Geheel-cel stromingen geïnduceerd door Puff toepassing van GABA in de hersenen segmenten

Het algemene doel van deze puff-techniek is om de farmacologische toediening uit te voeren in whole-cell patch-clamp opname. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van elektrofysiologie, zoals farmacologische toediening. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de concentratie van het medicijn rond de opnameplaats snel toeneemt, waardoor de membraanreceptoren worden beschermd tegen desensibilisatie.

Over het algemeen zullen mensen die onbekend zijn met deze methode worstelen omdat de voorbereiding van een acute prefrontale cortex slice en de positie van de puff micropipette relatief moeilijk zijn. Om deze procedure te starten, verplettert u de bevroren snijoplossing om een slush te verkrijgen. Houd de slushy-oplossing op ijs en laat het met 95% zuurstof en 5% kooldioxide borrelen.

Plaats vervolgens de gedissekteerde kop in een beker gevuld met ijskoude snijoplossing en haal hem na een paar seconden eruit. Snijd de schedel langs de middenlijn in een caudal-rostrale richting met fijne schaar en verwijder de laterale schedelgedeelten. Verwijder vervolgens de hersenen met een fijne spatel en laat ze vallen in de ijskoude snijoplossing.

Plaats vervolgens de hersenen op het deksel van een negen centimeter Petri-schaal gevuld met ijs. Spoel de hersenen met ijskoude snijoplossing. Snijd vervolgens de kleine hersenen en reukbol af met een scheermesje.

Vervolgens brengt u cyanoacrylaatlijm aan op de Vibratome-monsterhouder. Plaats de hersenblok voorzichtig op een druppel lijm, met de rostrale kant omhoog, en dompel het onmiddellijk onder in de ijskoude snijoplossing. Stel de meshouder in op een hoek van 15 graden ten opzichte van het horizontale vlak.

Snijd de hersenweefsels in 350 micron coronale plakken. Breng vervolgens de plakken over naar de hersteelkamer gevuld met ACSF en incubeer ze een uur met constant borrelen van 95% zuurstof, 5% kooldioxide. In ons experiment is de voorbereiding van een acute prefrontale cortex slice ook van cruciaal belang in de procedure.

Een gezonde hersensnede betekent actieve neuronen die stevig kunnen worden gepatcht. Maak in deze procedure glazen borosilicaat micropipetten voor gebruik als opname-elektroden of puff-micropipetten. Voor opname-elektroden zijn de tipweerstanden in het bereik van vier tot zes megaohm, terwijl puff-micropipetten tipdiameters hebben in het bereik van twee tot vijf micrometer.

Voeg natriumkanaalblokker toe aan ACSF om snelle natriumkanalen en dus actiepotentialen te blokkeren en onderhoud een constante stroomsnelheid van deze oplossing van twee tot drie milliliter per minuut in de opnamekamer. Laat de ACSF constant borrelen met 95% zuurstof, 5% kooldioxide om de levensvatbaarheid van de plakken te garanderen. Breng een hersensnede over naar de opnamekamer met behulp van een Pasteur-pipet met een fijne punt die is gesneden om de grootte van de plak te passen.

Plaats vervolgens een platina plakanker boven de plak om deze op het platform te houden. Vul vervolgens de opname-micropipetten met interne oplossing en vul de puff-micropipetten met GABA bij 10 micromolar, 50 micromolar en 100 micromolar, of ACSF als vehikelcontrole. Om verstopping met puin te voorkomen, oefent u lichte positieve druk uit met behulp van een spuit van één milliliter voordat u de opname-elektrode in de ACSF onderdompelt.

Positioneer onder een microscoop de opname-elektrode en puff-micropipet zodat de uiteinden in het midden van de monitor verschijnen. Identificeer vervolgens een doelneuron. Pas de microscoopfocus aan terwijl u de puff-micropipet geleidelijk verlaagt en plaats deze boven het opnameneuron onder een hoek van 45 graden.

Houd de afstand tussen het uiteinde van de puff-micropipet en het doelneuron in het bereik van 20 tot 40 micrometer. Nabij de neuron met de opname-elektrode en laat vervolgens de positieve druk los. Oefen een zwakke en korte zuiging uit via de slang die is verbonden met de elektrodehoudster om een gigaohm-afdichting te creëren.

Houd de spanning op nul millivolt. Compenseer na de vorming van de gigaohm-afdichting de snelle en langzame capaciteit handmatig of automatisch. Oefen vervolgens een korte en krachtige zuiging uit via de slang om in de whole-cell-modus te breken.

Vervolgens registreert u geïnduceerde IPSC-stromen in voltage clamp-modus. Geef enkele of gepaarde GABA-puffs af via de puff-micropipet die wordt bestuurd door een Master-8 voltage-step generator. Verander de duur van de puff om de beste geïnduceerde IPSC-stromenresultaten te verkrijgen en meet de geïnduceerde IPSC-stromen in het LPS-geïnduceerde depressiemodel.

Hier worden de monster-IPSC's weergegeven die worden geïnduceerd door 10, 50 en 100 micromolar GABA. En hier zijn de puffduurresponscurven. De herhaalde stromen die worden opgewekt door GABA bij 50 micromolar puffs met interpuffintervallen van één, twee of drie seconden worden hier getoond.

Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om gezonde hersensneden te verkrijgen. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van farmacologische toediening om het effect van geneesmiddelen in de elektrofysiologie te verkennen.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de farmacologische toediening in whole-cell patch-clamp opname kunt uitvoeren. Vergeet niet dat het werken met TTX uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.