Visualiseren van extracellulaire Traps Macrophage met behulp van de Confocal Microscopie
19 oktober 2017
Macrophage vallen extracellulaire een nieuw beschreven entiteit. Dit artikel zal zich concentreren op confocale microscopie methodes en hoe ze zijn gevisualiseerd in vitro en in vivo van longkanker monsters.
Het algemene doel van deze methode is om aan te tonen hoe macrofaag extracellulaire vallen kunnen worden gevisualiseerd en bestudeerd met behulp van confocale microscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontsteking, zoals reacties op infecties en andere immuunstimuli. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een aanpassing is van een goed gevestigde methode die is gebruikt om neutrofiele extracellulaire vallen te bestuderen.
Demonstratie van deze procedure zal worden uitgevoerd door Roleen Sharma. Na het verkrijgen van longmacrofagen uit mensen en muizen door bronchoalveolaire lavage, of BAL, volgens het tekstprotocol, gebruik trypanblauw en een hemocytometer om een levende celtelling uit te voeren op de BAL-oplossing. Pipetteer een tot vier keer 10 tot de vijfde macrofagen in 500 microliters kweekmedium op dekglasjes in de putjes van 24-well platen, en incubeer vervolgens de cellen bij 37 graden Celsius overnacht voor het hechten van de cellen.
Verwijder het kweekmedium en gebruik PBS om de cellen eenmaal te wassen. Voeg vervolgens 2%paraformaldehyde-periodaat-lysine, of PLP fixatief, toe en incubeer de monsters gedurende 10 minuten. Na gebruik van PBS om de cellen kort te wassen, voeg 0,2%TWEEN 20 in PBS toe en incubeer de cellen gedurende 20 minuten.
Vervolgens, om de cellen te blokkeren, voeg 10% kippenserum toe in 5% BSA, verdund in PBS en incubeer de monsters op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Vervolgens vervangt u de blokoplossing door een één op honderd concentratie primaire en isotoop controle-antilichamen en incubeer de cellen op kamertemperatuur gedurende een uur. Na de incubatie, gebruik PBS om de cellen te wassen voordat u de bijbehorende secundaire antilichamen toevoegt.
Vervolgens incubeert u de monsters gedurende 40 minuten op kamertemperatuur. Na het wassen van de cellen in PBS, monteert u de monsters met DAPI-gebaseerde montagemedium, en visualiseer vervolgens de monsters met behulp van een confocale microscoop. Om de FFPE-monsters voor te behandelen met antigeenretrievaloplossing, droog de dia's in de oven gedurende 60 minuten op 60 graden Celsius.
Breng vervolgens de dia's over in xyleenoplossing gedurende 30 minuten voordat u de monsters overbrengt naar 70% ethanol op kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Na het spoelen van de dia's met kraanwater, plaatst u ze in hittebestendige plasticfolie en onderwerpt u ze aan hogere antigeenretrieval door ze in een snelkookpan in Tris-EDTA pH 9,0 te plaatsen gedurende 10 minuten. Koel de monsters gedurende 20 minuten en breng ze vervolgens over naar kraanwater.
Plaats ze vervolgens vijf minuten op een slinger. Herhaal de kraanwaterwas en was vervolgens de dia's één keer in PBS op de slinger. Om de monsters te blokkeren, voegt u 10% kippenserum toe in 5% BSA PBS en incubeert u ze op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
Vervolgens, om macrofaag extracellulaire vallen, of METs in macrofagen, te definiëren, voegt u een één op honderd verdunning van primaire antilichamen toe in 1% BSA PBS en incubeert u de dia's bij vier graden Celsius gedurende 16 uur. Gebruik PBS om de monsters twee keer op een slinger gedurende vijf minuten te wassen. Voeg de bijbehorende fluorescerende secundaire antilichamen toe in 1% BSA PBS en incubeer de dia's op kamertemperatuur gedurende 40 minuten.
Na PBS-wassingen, gebruik DAPI-bevattend montagemedium om de chromatine te kleuren en de monsters te monteren. Gebruik een confocale laserscanningkop die is bevestigd aan een omgekeerde microscoop om fluorescente beelden vast te leggen met behulp van 20X 0,1 NA lucht en 40X 1,0 NA olieobjectieven. Leg enkele vlak 512 bij 512 pixel beelden vast door op de knop Line Sequential leveling te klikken.
Verkrijg ten minste 10 gezichtsvelden per sectie voor analyse en gegevens voor elk resultaat. Om de secties in microcentrifugebuizen te kleuren, voegt u de relevante primaire antilichamen toe in 200 microliter volumes en incubeer de monsters bij vier graden Celsius gedurende 16 uur. Was de secties in PBS drie keer gedurende 10 minuten voordat u de juiste secundaire antilichamen toevoegt en de monsters op kamertemperatuur gedurende een uur incubeert.
Gebruik DAPI om de longsecties in oplossing te kleuren en incubeer de monsters gedurende 20 minuten voordat u dekglasjes toevoegt aan de secties op microscoopglazen in PBS. Gebruik een omgekeerde confocale microscoop met een 40X 1,3 NA objectief, uitgerust met 405 nanometer, 440 nanometer, 473 nanometer, 543 nanometer en 635 nanometer lasers, om beelden vast te leggen en 3D Z-stacks op te nemen, 0,54 micrometer dik, met optimale Z-sectie. Ten slotte analyseert u de beelden volgens het tekstprotocol.
Een voorbeeld van METs in een BAL-monster wordt hier getoond. Het eerste detecteerbare kenmerk is de beweging van de kern naar de rand van de cel, zoals te zien is in deze eerdere fase MET die een ruwweg bolvormige vorm heeft. Dit wordt gevolgd door extracellulair chromatine met andere co-geëxprimeerde mediators, zoals H3Cit en granulaire proteasen, zoals te zien is in deze meer volwassen MET.
Eerdere fase MET bevindt zich linksboven en latere fase MET bevindt zich hieronder in het midden. Longweefsel METs worden in deze figuur getoond. Omdat de longen worden opgeblazen met vloeistof om de longarchitectuur te definiëren, worden de METs tegen de alveolaire wanden geduwd.
De morfologie van de METs zal ook variëren afhankelijk van in welke vlak het weefsel is gesneden. De standaard secties die worden gebruikt voor longweefsel monsters zijn vier tot vijf micron dik. Dikkere weefselsecties maken het mogelijk om meerdere beelden te maken en de METs kunnen vervolgens in 3D worden bekeken.
Een voorbeeld van een 3D-beeld van muislongweefsel gesneden in 25 tot 35 micron secties wordt hier gepresenteerd. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee dagen worden uitgevoerd met
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel richt zich op de visualisatie van extracellulaire trappen van macrofagen met behulp van confocale microscopietechnieken. Er worden zowel in vitro- als in vivo-methoden besproken die zijn toegepast op longmonsters.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Macrophage extracellular traps zijn een onlangs beschreven entiteit.
- Het begrijpen van hun rol bij ontsteking is essentieel voor onderzoek naar de immuunrespons.
- Confocale microscopie is een krachtig instrument voor het visualiseren van deze structuren.
- Deze methode bouwt voort op gevestigde technieken die worden gebruikt voor neutrophil extracellular traps.
Doel van de studie
- Om de visualisatie van extracellulaire trappen van macrofagen te demonstreren.
- Om reacties op infecties en immuunstimuli te onderzoeken.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Isolatie van longmacrofagen van mensen en muizen via bronchoalveolaire lavage (BAL).
- Telling van levensvatbare cellen met behulp van trypanblauw en een hemocytometer.
- Celkweek op dekglasjes in 24-wells platen.
- Incubatie van cellen bij 37 °C voor adhesie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van extracellulaire vallen van macrofagen.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode bij het bestuderen van immuunresponsen.
- Verfijning van het protocol voor verbeterde duidelijkheid en reproduceerbaarheid.
- Bijdrage aan het begrip van macrofagenfuncties bij inflammatie.
Conclusies
- De confocale microscopie-methode is effectief voor het bestuderen van extracellulaire trappen van macrofagen.
- Deze techniek kan het onderzoek naar ontstekingen en immuunresponsen bevorderen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methodologie om verdere implicaties te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Het visualiseren van extracellulaire trappen van macrofagen (METs) biedt een mechanische aflezing van de activatie van de aangeboren immuniteit, wat relevant is voor de modellering van inflammatoire ziekten. Deze confocale microscopiebenadering maakt risicoreductie van targets mogelijk door blootstelling aan stimuli te koppelen aan kwantificeerbare chromatinevrijgave en co-expressie van proteasen. De methode ondersteunt vroege discovery-workflows waarbij inzicht in door macrofagen gedreven pathologie bijdraagt aan targetvalidatie en fenotypische screeningsstrategieën.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroegtijdige Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om macrofaagactivatietoestanden te onderzoeken via directe visualisatie van extracellulair chromatine en co-expressie van mediatoren zoals gecitrullineerde histonen en granuleproteasen.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare op beeldvorming gebaseerde assay om gestimuleerde versus ongestimuleerde condities te vergelijken voor modulatie van de doelroute.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt hypothesetesten in ontstekingsmodellen door de vorming van MET te correleren met functionele immuunresponsen op infecties of stimuli.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor analyse: Genereert gestandaardiseerde, kwantificeerbare imaging-outputs (bijv. chromatinevrijgave, H3Cit, protease-colokalisatie) die geschikt zijn voor aanpassing naar high-content screening.
- Reproduceerbaarheid: Bevat ingebouwde controles (achtergrond, isotype, ongestimuleerd) om de specificiteit van de analyse te waarborgen en fout-positieve signalen bij de evaluatie van verbindingen te verminderen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met zowel in vitro celkweek als ex vivo longweefselcoupes, wat consistentie tussen modellen mogelijk maakt in studies naar target engagement.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert direct macrofaag-gestuurde processen bij longontsteking, wat aansluit bij preklinische studies naar fibrotische, infectieuze of auto-immuun longziekten.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en in vivo longweefselanalyse, wat een biomarker-gebaseerde progressie van ontdekking naar preklinische validatie ondersteunt.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Maakt objectieve beoordeling van de vorming van extracellulaire trappen door macrofagen mogelijk als functionele read-out voor go/no-go-criteria bij het screenen van immunomodulatoren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetests van targets tot lead-optimalisatie, waarbij MET-visualisatie dient als een functionele assay voor de immuunrespons in programma's gericht op inflammatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door chromatin-extrusie en protease-vrijgave te visualiseren als downstream-gevolgen van targetmodulatie in macrofagen.
- Screening: Maakt kwantitatieve imaging-read-outs mogelijk die via beeldanalysesoftware kunnen worden geautomatiseerd om de effecten van verbindingen op MET-vorming over verschillende doseringsbereiken te beoordelen.
- Analytics: Levert multiparametrische gegevens (chromatine, gecitrullineerde histonen, protease-co-expressie), waardoor statistische vergelijking van experimentele groepen voor targetprioritering mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert cross-species vergelijkingen (menselijke en muizenlongmacrofagen) en ex vivo weefselvalidatie, wat de translatabiliteit van preklinisch naar klinisch onderzoek versterkt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar imaging-platform dat toepasbaar is op meerdere inflammatoire targets en ziektemodellen buiten de initiële validatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar macrofaagactivatie door direct visueel bewijs te leveren van de vorming van extracellulaire trappen en moleculaire co-expressie.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows voor monstervoorbereiding, kleuring en beeldvorming, waardoor de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en de consistentie van gegevens bij immuunprofilering worden verbeterd.
- Strategische waarde: Informeert vroege portfoliobeslissingen door targetinhibitie te koppelen aan meetbare reducties in de vorming van pathogene MET, waardoor het risico op uitval in een laat stadium wordt verkleind.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van immunomodulerende kandidaten mogelijk op basis van functionele modulatie van het macrofaagfenotype in plaats van enkel op basis van bindingsaffiniteit.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in immunofluorescentiekleuring, het bedienen van confocale microscopie en beeldanalyse voor een nauwkeurige detectie en kwantificering van MET.
- Afhankelijk van toegang tot confocale laser-scanning microscopen met geschikte objectieven (bijv. 20X lucht, 40X olie) en laserlijnen voor multichannel fluorescentiedetectie.
- Noodzaak van gestandaardiseerde antilichaampanels en titratieprotocollen om specifieke detectie van chromatine, gecitrullineerde histonen en granula-proteasen over verschillende monstertypes heen te waarborgen.
- Omvat optimalisatiestappen voor antigeenherstel in FFPE-longweefsel, waaronder drukgebaseerd herstel in Tris-EDTA pH 9.0, om de toegankelijkheid van epitopen te behouden.
- Beperkt door de noodzaak van zorgvuldige wasstappen om delicate extracellulaire trap-structuren tijdens de kleuring te behouden, aangezien agressieve behandeling de NET/MET-morfologie kan verstoren.
