Name: Geheel-cel stromingen geïnduceerd door Puff toepassing van GABA in de hersenen segmenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Leer de puff-techniek voor farmacologische toediening tijdens whole-cell patch-clamp opnames in hersensneden. Deze methode voorkomt receptor-desensitisatie en versnelt onderzoek naar elektrofysiologische processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank de volgende organisaties: nationale Natural Science Foundation van China (31171018, 31171355), de wetenschap en technologie afdeling van Guangdong (2013KJCX0054), de Natural Science Foundation van de Guangdong provincie ( 2014A030313418, 2014A030313440), en Guangzhou wetenschap en technologie Bureau (201607010320).

Dierverblijven en alle dier experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de procedures die zijn goedgekeurd door de ethische commissie voor dierlijke onderzoek bij South China Normal University, volgens de richtsnoeren voor Animal Care opgericht door het National Institute of Gezondheid.
 1. bereiding van de oplossingen <ol><li>bereiden 500 mL van de standaard kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) met de componenten die in onze gepubliceerde werk 7 beschreven, zoals vermeld in tabel 1.
	<ol><li>Gebruik schone glazen bekers met gedeïoniseerd water tot het bereiden van een verse ACSF-oplossing. Spatels met gedeïoniseerd water schoon en droog zijn voordat u met toevoegen van NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glucose, en voeg de CaCl 2 na gelet borrelen de oplossing met 95% O 2 / 5% CO 2 mengsel voor ~ 20 min (zoals aangegeven in tabel 1) tot 500 mL gedeïoniseerd water. Roer tot het volledig ontbonden.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de ACSF volledig is wissen zonder enige neerslag. Vervolgens Breng de pH op 7,2-7.4. Bellendiagram met een mengsel van koolwaterstofgassen bestaat uit 95% O 2 en 5% CO 2 voor ~ 20 min.</li>
	</ol></li> <li>Bereiden 250 mL segment snijden oplossing met de chemicaliën 7 beschreven in tabel 2.
	<ol><li>KCl, MgCl 2 NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glucose toevoegen en voeg de CaCl 2 laatste zoals vermeld in 1.1.1, aan 250 mL gedeïoniseerd water en ontbinden als beschreven in 1.1.1 en 1.1.2.</li>
		<li>Na borrelen met 95% O 2 / 5% CO 2, plaatst de oplossing in een vriezer voor 15-20 min zodat de snij-oplossing wordt ijskoud en gedeeltelijk bevroren. 
		Opmerking: We gebruiken deze oplossing snijden bij het maken van segmenten van 1-2 maand-oude muizen; de formule kan verschillen voor muizen ouder dan 2 maanden.</li>
		<li>Bereiden LPS oplossing door ontbinding in steriele endotoxine-vrije isotonische zoutoplossing (0,9% NaCl). LPS is intraperitoneally toegediend (0,5 mg/kg) en beginnen met het opnemen van 2 h later.</li>
	</ol></li></ol> 2. Voorbereiding van de prefrontale Cortex Slice <ol><li>de snij-oplossing uit de vriezer en meng hiervoor een slush. Plaats van de oplossing op ijs en bubble voortdurend met 95% O 2 / 5% CO 2.</li>
	<li>Met grote, scherpe schaar, snel decapitate een muis als beschreven 9 en onmiddellijk het hoofd in een bekerglas gevuld met ijskoude (0-4 ° C) snijden oplossing.</li>
	<li>De bovenkant van de schedel langs de middellijn in een richting caudal-naar-nasale snijd met een fijn schaar en de laterale schedel gedeelten worden verwijderd. Verwijderen van de hersenen met een fijne spatel en neerzetten in ijskoude snijden oplossing. 
	Opmerking: Stappen 2.2-2.3 snel moeten worden gedaan (ideaal &#60; 1 min).</li>
	<li>Plaatst de hersenen op het deksel van een 9 cm petrischaal gevuld met ijs. Spoel de hersenen met ijskoude snijden oplossing. Afgesneden van het cerebellum en de bulbus olfactorius met een scheermesje.</li>
	De houder van de <li>toepassen Cyanoacrylaat lijm met het model van een vibratome. Zorgvuldig plaats de hersenen blokkeren op de druppel lijm, rostraal kant naar boven, en onmiddellijk onder te dompelen in ijskoud snijden oplossing.</li>
	<li>De meshouder voor de vibratome onder een hoek van 15° ten opzichte van het horizontale vlak aanpassen en bereiden van 350-µm coronale hersenen segmenten (lemmet vibratie frequentie = 85 Hz, snelheid = 0.1 mm/s).</li>
	<li>Met behulp van een precisiepipet, overdracht de plakjes in de bedwelmingsruimte herstel gevuld met ACSF, Incubeer gedurende 1 h (op RT) met het constant borrelen van 95% O 2 / 5% CO 2.</li>
</ol> 3. Geheel-cel Patch opnemen <ol><li>Make glas borosilicaat micropipetten voor gebruik als opname elektroden of bladerdeeg micropipetten volgens de specifieke richtsnoeren in de bedieningshandleiding van de trekker. Voor het opnemen van elektroden, tip weerstanden zijn in het bereik 4-6 M &#8486;, terwijl bladerdeeg micropipetten tip diameters in het bereik 2-5 µm.</li>
	<li>Nb + kanaal blocker (TTX, 1 µM), toevoegen aan blok snel nb + kanaal en dus actie potentieel, naar ACSF en onderhouden van een constant debiet van deze oplossing van 2-3 mL/min bij de kamer van de opname, door peristaltische pomp in de kamer en aspiratie van te maken. Bubble van het ACSF met 95% O 2 / 5% CO, 2 voortdurend om de levensvatbaarheid van de plakjes.</li>
	<li>Pipetteer een plakje van de hersenen in de zaal van de opname met behulp van een gemodificeerde Pipet van Pasteur waarvan fijne punt werd gesneden te passen de segmentgrootte. Betrekking hebben op het segment met een platina segment anker met parallelle nylon draden verdeelde &#8805; 2 mm uit elkaar te houden van het segment op het perron.</li>
	<li>Vullen de micropipet van de opname met interne oplossing 7 (tabel 3), en vul de bladerdeeg micropipetten met GABA op 10 µM, 50 µM, en 100 µM (ontbonden in ACSF) of ACSF als voertuig besturingselement.</li>
	<li>Om te voorkomen dat de blokkade met puin, licht positieve druk met behulp van een injectiespuit 1 mL voordat het onderdompelen van de elektrode van de opname in de ACSF van toepassing. Met behulp van een micromanipulator onder een microscoop (4 x objectief), plaatst u de opname elektrode en bladerdeeg micropipet zodat de tips worden weergegeven in het midden van het videobeeld in de monitor ( Figuur 1).</li>
	<li>Pas de focus van de Microscoop (40 x objectief) terwijl het geleidelijk verminderen van de micropipet bladerdeeg en plaatst u deze boven de opname neuron onder een hoek van 45°. Houd de afstand tussen het uiteinde van de micropipet van bladerdeeg en het neuron opgenomen tussen 20-40 µm ( Figuur 1 B). Langzaam maar zeker naderen het neuron met de opname-elektrode en laat de overdruk. Een zwak en kort afzuigen door de buis aangesloten op de elektrode-houder waarmee een giga-ohm zegel.</li>
	<li>Behouden de spanning aan 0 mV. Na de vorming van het zegel van de giga-ohm, compenseren voor snelle en trage precisiecapaciteit handmatig of automatisch. Vervolgens afzuigen een korte en sterke via de slang geheel-cel modus bovengenoemde.</li>
	<li>Record eIPSC in spanning-clamp modus. Lage gasdruk (stikstof, 4-6 psi) van toepassing op de micropipet van de bladerdeeg met behulp van een Picospritzer, aangestuurd door een Master 8 spanning stap generator te leveren van enkele of gekoppelde GABA Soezen ( Figuur 2).</li>
	<li>Wijzigen van de duur van de bladerdeeg voor het verkrijgen van de beste eIPSC resultaten ( Figuur 3) en het meten van de eIPSC in het LPS-induced depressie model ( Figuur 4).</li>
</ol>

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li>
<li>Dickinson, G. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+determining+the+recruitment+of+inositol+trisphosphate+receptor+channels+during+calcium+puffs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs.</a> Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Columnar+distribution+of+activity+dependent+gabaergic+depolarization+in+sensorimotor+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons.</a> Mol Brain. 5, 33(2012).</li>
<li>Glykys, J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+main+source+of+ambient+GABA+responsible+for+tonic+inhibition+in+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus.</a> J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+modulates+KCC2+expression+and+function+in+hippocampal+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+interleukin-1+and+endotoxin+in+the+forced+swim+and+tail+suspension+tests+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice.</a> Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).</li>
<li>Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Patch-clamp+Recordings+from+the+Somatodendritic+Domain+of+Nigral+Dopamine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Wondolowski, J., Frerking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-dependent+postsynaptic+expression+of+kainate+receptors+on+hippocampal+interneurons+in+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1.</a> J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).</li>
<li>Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+regulates+Cav1.2+L-type+calcium+channel+levels+and+function+to+influence+GABAergic+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity.</a> J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).</li>
<li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Cortical+GABAergic+Dysfunction+Contributes+to+Aberrant+UP-State+Duration+in+APP+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice.</a> Cereb Cortex. , (2016).</li>
<li>Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+Acts+through+Nicotinic+Receptors+to+Enhance+the+Firing+Rate+of+a+Subset+of+Hypocretin+Neurons+in+the+Mouse+Hypothalamus+through+Distinct+Presynaptic+and+Postsynaptic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms.</a> eNeuro. 2 (1), (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Bladerdeeg toepassing wordt algemeen gebruikt ter beoordeling van postsynaptisch receptor functie3,4,7, maar vereist nauwkeurige controle in elk experiment. Hier beschrijven we een procedure waarbij geheel-cel patch klemmen, waaruit blijkt hoe dat Gaba-bladerdeeg geïnduceerde IPSCs (bijvoorbeeld eIPSCs) in plakjes van de prefrontale corticale hersenen. De weerstand van de opname-elektrode is ongeveer 5 MΩ, terwijl de tip diamete...

De patch-clamp techniek, een primaire hulpmiddel voor het onderzoeken van de elektrische signalen in neuronen, werd ontwikkeld in de jaren 19701,2. Een groot voordeel van deze techniek is dat het geeft kennis over hoe specifieke behandelingen (bijvoorbeeld farmacologische) neuronale functies of kanalen in real-time3kan wijzigen. Farmacologische evaluatie van neuronale functie tijdens geheel-cel opnemen in een segment van de hersenen vereist de toepassing van drugs, zoals agonisten of antagonisten van specifieke receptoren, om de neuronen wordt opgenomen. Met deze methode kunt de identificatie van neuronale veranderingen die zich na toepassing van een specifieke drug voordoen, dus leidt tot een beter begrip van de fysiologische en pathologische eigenschappen van de neuronen4. Hoewel farmacologische administratie kan worden uitgevoerd via beide perfusie5 of bladerdeeg6, is de laatste de superieure techniek. In het bijzonder: (i) bladerdeeg toepassing snel toeneemt drug concentratie rond de opgenomen neuron tot een niveau dat desensibilisatie van het membraan-receptoren wordt verhinderd; (ii) het volume van de drug gepofte is extreem laag, zodat er weinig effect op de bad-oplossing, waardoor dus eventuele ongewenste effecten van de door de overheid gereguleerde chemische stoffen op de hersenen segmenten; (iii) het bladerdeeg-protocol kan worden ingesteld en opgeslagen, waardoor het experiment zeer nauwkeurig worden gereproduceerd; (iv) bladerdeeg toepassing vertegenwoordigt economische hetgebruikvan agonisten/antagonisten, bijzonder wanneer dergelijke reagentia zijn duur of moeilijk te verkrijgen.
Hier, zullen we ons richten op recording geheel-cel stromingen geïnduceerd door puffend GABA in terdege voorbereid hersenen plakjes, een preparaat dat het voordeel van relatief goed bewaard gebleven hersenen circuits heeft. Hoe voeren we bladerdeeg-geïnduceerde remmende stromingen7 zal in dit artikel worden beschreven. Met behulp van cesium (Cs+)-op basis van interne oplossingen en houden van de neuronen op 0 mV, we zullen introduceren GABA-bladerdeeg opgeroepen remmende postsynaptisch stromingen (eIPSCs) met passende technische details. Met behulp van een muismodel van depressie veroorzaakt door lipopolysaccharide (LPS) injectie8, laten we zien dat de eIPSC amplitude opgeroepen door een GABA-bladerdeeg aanzienlijk verminderd in plakjes van LPS-geïnjecteerd muizen in vergelijking met controle van het voertuig. Onze bedoeling is dat dit artikel laten hoe de bladerdeeg techniek breed toepasbaar is aan studies gericht zien moet op de evaluatie van het effect van chemische stoffen, stoffen of geneesmiddelen op neuronale activiteiten in plakjes van de hersenen.

<table><tbody><tr><td>Glass Borosilicate micropipettes</td><td>Shutter Instruments</td><td>BF150-86-10</td><td>1.50 mm buitendiameter; 0.86 mm binnendiameter</td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Shutter Instruments</td><td>MODEL P-97&nbsp;</td><td>Flaming/Brow Micropipette Puller</td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Shutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Computer controlled Amplifier&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Digital Acquisition system&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Camera</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>2115001</td><td>Inspectieapparatuur</td></tr><tr><td>Microscopy&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipse FN1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Master 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8 Pulse stimulator</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Slicer</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Gillette</td><td>74-S</td><td>FLYING EAGLE</td></tr><tr><td>Video monitor</td><td>Panasonic</td><td>WV-BM 1410</td><td></td></tr><tr><td>502 Glue</td><td>Deli</td><td>7146</td><td>Cyanoacrylaatlijm</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Shanghai JIA PENG Corporation</td><td>BT100-1F</td><td></td></tr><tr><td>Video Camera</td><td>Olympus America Medical</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Pipets</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr></tbody></table>

geheel-cel stromingen geïnduceerd door puff toepassing van gaba in de hersenen segmenten

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Farmacologische beheer wordt vaak gebruikt bij het uitvoeren van geheel-cel patch-clamp opnemen in plakjes van de hersenen. Een van de beste methoden van drug aanvraag tijdens elektrofysiologische opname is de techniek van bladerdeeg, die kan worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van farmacologische reagentia op neuronale activiteiten in plakjes van de hersenen. Het grootste voordeel van bladerdeeg toepassing is dat de concentratie van de drug rond de opname site snel verhoogt, waardoor desensibilisatie van membraan receptoren. Succesvol gebruik van bladerdeeg toepassing gepaard gaat met aandacht voor de volgende elementen: de concentratie van het geneesmiddel, de parameters van de micropipet van bladerdeeg, de afstand tussen het uiteinde van een puff-micropipet en het neuron opgenomen, en de duur en Druk het bladerdeeg rijden (pond per vierkante inch, psi). Dit artikel beschrijft een stapsgewijze procedure voor het vastleggen van geheel-cel stromingen geïnduceerd door puffend gamma - aminoboterzuur (GABA) op een neuron van een prefrontale corticale segment. Dezelfde procedure kan met name worden toegepast met kleine wijzigingen aan andere hersengebieden zoals de hippocampus en de striatum en verschillende preparaten, zoals celculturen.

De bladerdeeg-techniek kan onderzoekers te bestuderen van het effect van drugs op bepaalde receptoren op het oppervlak van een bepaalde neuron. In dit artikel focussen we op stromingen gemedieerd door GABA receptoren. Figuur 1 toont de bladerdeeg en opname micropipetten. Te heffen geen effect op opgenomen neuronen van de fysieke druk gegenereerd door het bladerdeeg, ACSF en sacharose soezen(Figuur 2)worden gebrui...

We beschrijven de bladerdeeg-techniek, waarbij farmacologische reagentia tijdens geheel-cel patch-clamp opname kunnen worden beheerd, en benadrukken verschillende aspecten van de functies die cruciaal voor het succes ervan zijn.

Geheel-cel stromingen geïnduceerd door Puff toepassing van GABA in de hersenen segmenten

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

Het algemene doel van deze puff-techniek is om de farmacologische toediening uit te voeren in whole-cell patch-clamp opname. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van elektrofysiologie, zoals farmacologische toediening. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de concentratie van het medicijn rond de opnameplaats snel toeneemt, waardoor de membraanreceptoren worden beschermd tegen desensibilisatie.Over het algemeen zullen mensen die onbekend zijn met deze methode worstelen omdat de voorbereiding van een acute prefrontale cortex slice en de positie van de puff micropipette relatief moeilijk zijn. Om deze procedure te starten, verplettert u de bevroren snijoplossing om een slush te verkrijgen. Houd de slushy-oplossing op ijs en laat het met 95% zuurstof en 5% kooldioxide borrelen.Plaats vervolgens de gedissekteerde kop in een beker gevuld met ijskoude snijoplossing en haal hem na een paar seconden eruit. Snijd de schedel langs de middenlijn in een caudal-rostrale richting met fijne schaar en verwijder de laterale schedelgedeelten. Verwijder vervolgens de hersenen met een fijne spatel en laat ze vallen in de ijskoude snijoplossing.Plaats vervolgens de hersenen op het deksel van een negen centimeter Petri-schaal gevuld met ijs. Spoel de hersenen met ijskoude snijoplossing. Snijd vervolgens de kleine hersenen en reukbol af met een scheermesje.Vervolgens brengt u cyanoacrylaatlijm aan op de Vibratome-monsterhouder. Plaats de hersenblok voorzichtig op een druppel lijm, met de rostrale kant omhoog, en dompel het onmiddellijk onder in de ijskoude snijoplossing. Stel de meshouder in op een hoek van 15 graden ten opzichte van het horizontale vlak.Snijd de hersenweefsels in 350 micron coronale plakken. Breng vervolgens de plakken over naar de hersteelkamer gevuld met ACSF en incubeer ze een uur met constant borrelen van 95% zuurstof, 5% kooldioxide. In ons experiment is de voorbereiding van een acute prefrontale cortex slice ook van cruciaal belang in de procedure.Een gezonde hersensnede betekent actieve neuronen die stevig kunnen worden gepatcht. Maak in deze procedure glazen borosilicaat micropipetten voor gebruik als opname-elektroden of puff-micropipetten. Voor opname-elektroden zijn de tipweerstanden in het bereik van vier tot zes megaohm, terwijl puff-micropipetten tipdiameters hebben in het bereik van twee tot vijf micrometer.Voeg natriumkanaalblokker toe aan ACSF om snelle natriumkanalen en dus actiepotentialen te blokkeren en onderhoud een constante stroomsnelheid van deze oplossing van twee tot drie milliliter per minuut in de opnamekamer. Laat de ACSF constant borrelen met 95% zuurstof, 5% kooldioxide om de levensvatbaarheid van de plakken te garanderen. Breng een hersensnede over naar de opnamekamer met behulp van een Pasteur-pipet met een fijne punt die is gesneden om de grootte van de plak te passen.Plaats vervolgens een platina plakanker boven de plak om deze op het platform te houden. Vul vervolgens de opname-micropipetten met interne oplossing en vul de puff-micropipetten met GABA bij 10 micromolar, 50 micromolar en 100 micromolar, of ACSF als vehikelcontrole. Om verstopping met puin te voorkomen, oefent u lichte positieve druk uit met behulp van een spuit van één milliliter voordat u de opname-elektrode in de ACSF onderdompelt.Positioneer onder een microscoop de opname-elektrode en puff-micropipet zodat de uiteinden in het midden van de monitor verschijnen. Identificeer vervolgens een doelneuron. Pas de microscoopfocus aan terwijl u de puff-micropipet geleidelijk verlaagt en plaats deze boven het opnameneuron onder een hoek van 45 graden.Houd de afstand tussen het uiteinde van de puff-micropipet en het doelneuron in het bereik van 20 tot 40 micrometer. Nabij de neuron met de opname-elektrode en laat vervolgens de positieve druk los. Oefen een zwakke en korte zuiging uit via de slang die is verbonden met de elektrodehoudster om een gigaohm-afdichting te creëren.Houd de spanning op nul millivolt. Compenseer na de vorming van de gigaohm-afdichting de snelle en langzame capaciteit handmatig of automatisch. Oefen vervolgens een korte en krachtige zuiging uit via de slang om in de whole-cell-modus te breken.Vervolgens registreert u geïnduceerde IPSC-stromen in voltage clamp-modus. Geef enkele of gepaarde GABA-puffs af via de puff-micropipet die wordt bestuurd door een Master-8 voltage-step generator. Verander de duur van de puff om de beste geïnduceerde IPSC-stromenresultaten te verkrijgen en meet de geïnduceerde IPSC-stromen in het LPS-geïnduceerde depressiemodel.Hier worden de monster-IPSC's weergegeven die worden geïnduceerd door 10, 50 en 100 micromolar GABA. En hier zijn de puffduurresponscurven. De herhaalde stromen die worden opgewekt door GABA bij 50 micromolar puffs met interpuffintervallen van één, twee of drie seconden worden hier getoond.Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om gezonde hersensneden te verkrijgen. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van farmacologische toediening om het effect van geneesmiddelen in de elektrofysiologie te verkennen.Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de farmacologische toediening in whole-cell patch-clamp opname kunt uitvoeren. Vergeet niet dat het werken met TTX uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen, altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

whole-cell-currents-induced-puff-application-gaba-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We maken gebruik van de patch-clamp techniek om GABA-geactiveerde single-channel stromingen (GABAA-kanalen, GABAA-receptoren) en de synaptische en tonische stromen ze genereren in neuronen te meten. Activering van de kanalen af ​​neuronale prikkelbaarheid bij gezondheid en...

GABA-geactiveerde Single-kanaal en Tonic Stromingen in hersenen van de rat Slices

This video demonstrates the recording of whole-cell currents induced by gamma-aminobutyric acid, or GABA, in a mouse prefrontal cortical brain slice. Controlled delivery of GABA opens chloride channels in a postsynaptic neuron, generating inhibitory postsynaptic currents, or IPSCs. These IPSCs increase with higher GABA concentrations, reflecting GABA's inhibitory activity on synaptic transmission.

Recording Whole-Cell Currents with GABA Puffing in a Mouse Brain Slice

Corticale netwerken worden gecontroleerd door een kleine, maar gevarieerde set van remmende interneuronen. Functioneel onderzoek van interneuronen vereist daarom gerichte opname en strenge identificatie. Hier beschreven is een gecombineerde aanpak met whole-cell opnames van enkele of synaptically gekoppelde paren van neuronen met intracellulaire etikettering, post-hoc-morfologische en immunocytochemische analyse.

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

Trillingen zijn fundamentele netwerk-eigenschappen en worden gemoduleerd door ziekte en drugs. Studeren brain-slice oscillaties laat karakterisering van geïsoleerde netwerken onder gecontroleerde omstandigheden. Protocollen zijn voorzien voor de voorbereiding van acute hersenen plakjes voor het oproepen van CA1 γ oscillaties.

Generatie van Local CA1 γ Oscillations door Tetanische Stimulation

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Hier presenteren we protocollen om te ontdekken van verbindingen actief bij GABAA -receptoren, van de binding aan de Fysiologie en farmacologie.

Methoden voor de ontdekking van nieuwe verbindingen moduleren van een Receptor Gamma - aminoboterzuur Typ een transmissie

Acute inbeslagneming modellen zijn belangrijk voor de studie van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de epileptiform gebeurtenissen. Bovendien biedt de mogelijkheid om het genereren van epileptiform evenementen op afroep een zeer efficiënte methode om te bestuderen van de exacte volgorde van de gebeurtenissen ten grondslag liggen aan hun inleiding. Hier beschrijven we de acute 4-aminopyridine corticale inbeslagneming modellen gevestigd in muis en menselijk weefsel.

Generatie en On-Demand inleiding van Acute Ictale activiteit in knaagdier en menselijk weefsel

Hier beschrijven we de essentiële stappen voor geheel-cel patch-clamp opnamen gemaakt van substantia gelatinosa (SG) neuronen in het ruggenmerg in vitro segment. Met deze methode kunt de eigenschappen van het intrinsieke membraan, synaptische transmissie en morfologische karakterisering van SG neuronen worden bestudeerd.

Voorbereiding van Acute ruggenmerg segmenten geheel-cel Patch-clamp opname in neuronen van de Substantia Gelatinosa

Het gepresenteerde protocol beschrijft het transport en de voorbereiding van resected menselijk hippocampal weefsel met het uiteindelijke doel om vitale hersenenplakjes te gebruiken als een preklinische evaluatie tool voor potentiële anti-epileptica.

Voorbereiding van acute menselijke hippocampal slices voor elektrofysiologische opnames

Ex vivo hersenplakken kunnen worden gebruikt om de effecten van vluchtige anesthetica op opgeroepen reacties op afferente inputs te bestuderen. Optogenetica wordt gebruikt om zelfstandig thalamocorticale en corticocorticale afferente stoffen te activeren voor niet-primaire neocortex, en synaptische en netwerkresponsen worden gemoduleerd met isofluraan.

Optogenetische activering van afferente paden in hersenplakken en modulatie van reacties door vluchtige anesthetica

Dit artikel is bedoeld om een systematisch protocol te beschrijven om horizontale hippocampale hersenplakken bij muizen te verkrijgen. Het doel van deze methodologie is om de integriteit van hippocampale vezelroutes te behouden, zoals het perforantpad en het bemoste vezelkanaal om deukende gyrusgerelateerde neurologische processen te beoordelen.

Horizontale Hippocampal Plakjes van de Hersenen van de Muis

Leer de puff-techniek voor farmacologische toediening tijdens whole-cell patch-clamp opnames in hersensneden. Deze methode voorkomt receptor-desensitisatie en versnelt onderzoek naar elektrofysiologische processen.

Geheel-cel stromingen geïnduceerd door Puff toepassing van GABA in de hersenen segmenten

Meer video's verkennen