meest geschikt voor dit kwetsbare compartiment. In deze video hebben we de methode toegepast op alleen permanente conditie. Het kan ook worden toegepast op gemengde of volwassen conditie.
Bij sommige patiënten kunt u volgens hetzelfde protocol ook parodontaal aangetaste locaties bemonsteren. Hoi, mijn naam is Barbara, en ik ben moleculair microbioloog. Wanneer ik biofilm in het laboratorium analyseer, moet ik vertrouwen op een bibliotheek van onbevooroordeelde klinische monsters.
Elke stap in het interdisciplinaire veld van oraal microbieel onderzoek moet volledig gestandaardiseerd zijn. En er is nog een belangrijk feit. Je kunt alleen succesvol zijn in een team.
Overzicht
Dit artikel presenteert een gestandaardiseerde methode voor orale biofilm-bemonstering bij gezonde kinderen, met focus op de uitdagingen van bemonstering in de beperkte ruimte van de subgingivale sulcus. De methode heeft als doel de betrouwbaarheid van microbioomanalyses te verbeteren door het gebrek aan gestandaardiseerde protocollen aan te pakken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Onderzoek naar het orale microbioom
- Pedodontie
- Microbiële bemonsteringstechnieken
Achtergrond
- Veranderingen in het orale microbioom tijdens de kinderjaren worden steeds meer bestudeerd.
- Huidige microbioomstudies missen gestandaardiseerde bemonsteringsprotocollen.
- Bemonstering in de subgingivale sulcus van kinderen stelt unieke uitdagingen.
- Papierpuntbemonstering wordt voorgesteld als een geschikte methode voor dit gebied.
Doel van het onderzoek
- Een betrouwbare methode voor orale biofilm-bemonstering bij kinderen vaststellen.
- Procedures voor microbioomanalyse standaardiseren.
- Vergelijkingen tussen microbioomdata van verschillende studies vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding en sterilisatie van instrumenten en materialen.
- Reiniging en voorbereiding van de tanden van het kind voor bemonstering.
- Bemonstering vanuit de subgingivale sulcus, mucosa en speeksel met behulp van papierpunten.
- Systematische opslag van monsters voor microbioomanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Gestandardiseerd papierpuntbemonstering verzamelt effectief biofilmmonsters.
- Monsters kunnen worden samengevoegd of afzonderlijk worden opgeslagen voor analyse.
- Next generation sequencing levert gedetailleerde microbioomdatasets op.
- Statistische analyses onthullen significante verschillen in microbiële samenstelling.
Conclusies
- De voorgestelde methode verbetert de betrouwbaarheid van orale microbioomstudies bij kinderen.
- Standaardisatie is cruciaal voor interdisciplinair onderzoek in de orale microbiologie.
- Samenwerking tussen onderzoekers is essentieel voor succesvolle resultaten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Standardized oral biofilm sampling in children addresses a critical gap in pediatric microbiome research, enabling reliable data generation for target validation in oral health interventions. The method supports mechanistic de-risking by providing reproducible biological samples that reflect true microbial composition, reducing variability in preclinical assessments. This enhances predictive confidence in early discovery stages where oral microbiota shifts may indicate disease susceptibility or treatment response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of oral microbiome composition as a biomarker for cariogenic and periopathogenic mechanisms in children.
- Operational Value: Provides a standardized sampling protocol that reduces technical variability in microbiome data generation.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing regarding microbial shifts during childhood development and intervention periods.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological samples for downstream NGS and bioinformatic analysis, ensuring assay readiness.
- Operational Value: Facilitates sample pooling or parallel processing, improving throughput and standardization across study sites.
- Scientific Value: Generates quantitative microbial abundance data suitable for assay optimization and screening campaign design.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Delivers disease-relevant samples from healthy pediatric oral sites, establishing baseline for comparative disease modeling.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of microbiome shifts, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
- Scientific Value: Provides mechanistic insights into host-microbe interactions that inform target selection and validation strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by supplying standardized biological inputs for microbiome profiling, which informs target identification and validation efforts prior to lead generation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of microbial community shifts linked to oral health status and developmental stages.
- Screening: Delivers reproducible samples enabling consistent NGS-based microbial profiling for comparative compound or intervention evaluation.
- Analytics: Generates relative abundance and diversity metrics that allow cross-condition comparison and statistical assessment of microbial changes.
- Translational Research: Connects discovery-phase microbiome data to preclinical continuity by establishing healthy baselines for disease model validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable sampling protocol applicable across pediatric oral health studies, reducing protocol redevelopment costs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbiome-associated target validation by minimizing sampling-induced noise.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization across sites and time points, critical for multi-center studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision reliability in oral health programs by reducing false positives from methodological artifacts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of oral microbiome targets based on robust, comparable longitudinal data.
Implementation Considerations
- Requires training in pediatric dental techniques and sterile handling to ensure sample integrity and child cooperation.
- Dependent on access to UV irradiation, autoclaving, and cold storage (-80°C) infrastructure for contamination control and sample preservation.
- Necessitates cross-disciplinary coordination between dental clinicians and molecular biologists for standardized execution.
- Requires adaptation considerations when applying to mixed dentition or periodontally diseased sites, as noted in the protocol.
- Limited by the physical constraints of subgingival access in very young children, which may affect sampling consistency.
