Name: Mondelinge Biofilm bemonstering voor analyse van de Microbiome bij gezonde kinderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Leer een gestandaardiseerde methode voor orale biofilmbemonstering bij gezonde kinderen met behulp van papieren punten. Deze techniek verbetert de betrouwbaarheid van microbiomanalyses in de subgingivale sulcus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn Joachim Theussl (centrum voor medisch onderzoek, medische universiteit van Graz) dankbaar voor de uitstekende technische bijstand in de videoproductie en Monica Farrell (onderzoekmanagement, medische universiteit van Graz) als stem talent.

Protocol en video ontspruiten werden goedgekeurd door het bestuur van de institutionele beoordeling van de medische universiteit van Graz (Votum 27-126ex14/15). Schriftelijke toestemming voor de publicatie van deze video is afkomstig van het kind en haar ouders.
1. instrumenten en materialen
<ol>
	<li>Knippen gekalibreerd (ISO 015/02) en steriel papier punten, meestal gebruikt in endodontische therapie, op de eerste ring merk oog op de standaardisering van hun lengte (Figuur 1).</li>
	<li>Toepassen van UV licht bestraling bij 260 nm gedurende 30 minuten om te voorkomen dat besmetting van DNA en RNA van de papier-punten (Figuur 2).</li>
	<li>Autoclaaf de buizen voor opslag bij 120 ° C en 1.2 bar voor 20 min en UV-bestralen hen zo goed of dienst kant-en-klare gamma bestraald buizen.</li>
</ol>
2. voorbereiding van onderwerpen
Opmerking: Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van het kind en haar ouder voorafgaand aan de inschrijving.
<ol>
	<li>Toepassing van cacaoboter aan de lippen.</li>
	<li>Monteren van de Wang en tong oprolmechanisme voor volledige toegang tot beide tandheelkundige bogen.</li>
	<li>Vlek de tandplaque met plaque openbaarmaking.</li>
	<li>Verwijder het apparaat droog gebied.</li>
	<li>Spoel de mond met water totdat het water kleurloos is.</li>
	<li>Grondig tanden te poetsen met een elektrische tandenborstel op 45 ° gehoekt. Breng water alleen maar geen tandpasta, als dit de mondelinge biofilm veranderen zou.</li>
	<li>Monteer het droge veld apparaat opnieuw, met inbegrip van de tong guard om te houden van de mond open en droog.</li>
	<li>Schoon en droog de tanden van de index met steriel katoenen wissers om te voorkomen dat de absorptie van supragingival vloeistof tijdens papier wijs bemonstering.</li>
</ol>
3. de Biofilm bemonstering
<ol>
	<li>Papieren punt bemonstering van de subgingivale Sulcus (hersenanatomie)
	<ol>
		<li>Pak het papier punten met een steriele dentale pincet.</li>
		<li>Plaats papier punten tangentieel omhoog tot een gedefinieerde lengte van 4 mm. Wees extra voorzichtig niet te traumatiseren de regulates epitheel (Figuur 3).</li>
		<li>Verwijder papier punten na 20 s.</li>
		<li>Papier punten verzamelen rechtstreeks in bereid buizen: plaats het papier punt topje rechtstreeks in een steriele en DNA-gratis flesje en snijd het op de derde merk tot een gestandaardiseerde lengte van 4 mm (Figuur 4).</li>
		<li>Als aangegeven door de studie protocollen, plaatst u twee papier punten parallel en gelijktijdig op dezelfde locatie (figuur 5A).</li>
		<li>U kunt ook papier punten verzamelen van verschillende sites als het studie-protocol vereist "samengevoegde monsters" (figuur 5B).</li>
		<li>Verwijderen van het apparaat droog veld voor cutane en bemonstering van het speeksel.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mucosale papier wijs bemonstering
	<ol>
		<li>Papier punten gelden voor de vestibulaire plooi van het bovenste Wang (Figuur 6).</li>
		<li>Sluit de Wang en massage het kort.</li>
		<li>Open van de Wang en verwijder het papier punten na 20 s.</li>
		<li>Gesneden papier punten op de derde merk en plaats ze in een steriele buis zoals aangegeven voor subgingivale bemonstering.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bemonstering van het speeksel
	<ol>
		<li>Laat het kind ongestimuleerde speeksel spuwen in een gesteriliseerde collectie vaartuig (Figuur 7).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. overdracht en opslag
<ol>
	<li>Papier punten verzamelen als single, gegroepeerd of parallelle monsters afhankelijk van het ontwerp van de studie (Figuur 8).</li>
	<li>Toepassing van een kleurcode opslagsysteem om verdere Steekproefbeheer (Figuur 9).</li>
	<li>Tot slot slaan de monsters op −80 ° C in afwachting van de microbiome analyse.</li>
</ol>

<ol><li>Paster, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Diversity+in+Human+Subgingival+Plaque%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque.</a> J Bacteriol. 183 (12), 3770-3783 (2001).</li>
<li>Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Normal+Bacterial+Flora+of+the+Oral+Cavity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity.</a> J Clin Microbiol. 43 (11), 5721-5732 (2005).</li>
<li>Ledder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Analysis+of+the+Subgingival+Microbiota+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease.</a> Appl Environ Microb. 73 (2), 516-523 (2007).</li>
<li>Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+healthy+%27core+microbiome%27+of+oral+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities.</a> BMC Microbiol. 9 (259), 1-12 (2009).</li>
<li>Alcaraz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+a+healthy+oral+microbiome+through+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infec%22%5BJournal%5D)">Identifying a healthy oral microbiome through metagenomics.</a> Clin Microbiol Infec. 18 (11), 54-57 (2012).</li>
<li>Dewhirst, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20656903">The Human Oral Microbiome.</a> J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).</li>
<li>Keijser, B. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+analysis+of+the+Oral+Microflora+of+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing analysis of the Oral Microflora of healthy adults.</a> Journal of Dental Research. 87, 1016-1020 (2008).</li>
<li>Könönen, E., Müller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiology+of+aggressive+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol+2000%22%5BJournal%5D)">Microbiology of aggressive periodontitis.</a> Periodontol 2000. 65 (1), 46-78 (2014).</li>
<li>Nasidze, I., Li, J., Quinque, D., Tang, K., Stoneking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+diversity+in+the+human+salivary+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechfor%22%5BJournal%5D)">Global diversity in the human salivary microbiome.</a> Biotechfor. 19 (4), 636-643 (2009).</li>
<li>Jervøe-Storm, P. M., Koltzscher, M., Falk, W., Dörfler, A., Jepsen, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15966886">Comparison of culture and real-time PCR for detection and quantification of five putative periopathogenic bacteria in subgingival plaque samples.</a> J Clin Periodontol. 32 (7), 778-783 (2005).</li>
<li>Ouhara, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15886266">Susceptibilities of periopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells.</a> J Antimicrob Chemoth. 55, 888-896 (2005).</li>
<li>Belda-Ferre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oral+metagenome+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">The oral metagenome in health and disease.</a> ISME J. 6 (1), 46-56 (2011).</li>
<li>Holt, S., Ebersole, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15853938">Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia: the 'red complex', a prototype polybacterial pathogenic consortium in periodontitis.</a> Periodontol 2000. 38, 72-122 (2005).</li>
<li>Gomez, A., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oral+Microbiome+of+Children%3A+Development%2C+Disease%2C+and+Implications+Beyond+Oral+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">The Oral Microbiome of Children: Development, Disease, and Implications Beyond Oral Health.</a> Microb Ecol. 73 (2), 492-503 (2017).</li>
<li>Klug, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Biofilm+Analysis+of+Palatal+Expanders+by+Fluorescence+In-Situ+Hybridization+and+Confocal+Laser+Scanning+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy.</a> J Vis Exp. , e2967(2011).</li>
<li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> J Vis Exp. , (2016).</li>
<li>Kilian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oral+microbiome+-+an+update+for+oral+healthcare+professionals%5BTitle%5D)+AND+%22British+Dental+Journal%22%5BJournal%5D)">The oral microbiome - an update for oral healthcare professionals.</a> British Dental Journal. 221 (10), 657-666 (2016).</li>
<li>Razzouk, S., Termechi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+genome%2C+epigenome%2C+and+oral+microbiome+interactions%3A+toward+personalized+periodontal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Host genome, epigenome, and oral microbiome interactions: toward personalized periodontal therapy.</a> J Periodontol. 84 (9), 1266-1271 (2012).</li>
<li>De Freitas, A., Marquezan, M., da Nojima, M., Alviano, D., Maia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+orthodontic+fixed+appliances+on+the+oral+microbiota%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Dent+Press+J+Orthod%22%5BJournal%5D)">The influence of orthodontic fixed appliances on the oral microbiota: A systematic review.</a> Dent Press J Orthod. 19 (2), 46-55 (2014).</li>
<li>Akin, M., Tezcan, M., Ileri, Z., Ayhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+white+spot+lesions+among+patients+treated+with+self-+and+conventional+ligation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oral+Invest%22%5BJournal%5D)">Incidence of white spot lesions among patients treated with self- and conventional ligation systems.</a> Clin Oral Invest. 19 (6), 1501-1506 (2015).</li>
<li>Ren, Y., Jongsma, M., Mei, L., van der Mei, H., Busscher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthodontic+treatment+with+fixed+appliances+and+biofilm+formation-a+potential+public+health+threat%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oral+Invest%22%5BJournal%5D)">Orthodontic treatment with fixed appliances and biofilm formation-a potential public health threat?</a> Clin Oral Invest. 18 (7), 1711-1718 (2014).</li>
<li>Santigli, E., Trajanoski, S., Eberhard, K., Klug, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+Modification+Effects+in+the+Subgingival+Microbiome+Profile+of+Healthy+Children%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sampling Modification Effects in the Subgingival Microbiome Profile of Healthy Children.</a> Frontiers Microbiol. 7, 2142(2017).</li>
<li>Klug, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Mouth+to+Model%3A+Combining+in+vivo+and+in+vitro+Oral+Biofilm+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Microbiol%22%5BJournal%5D)">From Mouth to Model: Combining in vivo and in vitro Oral Biofilm Growth.</a> Frontiers Microbiol. 7, 1448(2016).</li>
<li>Ximénez-Fyvie, L., Haffajee, A., Socransky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+composition+of+supra-+and+subgingival+plaque+in+subjects+with+adult+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Microbial composition of supra- and subgingival plaque in subjects with adult periodontitis.</a> J Clin Periodontol. 27 (10), 722-732 (2000).</li>
<li>Zijnge, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Biofilm+Architecture+on+Natural+Teeth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Oral Biofilm Architecture on Natural Teeth.</a> PLoS ONE. 5 (2), e9321(2010).</li>
<li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+high+throughput+sequencing+to+explore+the+biodiversity+in+oral+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oral+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using high throughput sequencing to explore the biodiversity in oral bacterial communities.</a> Mol Oral Microbiol. 27 (3), 182-201 (2012).</li>
<li>Goode, M., Cheong, S., Li, N., Ray, W., Bartlett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+and+extraction+of+saliva+DNA+for+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Collection and extraction of saliva DNA for next generation sequencing.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Hodgson, N., Granger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+saliva+and+measuring+salivary+cortisol+and+alpha-amylase+in+frail+community+residing+older+adults+via+family+caregivers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Collecting saliva and measuring salivary cortisol and alpha-amylase in frail community residing older adults via family caregivers.</a> J Vis Exp. , e50815(2013).</li>
<li>Luo, A. H., Yang, D. Q., Xin, B. C., Paster , B. J., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+profiles+in+saliva+from+children+with+and+without+caries+in+mixed+dentition%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Microbial profiles in saliva from children with and without caries in mixed dentition.</a> Oral Dis. 18 (6), 595-601 (2012).</li>
<li>Nasidze, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+human+saliva+microbiome+diversity+by+barcoded+pyrosequencing+and+cloning+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of human saliva microbiome diversity by barcoded pyrosequencing and cloning approaches.</a> Anal Biochem. 391 (1), 64-68 (2009).</li>
<li>Pfaffe, T., Cooper-White, J., Beyerlein, P., Kostner, K., Punyadeera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Potential+of+Saliva%3A+Current+State+and+Future+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Potential of Saliva: Current State and Future Applications.</a> Clin Chem. 57 (5), 675-687 (2011).</li>
<li>Zhu, W., Gallo, R., Huang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+human+indigenous+saliva+peptidome+using+a+lollipop-like+ultrafiltration+probe%3A+simplify+and+enhance+peptide+detection+for+clinical+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Sampling human indigenous saliva peptidome using a lollipop-like ultrafiltration probe: simplify and enhance peptide detection for clinical mass spectrometry.</a> J Vis Exp. , e4108(2012).</li>
<li>Belibasakis, G., Schmidlin, P., Sahrmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+microbiological+evaluation+of+subgingival+biofilm+sampling+by+paper+point+and+curette%5BTitle%5D)+AND+%22Apmis%22%5BJournal%5D)">Molecular microbiological evaluation of subgingival biofilm sampling by paper point and curette.</a> Apmis. 122 (4), 347-352 (2014).</li>
<li>Hayashi, F., Okada, M., Soda, Y., Miura, K., Kozai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subgingival+distribution+of+Campylobacter+rectus+and+Tannerella+forsythensis+in+healthy+children+with+primary+dentition%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Subgingival distribution of Campylobacter rectus and Tannerella forsythensis in healthy children with primary dentition.</a> Arch Oral Biol. 51 (1), 10-14 (2006).</li>
<li>Papaioannou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiota+on+different+oral+surfaces+in+healthy+children%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The microbiota on different oral surfaces in healthy children.</a> Oral Microbiol Immunol. 24 (3), 183-189 (2009).</li>
<li>Abusleme, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subgingival+microbiome+in+health+and+periodontitis+and+its+relationship+with+community+biomass+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">The subgingival microbiome in health and periodontitis and its relationship with community biomass and inflammation.</a> ISME J. 7 (5), 1016-1025 (2013).</li>
<li>Griffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+complex+bacterial+profiles+in+human+periodontitis+and+health+revealed+by+16S+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing.</a> ISME J. 6 (6), 1176-1185 (2011).</li>
<li>Jünemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Community+Shift+in+Treated+Periodontitis+Patients+Revealed+by+Ion+Torrent+16S+rRNA+Gene+Amplicon+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Bacterial Community Shift in Treated Periodontitis Patients Revealed by Ion Torrent 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing.</a> PLoS ONE. 7 (8), e41606(2012).</li>
<li>Cortelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+periodontal+pathogens+in+newborns+and+children+with+mixed+dentition%5BTitle%5D)+AND+%22European+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of periodontal pathogens in newborns and children with mixed dentition.</a> European J Clin Microbiol Infect Dis. 31, 1041-1050 (2012).</li>
<li>Trajanoski, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/261250766_Next-generation_sequencing_in_microbiome_analysis_factors_affecting_reproducibility_of_repeated_biofilm_sampling_of_the_gingival_sulcus_of_children">Next-generation sequencing in microbiome analysis: factors affecting reproducibility of repeated biofilm sampling of the gingival sulcus of children.</a> JDOCE. 1 (3), 34-46 (2013).</li>
<li>Jongsma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+on+stainless+steel+and+gold+wires+for+bonded+retainers+in+vitro+and+in+vivo+and+their+susceptibility+to+oral+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oral+Invest%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation on stainless steel and gold wires for bonded retainers in vitro and in vivo and their susceptibility to oral antimicrobials.</a> Clin Oral Invest. 17 (4), 1209-1218 (2013).</li>
</ol>

De auteurs melden geen belangenconflicten die verband houden met deze wetenschappelijke video productie.

Bacteriën zijn te vinden op alle sites binnen de mondholte24,25,26. Vele studies hebben gericht op het gebruik van speeksel als een medium van de bemonstering voor de kaart van mondelinge kolonisatie, aangezien het kan gemakkelijk worden bemonsterd door het spugen27,28,29,30,31, 32. Speeksel biofilm weerspiegelt echter niet subgingivale biofilm samenstelling. Dus, het gebruik van andere bemonsteringsmethoden is van cruciaal belang voor het maken van het geheel, en nieuwe discussies in tandheelkundige onderzoek zal oproepen. Verschillende artikelen vergelijken met het gebruik van Curettes| en papier punten voor subgingivale bemonstering van periodontally zieke onderwerpen8,33,34. Nog is geen onderzoeksgroep bekend te hebben gericht op de toepassing van gestandaardiseerde bemonstering apparaten voor verschillende leeftijdsgroepen, met name voor kinderen,19.
In deze video, wordt mondelinge biofilm bemonstering van drie mondeling habitats bij gezonde kinderen gepresenteerd.
Wijzigingen en probleemoplossing:
Het doel van het manuscript richt zich op het protocol voor klinische voor subgingivale biofilm bemonstering van gezonde kinderen. De methode van keuze verwijst naar geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie) waar beperkte ruimte maakt bemonstering vooral uitdagend. In deze video werd de methode toegepast op vroege permanent gebit. Het kan ook worden toegepast op gemengde of volwassen gebit, en aan kinderen en/of volwassenen. Onze bemonsteringsmethode zorgt voor wijzigingen zoals één of samengevoegde monsters. Deze instelling kan worden een cruciale factor voor moleculair analyses als gevolg van de kleine hoeveelheid DNA collectable van de gezonde subgingivale Sulcus (hersenanatomie). De keuze van de tanden van de index kan worden gewijzigd op verzoek; in het bijzonder kunnen een andere tand bemonsterde als alternatief wanneer het epithelium is getraumatiseerd en bloeden, waardoor het papier punt onbruikbaar zijn. Parallelle bemonstering twee papier punten tegelijk op één site te gebruiken maakt monster replicaat-organismen in één stap, naast het verkorten van de tijd van de stoel voor kinderen.
Met kleine aanpassingen kunnen zieke paradontale pockets worden bemonsterd. Hier zal papier punten moeten worden opgenomen in de volledige lengte van de zak, die tot 10 mm oplopen kan. De lengte en de conus van papier punten en de diepte van de invoegpositie moet worden aangepast aan de intraoral habitat van belang, maar moet altijd worden gestandaardiseerd door materiaal en afmetingen. Monsters kunnen ook worden genomen vanaf de mucosa met behulp van papier punten. Identieke protocollen toestaan vergelijkingen van verschillende mondelinge habitats en diverse tandheelkundige materialen. Patiënt voorbereiding en monster-opslag kunnen worden uitgevoerd zoals beschreven in deze video. Voor metatranscriptome onderzoek, kan RNA worden bemonsterd met dezelfde methode. Dus, na de monsterneming, de papier-punten moeten worden opgenomen rechtstreeks in RNA stabilisatie oplossing.
Beperkingen van de techniek:
Ongeacht wijzigingen is de klinische bemonsteringsmethode we beschrijven beperkt tot het geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie). Andere bemonsteringsplaatsen, wat betreft de periodontally zieke zakken voorbeeld, uitmaakten geen deel van ons studie-ontwerp. Als bemonstering tot de volledige diepte van dergelijke zakken nodig is, is het mogelijk dat papier punten niet groot genoeg is voor het verzamelen van monsters voldoende worden. Als de experimentele doel is om gegevens bemonsterd van geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie) en periodontally zieke zakken te vergelijken, is het belangrijk om te beseffen van de inherente bias die is gekoppeld aan verschillende klinische bemonsteringsmethoden. Het is daarom niet aan te raden om dergelijke gegevens te vergelijken.
Een beperking van de methode die hier gepresenteerd is bemonstering zonder het latere gebruik van propidium monoazide. Het toevoegen van deze agent direct na de monsterneming voorziet in specifieke analyse van alleen de levende cellen in de biofilm geanalyseerd. De hier beschreven methode van monsterneming weerspiegelt aantallen levende en dode cellen. Voor het onderzoek van ernstige parodontitis, zal papier punten waarschijnlijk moeten worden vervangen door Curettes|, zoals biofilm vorming in diepe zakken sterk is. Papieren punt bemonstering mogelijk niet overeen met het gehele microbiële spectrum in deze gevallen, als hun oppervlak kan te snel worden verzadigd.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden:
Het voorgestelde manuscript is de eerste in zijn soort op de standaardisering van subgingivale bemonstering in de gezonde Sulcus (hersenanatomie) met papier punten. Andere verslagen hebben verwezen naar het gebruik van metalen Curettes|35,36 of papier punten 37,38,39, maar niet beschrijven de processen die vóór de bemonstering plaatsvinden, dergelijke Als de plaque control, tand schoonmaken, tand isolatie en drogen, evenals de processen die voortvloeien uit de ontoereikende specificaties op de bemonsteringsleidingen techniek en tijd.
In de twee vorige artikelen, laten we zien dat het gebruik van papier punten een reproduceerbare methode voor subgingivale biofilm bemonstering in kinderen22,40 is. Als gevolg van hun ontwerp zijn Curettes| te groot voor de ondiepe Sulcus (hersenanatomie) met beperkte ruimte en te scherp voor de aanbesteding regulates epitheel. Het is van cruciaal belang voor toegang tot de subgingivale Sulcus (hersenanatomie) zonder het epithelium traumatiserend. Op deze manier wordt bias die voortvloeien uit het bloeden vermeden. Het gebruik van de punten slank en teder papier is dus voor dit gebied de voorkeur. Papier punten zijn functioneel om te controleren van wijzigingen in de samenstelling van de biofilm tijdens orthodontische behandeling21,41. Ze zijn slank en flexibel genoeg om te passen tussen de elementen van vaste orthodontische apparaten. Dit is een groot voordeel naar andere bemonsteringsmethoden zoals Curettes|. Atraumatische bemonstering wordt vereenvoudigd en bemonstering van kleine hoeveelheden DNA is mogelijk.
Toekomstige toepassingen:
In deze video toonden we de methode van permanente, niet-zieke, vroege gebit. Het kan ook worden toegepast op gemengde of volwassen gebit. Met enkele aanpassingen is het mogelijk om te proeven van periodontally zieke sites zoals tanden of implantaten en andere niches als gevolg van tandheelkundige materialen door hetzelfde protocol te volgen. Cariës onderzoek kon profiteren van dit gestandaardiseerde protocol, in bijzondere studies op wortel cariës. De belangrijkste les van onze monster video is standaardisatie van de protocollen gegevens om vergelijkbaar te maken, geen kwestie wat en hoe monsters worden gemeten.Toekomstige video demonstraties kunnen het veld van klinische bemonstering in het algemeen verbeteren.
Mondelinge biofilm verkregen zoals in de video wordt gebruikt in klinieken en voor wetenschappelijk onderzoek. Deze aanpak in vivo vormt een goede aanvulling op in vitro moleculaire technieken zoals fluorescentie in situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie15. NGS methoden, toestaan toegepast op de verzamelde biofilm, als de pyrosequencing die hier is afgebeeld, de analyse van de volledige microbiota. Berekening van de relatieve abundanties van bepaalde bacteriesoorten kan worden gebruikt ter ondersteuning van behandelingen of om andere patiënten of verschillende behandelingen te vergelijken. Samen met een gestandaardiseerde sequencing protocol en sequentie analyse workflow hebben wij eerder beschreven40, deze bemonsteringsmethode kunt sequentieanalyse tot op het niveau van het geslacht. Verder "meta"-studies zoals metatranscriptomic of metabolomic studies zijn mogelijk gebaseerd zijn op het protocol van de bemonstering gepresenteerd in deze video.
Kritische stappen:
Vermijden van vervuiling is een cruciale stap: steriele instrumenten moeten worden toegepast in een omgeving met niet-steriele in vivo . De overdracht van de mond naar de Bank moet snel en veilig worden uitgevoerd door een ervaren onderzoeker stoel tijd voor studiedeelnemers zo kort mogelijk houden. De meest kritische stap in het protocol is de atraumatische invoeging van het punt van het papier in de subgingivale Sulcus (hersenanatomie). Verstoring van de regulates epitheel en bloeden absoluut moeten worden vermeden. Verdere zorg moet worden genomen om niet besmetten papier punten en opslag flesjes met exogene DNA of RNA. De opslag zelf dan ook is een cruciale stap. Monsters moeten worden bevroren rechtstreeks, op zijn best bij −80 ° C. Dit voorkomt veranderingen in bacteriële samenstelling post steekproeven, die rangschikkend resultaten vervalsen zou.

Menselijke mondelinge biofilm omvat een brede gemeenschap die bestaat voornamelijk uit commensals en gunstige micro-organismen1,2,3. Soorten die hier voorkomen koloniseren alle niches dat de mondholte4,5,6 biedt. Biofilm samenstelling in deze nissen varieert zo breed als de habitats. Speeksel weergeeft, bijvoorbeeld verschillende bacteriële profielen dan plaque monsters. In plaque monsters van gezonde volwassenen is de relatieve overvloed van Straalzwammen meer dan 20%, terwijl minder dan 7% is gevonden in het speeksel. Bacteroidetes en Firmicutes verschijnen in tegenstelling in veel hogere aantallen in speeksel7. Het is dus belangrijk om te monster op verschillende locaties in de mond om het hele beeld. Bovendien maken verschillende factoren zoals de geografische en etnische verschillen, leeftijd, geslacht, en vele andere factoren het moeilijk om algemene regels voor de biofilm ontwikkeling en ziekte begin8,9te identificeren. Het onderzoek van periopathogenic en verwekkende biofilm is al vele jaren een centraal aandachtspunt8,10,11,12,13.
In de afgelopen jaren heeft onderzoek naar gezonde proefpersonen opgedaan belang niet alleen voor een breder begrip van ziekte, maar ook voor de uitvoering van de preventiemaatregelen14. Nieuwe technologieën en moleculaire analyses verder toelichten mondelinge biofilm vorming en functie15,16, en inschakelen het volledige profilering van microbiële diversiteit17,18. Naar verwachting zal ook leiden tot een nieuw begrip van microbiële wijzigingen tijdens orthodontische therapie19. Een impact op de ontwikkeling van orthodontische biomaterialen is te verwachten. De verbeterde vooruitzichten zal werpen nieuw licht op complicaties van orthodontische therapie biofilm, zoals emaille demineralisatie en parodontale ziekten12,20,21is gekoppeld. Als u wilt toestaan dat wereldwijd gegevens vergelijkingen, is het van cruciaal belang om te standaardiseren van alle stappen in de generatie van de gegevens. Kleine wijzigingen in de procedures van het laboratorium kunnen de resultaten sterk beïnvloeden. Bovendien is het gebruik van verschillende computationele platformen in de verwerking van gegevens kan leiden tot niet-vergelijkbare datasets. Ten slotte, de keuze van de statistische tests en correcties heeft een invloed op de resultaten. Echter, sampling bias al lang voordat de wijzigingen van de lab kan optreden of bio-demand begint. Niet-gestandaardiseerde bemonsteringsmethoden leiden tot een inherent partijdig studie. Met het oog op lage tot gematigde niveaus van normalisatie in de relevante studies bestaat weinig bewijs over de relatie tussen orthodontie en microbiomes19. Daarom zou de ontwikkeling van gestandaardiseerde methoden vergemakkelijken gekwalificeerde vergelijking van gegevens in het veld.
Dit artikel presenteert gestandaardiseerde mondelinge biofilm bemonsteringsprocedures. Het protocol beoogt bij te dragen aan het genereren van globaal vergelijkbare collecties van microbiële sequencedata. Een stapsgewijze protocol voor mondelinge biofilm bemonstering bij gezonde kinderen wordt gepresenteerd. Als de methode van keuze zijn papier punten ingevoegde atraumatically in de correcte subgingivale Sulcus (hersenanatomie). Om te vergemakkelijken habitat vergelijkingen, Wang mucosa bemonsterd volgens hetzelfde protocol. Dit artikel demonstreert bovendien parallelle en gegroepeerde bemonstering. Bovendien, de bemonstering van het speeksel is aangetoond. Een eenvoudige vergelijkende vervoer en opslagsysteem wordt ook gepresenteerd, vergemakkelijking van het beheer van het specimen voor verdere verwerking. De keuze van de stroomafwaartse activiteiten met betrekking tot opslagmedium, metagenomic analyses, en bio-informatica, hangt af van de klinische vragen van verschillende velden in mondelinge onderzoek. In dit manuscript, DNA bemonstering voor NGS uitgekozen als voorbeeld van een mogelijke toepassing voor orthodontische onderzoek.

<table><tbody><tr><td>Paper Points Taper .02, sterilised</td><td>VDW Dental</td><td>550 029 015</td><td>http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&amp;cHash= 1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2</td></tr><tr><td>GC Cocoa Butter, Tube of 10 g</td><td>GC EUROPE N.V.</td><td>000387</td><td>http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22</td></tr><tr><td>Rondells blue</td><td>DIRECTA AB</td><td>Rondell Tablets</td><td>http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767</td></tr><tr><td>Great Lakes Nola Dry Field System</td><td>Great Lakes Ortho</td><td>300-401</td><td>http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626</td></tr><tr><td>tooth brush</td><td>Oral-B</td><td></td><td>http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro</td></tr><tr><td>micro-Ident plus11</td><td>Hain Lifescience GmbH</td><td>23312</td><td>http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html</td></tr><tr><td>ParoCheck</td><td>Greiner Bio One International GmbH</td><td>460020</td><td>https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/</td></tr><tr><td>Carpegen Perio Diagnostik</td><td>Carpegen GmbH</td><td></td><td>http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html</td></tr><tr><td>tubes Reaktionsgef&auml;&szlig;e 1,5 ml</td><td>Lactan</td><td>CH77.1&nbsp; to CH81.1</td><td>www.lactan</td></tr><tr><td>cotton swabs</td><td>Henry Schein</td><td>9003182</td><td>www.henryschein.at</td></tr></tbody></table>

mondelinge biofilm bemonstering voor analyse van de microbiome bij gezonde kinderen

Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

Mondelinge biofilm en haar moleculaire analyse vormen een basis voor het onderzoeken van verschillende tandheelkundige onderzoek en klinische vragen. Kennis van biofilm samenstelling leidt tot een beter inzicht in de mechanismen van verwekkende en periopathogenic. Microbiële veranderingen die plaatsvinden in de mondholte tijdens de kindertijd zijn interessant om verscheidene redenen. De evolutie van het kind mondelinge microbiota en verschuivingen in de samenstelling moet verder worden geanalyseerd om te begrijpen en eventueel voorkomen dat het begin van de ziekte. Op hetzelfde moment, is geavanceerde kennis van de natuurlijke samenstelling van mondelinge biofilm nodig. Vroege stadia van cariës-gratis permanent gebit met gezond tandvlees bieden een algemeen onaangetast subgingivale habitat die als een basislijn in situ dienen kan voor het bestuderen van functies van mondelinge gezondheid en ziekte. Analyse van de mondelinge biofilm kinderen tijdens de verschillende fasen in het leven is dus een belangrijk thema in het veld. Moderne moleculaire analysemethoden bieden uitgebreide informatie over de bacteriële diversiteit van dergelijke biofilms. Opdat de microbiota gegevens vergelijking, is het belangrijk om te standaardiseren van elke stap in de procedure voor moleculaire gegevens generatie. Deze procedure omvat van klinische steekproeven, Next Generation Sequencing (NGS), bioinformatic gegevensverwerking, taxonomische interpretatie. Een van de meest cruciale factoren hier is de biofilm bemonstering. Bemonstering bij kinderen is dat zelfs meer uitdagend, met name als gevolg van de beperkte ruimte in de subgingivale gebieden. Dus richten we ons op het gebruik van papier punten voor subgingivale bemonstering. Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor mondelinge biofilm bemonstering van de subgingivale Sulcus (hersenanatomie), de mucosa en speeksel bij kinderen.

In de huidige publicatie, is DNA bemonstering voor NGS als een voorbeeld van een mogelijke toepassing voor orthodontische onderzoek aangetoond. Bacteriële DNA wordt geëxtraheerd rechtstreeks uit de papier punt monsters. Dit DNA kan vervolgens worden gebruikt in studies van de microbiële samenstelling voor klinische of onderzoek vragen (zoals samengevat in Figuur 10).
Moderne moleculaire analysemethoden zoals de NGS methode 454-pyrosequencing geven een overzicht van de volledige microbiota van een steekproef. Het DNA van duizenden bacteriën wordt geïdentificeerd gelijktijdig op verschillende niveaus van de fylogenetische over het 16s rRNA reeks verschillen. Bioinformatic platformen moeten worden gegenereerd als een middel in clusters die de informatie van de grote gegevenssets ontvangen te structureren. Statistische analyse kan vervolgens worden toegepast op datasets microbiota.
De totale relatieve overvloed van bepaalde bacteriesoorten kan als verschuivingen in de microbiota als gevolg van veranderende habitat voorwaarden kunnen worden geanalyseerd. Staafdiagrammen (Figuur 11) en heatmaps (Figuur 12) weergeven op het niveau van de stam of op het niveau van de bestelling de subgingivale bacteriële samenstelling. Verschillende individuen en behandelingen kunnen worden vergeleken door beschrijvende en inferentiële statistiek. Figuur 13 presenteert een histogram vergelijking van twee modi van subgingivale papier punt bemonstering op verschillende taxonomische niveaus. Tabel 1 toont de verschuiving in de samenstelling van de biofilm tijdens een in vitro studie van het vergelijken van twee tijdstippen (T1- en T3). Statistisch significante wijzigingen werden berekend met Wilcoxon ondertekend-rank test en volgende Bonferroni correctie van de 454-pyrosequencing-gegevens.
Ten slotte Principal coördinaat analyse (PCoA) in staat stelt direct 3D vergelijking op het niveau van de operationele taxonomische eenheid (OTU) zoals aangegeven in de verschillende monsters. De percelen van de PCoA in Figuur 14 weergeven intra - en intersite - individual verschillen van de subgingivale microbiome in een case-serie van vijf kinderen. Figuur 15 toont de resultaten van een orthodontische patiënt-controle-onderzoek: roze met rode stippen zijn de gevallen, licht tot donker blauwe stippen zijn de besturingselementen, alle bemonsterde herhaaldelijk over een periode van vier maanden. Een duidelijke clustering van de gevallen na de orthodontische ingreep (rode stippen) vertegenwoordigt een verschuiving in de microbiome. Blauwe stippen, die van de controlegroep, gelijkmatig verdeeld zijn.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig1.jpg"> 
Figuur 1 : Bereiden van papier punten van gestandaardiseerde lengte. Steriel gekalibreerde papier punten worden gesneden op het eerste merk van de ring op de standaardisering van hun lengte. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig2.jpg"> 
Figuur 2 : Sterilize en gratis papier punten uit DNA. Gestandaardiseerde papier punten zijn gesteriliseerd en UV bestraald in een schone bankje. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig3.jpg"> 
Figuur 3 : Subgingivale papier punt inbrengen. Steriel gekalibreerde papier punten tangentieel worden ingevoegd in de subgingivale Sulcus (hersenanatomie) tot het mark ring 4 mm voor 20 s.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig4.jpg"> 
Figuur 4 : Papier punt in buis snijden. Direct na de monsterneming, papier punten worden gesneden op de derde ring mark (4 mm) in een steriele en DNA-vrije 1,5 mL flacon. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig5.jpg"> 
Figuur 5 : Gebundelde en parallelle bemonstering. Twee papier punten worden gelijktijdig in de subgingivale Sulcus (hersenanatomie) van een tand (A) of verschillende punten van de papieren in de subgingivale Sulcus (hersenanatomie) van verschillende tanden (B) ingevoegd. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig6.jpg"> 
Figuur 6 : Mucosal bemonstering. Steriel gekalibreerde papier punten worden gelegd in de mucosa van de vestibulaire vouw. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig7.jpg"> 
Figuur 7 : Speeksel collectie. Ongestimuleerde speeksel is spit in een steriele bekerglas. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig8.jpg"> 
Figuur 8 : Bemonsteringsplan. Monsters kunnen worden genomen als single (linkerkant, elke één tand), gebundeld (verschillende aan alle strepen in één flesje) of parallel (blauwe strepen, twee punten van het papier op een tand) monsters. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig9.jpg"> 
Figuur 9 : Vergelijkende opslag. Een verwijzende kleurcode voor lakens en flesjes vergemakkelijkt sample verdere behandeling.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig10.jpg"> 
Figuur 10 : Analyse van de subgingivale biofilm. Schematische voorstelling van klinische biofilm bemonstering (A), DNA-extractie (B), en verschillende NGS technologieën (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig11.jpg"> 
Figuur 11 : Staafdiagram. Toont de relatieve abundantie van de bacteriën op stam niveau geanalyseerd met behulp van 454-pyrosequencing. Afbeelding van Santigli et al. gewijzigd 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig12.jpg"> 
Figuur 12 : Heatmap. Toont de relatieve abundanties van bacteriële orders geanalyseerd met behulp van 454-pyrosequencing. Donkerrood vertegenwoordigt een hoge relatieve overvloed (&#62; 10%). Donkerblauw vertegenwoordigt een zeer lage tot geen relatieve overvloed van de respectieve bacteriële orde. Afbeelding van Santigli et al. gewijzigd 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig12large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig13.jpg"> 
Figuur 13 : Histogram. Vergelijking van de twee modi van papier wijzen (modi A en B) bemonstering op verschillende taxonomische niveaus. Gegevens die zijn gegenereerd met 454-pyrosequencing. Afbeelding van Santigli et al. gewijzigd 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig13large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig14.jpg"> 
Figuur 14 : 2D PCoA plot. Een case-serie (n = 5) met intra-persoonlijke en inter-individuele verschillen als gevolg van twee subgingivale bemonsteringsmethoden (1 kleur is 1 onderwerp). Gegevens die zijn gegenereerd met 454-pyrosequencing. Afbeelding van Santigli et al. gewijzigd 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig14large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig15.jpg"> 
Figuur 15 : Momentopname van een 3D-animatie van PCoA plot. Weergegeven: subgingivale microbiome verschuivingen in een orthodontische case controle studie (n = 16; elke groep, 3 punten in tijd; gevallen: roze naar rood, besturingselementen: licht tot donker blauw). Gegevens die zijn gegenereerd met 454-pyrosequencing.Niet-gepubliceerde gegevens van werkgroep Santigli. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig15large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Taxon: bacteriën</td>
			<td colspan="3">Tijdstip 1 [%]</td>
			<td colspan="3">Tijdstip 3 [%]</td>
			<td colspan="2">Wilcoxon ondertekend-rank test</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Phylum/geslacht</td>
			<td>25e</td>
			<td>Mediaan</td>
			<td>75ste</td>
			<td>25e</td>
			<td>Mediaan</td>
			<td>75ste</td>
			<td>p-waarde</td>
			<td>p-waarde aangepast #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Andere</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Andere</td>
			<td>0.70</td>
			<td>1.07</td>
			<td>1.28</td>
			<td>1.32</td>
			<td>1.63</td>
			<td>1.93</td>
			<td>.000</td>
			<td>.005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Straalzwammen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Actinomyces</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0,06</td>
			<td>0,30</td>
			<td>0.97</td>
			<td>.001</td>
			<td>.021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Rothia</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,05</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.32</td>
			<td>.001</td>
			<td>.009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bacteroidetes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Prevotella</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0.22</td>
			<td>0,15</td>
			<td>1.02</td>
			<td>2.44</td>
			<td>.000</td>
			<td>.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Firmicutes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Andere (bacillen)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0,06</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.10</td>
			<td>.706</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Staphylococcus</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,07</td>
			<td>0,17</td>
			<td>.548</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Gemellaceae)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,07</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.77</td>
			<td>1.24</td>
			<td>.005</td>
			<td>.091</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Melkzuurbacteriën)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.12</td>
			<td>1,50</td>
			<td>.004</td>
			<td>.073</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Granulicatella</td>
			<td>0.09</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.64</td>
			<td>1,59</td>
			<td>2.28</td>
			<td>.000</td>
			<td>.003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Lactobacillus</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.18</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>.700</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Andere (Streptococcaceae)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.10</td>
			<td>0.19</td>
			<td>.768</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Streptococcaceae)</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0.10</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.69</td>
			<td>.005</td>
			<td>.083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Streptococcus</td>
			<td>53.42</td>
			<td>61.96</td>
			<td>88.38</td>
			<td>48.44</td>
			<td>60.83</td>
			<td>73.97</td>
			<td>.055</td>
			<td>.930</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Andere (Lachnospiraceae)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.11</td>
			<td>.003</td>
			<td>.058</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dialister</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.04</td>
			<td>.240</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Veillonella</td>
			<td>3.43</td>
			<td>27.15</td>
			<td>42,78</td>
			<td>6.69</td>
			<td>13,38</td>
			<td>27.05</td>
			<td>.157</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Proteobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Haemophilus</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.03</td>
			<td>0.31</td>
			<td>0.84</td>
			<td>2.38</td>
			<td>.000</td>
			<td>.008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">#p-waarde Wilcoxon ondertekend-rank test aangepast volgens Bonferroni-correctie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">Een p &#60; 0.0026 werd beschouwd als een belangrijke</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: Statistische analyse. Verschillen in de mondelinge microbiome van gezonde kinderen op twee punten in de tijd. Gegevens die zijn gegenereerd met 454-pyrosequencing. Afbeelding van Klug et al. gewijzigd 23

Veranderingen in de mondelinge microbiome tijdens jeugd zijn van toenemende belangstelling. Vergelijking van verschillende microbiome studies blijkt een gebrek aan gestandaardiseerde bemonstering protocollen. Beperkte ruimte maakt het geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie) van kinderen uitdagende bemonstering. Papieren punt bemonstering wordt hier in detail gepresenteerd als de methode van keuze voor dit gebied.

Mondelinge Biofilm bemonstering voor analyse van de Microbiome bij gezonde kinderen

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition ...

Het algemene doel van deze procedure is om een gestandaardiseerde methode te presenteren voor orale biofilm-bemonstering voor microbioomanalyse bij gezonde kinderen. Dit wordt bereikt door eerst instrumenten en materiaal voor te bereiden en te steriliseren. Vervolgens wordt het kind voorbereid op biofilm-bemonstering.Vervolgens wordt biofilm-bemonstering uitgevoerd op drie locaties, de subgingivale sulcus, het slijmvlies van de vestibulaire vouw en speeksel. Ten slotte worden monsters systematisch opgeslagen. Uiteindelijk worden de orale microbioomanalyses uitgevoerd om klinische en wetenschappelijke vragen te beantwoorden.Hallo, ik ben Elizabeth, en ik ben orthodontist. Mijn onderzoek richt zich op de veranderingen in het orale microbioom die gepaard gaan met orthodontische behandeling. Het bemonsteren van orale biofilm kan lastig zijn.De ruimte in de subgingivale sulcus is beperkt, vooral bij kinderen. Bij vergelijking van onze microbioomgegevens met wereldwijd onderzoek, constateerden we een gebrek aan gestandaardiseerde bemonsteringsprotocollen. Met deze video zetten we de eerste stap om deze lacune te vullen.Gekalibreerde en steriele papieren punten die meestal worden gebruikt in endodontische therapie, worden bij de eerste ringmarkering gesneden om hun lengte te standaardiseren. Na het snijden moeten papieren punten worden UV-geïrradieerd om DNA- en RNA-besmetting te voorkomen. De buizen voor opslag worden ook geautoclaveerd en UV-geïrradieerd.Voor de biofilm-bemonstering moeten de tanden volledig worden schoongemaakt, beginnend met het aanbrengen van cacaoboter. Vervolgens worden de tanden geverfd met plaque-onthulling. Na het kleuren wordt de mond gespoeld met water.De tanden worden goed geborsteld met een elektrische tandenborstel en water. Er wordt geen tandpasta aangebracht, omdat dit het orale biofilm zou veranderen. Er wordt een wang- en tongretractor gebruikt om de mond open en droog te houden.Het plaatsen van de retractor vereist bekwame en vaste handen, om ongemak voor het kind te minimaliseren en om de procedure zo kort mogelijk te houden. Er worden steriele tandtangen gebruikt en de bemonsteringslocatie blijft gedurende de procedure onaangetast. De tanden worden schoongemaakt en gedroogd met steriele wattenstaafjes om absorptie van supragingivaal vocht tijdens de papierpuntbemonstering te voorkomen.Er kunnen verschillende methoden worden gebruikt voor biofilm-bemonstering in de mondholte. Vanwege de beperkte ruimte in de subgingivale sulcus van kinderen, is papierpuntbemonstering de methode bij uitstek. Papierpunten worden tangentief tot een gedefinieerde lengte van vier millimeter gedurende 20 seconden ingebracht.Er moet speciale aandacht worden besteed om het junctionale epitheel niet te traumatiseren. Papierpunten worden vervolgens op de derde markering gesneden tot een gestandaardiseerde lengte van vier millimeter. Papierpunten kunnen ook gelijktijdig in dezelfde locatie worden ingebracht of monsters kunnen uit verschillende locaties worden gecombineerd.Het droge veldapparaat wordt verwijderd voor bemonstering van slijmvlies en speeksel. Papierpunten kunnen op dezelfde manier worden toegepast om slijmvliesbiofilm in de vestibulaire vouw te bemonsteren. Salivair biofilm kan worden verzameld door niet-geïnduceerde speeksel te spugen.Afhankelijk van het onderzoeksontwerp worden papierpunten opgeslagen als afzonderlijke, gepoolde of parallelle monsters. Een kleurgecodeerd opslagsysteem vergemakkelijkt verder monsterbeheer. Ten slotte worden de monsters voor microbioomanalyses bewaard bij minus 80 graden Celsius.Er zijn verschillende commerciële kits ontwikkeld voor de snelle en nauwkeurige identificatie van parodontopathogene bacteriën. Papierpunten worden naar gespecialiseerde laboratoria gestuurd. DNA-extractie, -voorbereiding en -analyse worden vervolgens binnen drie uur uitgevoerd.Het DNA kan ook worden gebruikt in onderzoek voor microbioomstudies. Next generation sequencing resulteert bijvoorbeeld in volledige microbioomgegevens. De algehele relatieve abundantie van bepaalde bacteriesoorten kan worden geanalyseerd, evenals veranderingen in de microbiota door veranderende omstandigheden.Deze staafgrafiek en heatmap tonen de relatieve abundantie in de subgingivale microbiota op het niveau van de fylum en op het niveau van de orde. Verschillen in de microbiële samenstelling in de tijd, vergelijkingen tussen of binnen individuen of verschillende bemonsteringsmethoden worden gepresenteerd in histogrammen. Deze figuur toont de resultaten van een vergelijking van twee bemonsteringsmethoden, Modus A en Modus B, op verschillende taxonomische niveaus.Statistische analyse van de waarden die zijn gemaakt met next generation sequencing kan worden gepresenteerd in tabellen. Verschillende tijdstippen zoals getoond in deze tabel kunnen worden geanalyseerd op verschillende taxonomische niveaus. P-waarden worden berekend om significante bevindingen te bewijzen.Ten slotte kan het orale microbioom op het OTU-niveau worden gevisualiseerd met hoofdcoördinaatanalyses. Deze figuur toont intra- en interindividuele verschillen in vijf proefpersonen. Een clustering van bepaalde groepen kan verschuivingen in de microbioomsamenstelling laten zien.Deze 3D-animatie toont de resultaten van een case-controlestudie. Rode stippen zijn de gevallen. Blauwe stippen zijn de controles.Een duidelijke clustering van de gevallen na orthodontische interventie bij T3, de grote rode stippen, visualiseert een verschuiving in het microbioom. Blauwe stippen die de controlegroep tonen, zijn gelijkmatig verdeeld. Deze methode kan inzicht geven in klinische biofilm-bemonstering in de subgingivale sulcus van gezonde kinderen.We kozen voor papierpunten als het meest geschikt voor dit kwetsbare compartiment. In deze video hebben we de methode toegepast op alleen permanente conditie. Het kan ook worden toegepast op gemengde of volwassen conditie.Bij sommige patiënten kunt u volgens hetzelfde protocol ook parodontaal aangetaste locaties bemonsteren. Hoi, mijn naam is Barbara, en ik ben moleculair microbioloog. Wanneer ik biofilm in het laboratorium analyseer, moet ik vertrouwen op een bibliotheek van onbevooroordeelde klinische monsters.Elke stap in het interdisciplinaire veld van oraal microbieel onderzoek moet volledig gestandaardiseerd zijn. En er is nog een belangrijk feit. Je kunt alleen succesvol zijn in een team.<p

oral-biofilm-sampling-for-microbiome-analysis-in-healthy-children

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Biofilms gevormd op tandoppervlakken zijn zeer complex en worden blootgesteld aan een constante aangeboren en exogene milieu-uitdagingen, die hun architectuur moduleren, fysiologie en transcriptoom. We ontwikkelden een toolbox om de samenstelling, de structurele organisatie en gen-expressie van orale biofilms, die kan worden aangepast aan andere gebieden van de biofilm onderzoek te onderzoeken.

Een analytisch instrument-box voor de Uitgebreide Biochemische, structurele en Transcriptome Evaluatie van orale biofilms gemedieerd door mutans streptococcen

We presenteren een protocol voor structurele en analyse van de samenstelling van natuurlijke orale biofilm van orthodontische apparatuur...

Orale Biofilm Analyse van de Palatal Expanders door middel van fluorescentie in-situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie

Source: Schlafer, S, and Frost Kristensen, M. Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the cultivation of Streptococcus mutans and Candida albicans cross-kingdom biofilms under oral-like conditions to model bacterial–fungal interactions, enabling the study of microbial synergy, glucan-mediated adhesion, and acidogenic virulence in oral pathogenesis.

Establishing Bacterial–Fungal Cross-Kingdom Biofilms for Studying Oral Pathogenesis

This video demonstrates a real-time assay for monitoring extracellular pH in dental biofilms using a pH-sensitive ratiometric probe. When an in situ-grown bacterial biofilm is exposed to glucose, a reduction in extracellular pH near the bacterial biomass protonates the probe, leading to its increased concentration inside the bacteria. The disparity in emission wavelength between the protonated and unprotonated probe is utilized to calculate the pH across the extracellular matrix of the biofilm...

An Assay for Real-Time Monitoring of Extracellular pH in Dental Biofilms

Een protocol voor de gelijktijdige kwantificering en vergelijking van drie cellulaire en extracellulaire componenten binnen biofilms wordt gepresenteerd. De methodologie omvat het gebruik van confocale laserscanningmicroscopie, software voor biofilmstructuuranalyse en -visualisatie, en statistische analysesoftware.

Concurrent Kwantificering van Cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms

Het doel van deze methoden papier is het gebruik van een microfluïdische systeem te beschrijven voor de ontwikkeling van multi-species biofilms dat soort gewoonlijk geïdentificeerd in humaan supragingivale tandplaque bevatten. Methoden om biofilm architectuur, biofilm levensvatbaarheid, en een aanpak om te oogsten biofilm voor cultuur-afhankelijke of cultuur-onafhankelijke analyses zijn gemarkeerd beschrijven.

Toepassing van een High-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluïdische System op mondelinge Multi-species biofilms Ontwikkel

Hier presenteren we een protocol om te evalueren van mondelinge biofilm vorming op titanium en zirconia materialen voor tandheelkundige prothese abutments, met inbegrip van de analyse van de levensvatbaarheid van de bacteriële cellen en morfologische kenmerken. Een in situ -model die samenhangen met krachtige microscopie technieken wordt gebruikt voor de analyse orale biofilm.

Mondelinge Biofilm vorming op verschillende materialen voor tandheelkundige implantaten

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het verwerven van de monsters van de adem van de kinderen. Monsters van gemengde lucht zijn kort, vooraf geconcentreerd in sorptiemiddel buizen vóór gaschromatografie-massaspectrometrie analyse. Adem biomarkers voor infectieuze en niet-infectieuze ziekten kunnen worden geïdentificeerd met behulp van deze methode adem collectie.

Adem collectie van kinderen voor ziekte Biomarker ontdekking

Het protocol beschrijft de teelt van cross-kingdom biofilms bestaande uit Candida albicans en Streptococcus mutans en presenteert een confocale microscopie-gebaseerde methode voor het monitoren van extracellulaire pH in deze biofilms.

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms met behulp van ConfocalMicroscopie

Natuurlijke producten vormen veelbelovende uitgangspunten voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en therapeutische middelen. Vanwege de grote chemische diversiteit is het vinden van nieuwe therapeutische verbindingen van planten echter een uitdagende en tijdrovende taak. We beschrijven een vereenvoudigde aanpak om antimicrobiële en antibiofilmmoleculen te identificeren uit plantenextracten en fracties.

Systematische aanpak om nieuwe antimicrobiële en antibiofilmmoleculen uit plantenextracten en -fracties te identificeren om tandheelkundige cariës te voorkomen

Leer een gestandaardiseerde methode voor orale biofilmbemonstering bij gezonde kinderen met behulp van papieren punten. Deze techniek verbetert de betrouwbaarheid van microbiomanalyses in de subgingivale sulcus.

Mondelinge Biofilm bemonstering voor analyse van de Microbiome bij gezonde kinderen

Meer video's verkennen