Visualiseren van extracellulaire Traps Macrophage met behulp van de Confocal Microscopie
October 19th, 2017
Macrophage vallen extracellulaire een nieuw beschreven entiteit. Dit artikel zal zich concentreren op confocale microscopie methodes en hoe ze zijn gevisualiseerd in vitro en in vivo van longkanker monsters.
Het algemene doel van deze methode is om aan te tonen hoe macrofaag extracellulaire vallen kunnen worden gevisualiseerd en bestudeerd met behulp van confocale microscopie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontsteking, zoals reacties op infecties en andere immuunstimuli. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een aanpassing is van een goed gevestigde methode die is gebruikt om neutrofiele extracellulaire vallen te bestuderen.
Demonstratie van deze procedure zal worden uitgevoerd door Roleen Sharma. Na het verkrijgen van longmacrofagen uit mensen en muizen door bronchoalveolaire lavage, of BAL, volgens het tekstprotocol, gebruik trypanblauw en een hemocytometer om een levende celtelling uit te voeren op de BAL-oplossing. Pipetteer een tot vier keer 10 tot de vijfde macrofagen in 500 microliters kweekmedium op dekglasjes in de putjes van 24-well platen, en incubeer vervolgens de cellen bij 37 graden Celsius overnacht voor het hechten van de cellen.
Verwijder het kweekmedium en gebruik PBS om de cellen eenmaal te wassen. Voeg vervolgens 2%paraformaldehyde-periodaat-lysine, of PLP fixatief, toe en incubeer de monsters gedurende 10 minuten. Na gebruik van PBS om de cellen kort te wassen, voeg 0,2%TWEEN 20 in PBS toe en incubeer de cellen gedurende 20 minuten.
Vervolgens, om de cellen te blokkeren, voeg 10% kippenserum toe in 5% BSA, verdund in PBS en incubeer de monsters op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Vervolgens vervangt u de blokoplossing door een één op honderd concentratie primaire en isotoop controle-antilichamen en incubeer de cellen op kamertemperatuur gedurende een uur. Na de incubatie, gebruik PBS om de cellen te wassen voordat u de bijbehorende secundaire antilichamen toevoegt.
Vervolgens incubeert u de monsters gedurende 40 minuten op kamertemperatuur. Na het wassen van de cellen in PBS, monteert u de monsters met DAPI-gebaseerde montagemedium, en visualiseer vervolgens de monsters met behulp van een confocale microscoop. Om de FFPE-monsters voor te behandelen met antigeenretrievaloplossing, droog de dia's in de oven gedurende 60 minuten op 60 graden Celsius.
Breng vervolgens de dia's over in xyleenoplossing gedurende 30 minuten voordat u de monsters overbrengt naar 70% ethanol op kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Na het spoelen van de dia's met kraanwater, plaatst u ze in hittebestendige plasticfolie en onderwerpt u ze aan hogere antigeenretrieval door ze in een snelkookpan in Tris-EDTA pH 9,0 te plaatsen gedurende 10 minuten. Koel de monsters gedurende 20 minuten en breng ze vervolgens over naar kraanwater.
Plaats ze vervolgens vijf minuten op een slinger. Herhaal de kraanwaterwas en was vervolgens de dia's één keer in PBS op de slinger. Om de monsters te blokkeren, voegt u 10% kippenserum toe in 5% BSA PBS en incubeert u ze op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
Vervolgens, om macrofaag extracellulaire vallen, of METs in macrofagen, te definiëren, voegt u een één op honderd verdunning van primaire antilichamen toe in 1% BSA PBS en incubeert u de dia's bij vier graden Celsius gedurende 16 uur. Gebruik PBS om de monsters twee keer op een slinger gedurende vijf minuten te wassen. Voeg de bijbehorende fluorescerende secundaire antilichamen toe in 1% BSA PBS en incubeer de dia's op kamertemperatuur gedurende 40 minuten.
Na PBS-wassingen, gebruik DAPI-bevattend montagemedium om de chromatine te kleuren en de monsters te monteren. Gebruik een confocale laserscanningkop die is bevestigd aan een omgekeerde microscoop om fluorescente beelden vast te leggen met behulp van 20X 0,1 NA lucht en 40X 1,0 NA olieobjectieven. Leg enkele vlak 512 bij 512 pixel beelden vast door op de knop Line Sequential leveling te klikken.
Verkrijg ten minste 10 gezichtsvelden per sectie voor analyse en gegevens voor elk resultaat. Om de secties in microcentrifugebuizen te kleuren, voegt u de relevante primaire antilichamen toe in 200 microliter volumes en incubeer de monsters bij vier graden Celsius gedurende 16 uur. Was de secties in PBS drie keer gedurende 10 minuten voordat u de juiste secundaire antilichamen toevoegt en de monsters op kamertemperatuur gedurende een uur incubeert.
Gebruik DAPI om de longsecties in oplossing te kleuren en incubeer de monsters gedurende 20 minuten voordat u dekglasjes toevoegt aan de secties op microscoopglazen in PBS. Gebruik een omgekeerde confocale microscoop met een 40X 1,3 NA objectief, uitgerust met 405 nanometer, 440 nanometer, 473 nanometer, 543 nanometer en 635 nanometer lasers, om beelden vast te leggen en 3D Z-stacks op te nemen, 0,54 micrometer dik, met optimale Z-sectie. Ten slotte analyseert u de beelden volgens het tekstprotocol.
Een voorbeeld van METs in een BAL-monster wordt hier getoond. Het eerste detecteerbare kenmerk is de beweging van de kern naar de rand van de cel, zoals te zien is in deze eerdere fase MET die een ruwweg bolvormige vorm heeft. Dit wordt gevolgd door extracellulair chromatine met andere co-geëxprimeerde mediators, zoals H3Cit en granulaire proteasen, zoals te zien is in deze meer volwassen MET.
Eerdere fase MET bevindt zich linksboven en latere fase MET bevindt zich hieronder in het midden. Longweefsel METs worden in deze figuur getoond. Omdat de longen worden opgeblazen met vloeistof om de longarchitectuur te definiëren, worden de METs tegen de alveolaire wanden geduwd.
De morfologie van de METs zal ook variëren afhankelijk van in welke vlak het weefsel is gesneden. De standaard secties die worden gebruikt voor longweefsel monsters zijn vier tot vijf micron dik. Dikkere weefselsecties maken het mogelijk om meerdere beelden te maken en de METs kunnen vervolgens in 3D worden bekeken.
Een voorbeeld van een 3D-beeld van muislongweefsel gesneden in 25 tot 35 micron secties wordt hier gepresenteerd. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee dagen worden uitgevoerd met
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel richt zich op de visualisatie van macrofaag extracellulaire traps met behulp van confocale microscopietechnieken. Het bespreekt zowel in vitro als in vivo methoden toegepast op longmonsters.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Macrofaag extracellulaire traps zijn een nieuw beschreven entiteit.
- Het begrijpen van hun rol bij ontsteking is cruciaal voor immuunresponsonderzoek.
- Confocale microscopie is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van deze structuren.
- Deze methode bouwt voort op gevestigde technieken die worden gebruikt voor neutrofiel extracellulaire traps.
Doel van het onderzoek
- Om de visualisatie van macrofaag extracellulaire traps te demonstreren.
- Om reacties op infectie en immuunstimuli te verkennen.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers op dit gebied.
Gebruikte methoden
- Isolatie van longmacrofagen uit mensen en muizen via bronchoalveolaire lavage (BAL).
- Levende celtelling met behulp van trypanblauw en een hemocytometer.
- Celcultuur op dekglasjes in 24-well platen.
- Incubatie van cellen bij 37 graden Celsius voor aanhechting.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van macrofaag extracellulaire traps.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methode bij het bestuderen van immuunresponsen.
- Protocolverfijning voor verbeterde duidelijkheid en reproduceerbaarheid.
- Bijdragen aan het begrip van macrofaagfuncties bij ontsteking.
Conclusies
- De confocale microscopiemethode is effectief voor het bestuderen van macrofaag extracellulaire traps.
- Deze techniek kan onderzoek naar ontsteking en immuunresponsen bevorderen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methodologie om verdere implicaties te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Visualizing macrophage extracellular traps (METs) provides a mechanistic readout of innate immune activation relevant to inflammatory disease modeling. This confocal microscopy approach enables target de-risking by linking stimulus exposure to quantifiable chromatin release and protease co-expression. The method supports early discovery workflows where understanding macrophage-driven pathology informs target validation and phenotypic screening strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of macrophage activation states through direct visualization of extracellular chromatin and co-expressed mediators like citrullinated histones and granule proteases.
- Operational Value: Provides a reproducible imaging-based assay to compare stimulated versus unstimulated conditions for target pathway modulation.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing in inflammation models by correlating MET formation with functional immune responses to infection or stimuli.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable imaging outputs (e.g., chromatin release, H3Cit, protease co-localization) suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Includes built-in controls (background, isotype, unstimulated) to ensure assay specificity and reduce false-positive signals in compound evaluation.
- Scalability: Compatible with both in vitro cell culture and ex vivo lung tissue sections, enabling cross-model consistency in target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models macrophage-driven processes in lung inflammation, aligning with preclinical studies of fibrotic, infectious, or autoimmune lung conditions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo lung tissue analysis, supporting biomarker-aligned progression from discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables objective assessment of macrophage extracellular trap formation as a functional readout for go/no-go criteria in immunomodulator screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead optimization, where MET visualization serves as a functional immune response assay in inflammation-focused programs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by visualizing chromatin extrusion and protease release as downstream consequences of target modulation in macrophages.
- Screening: Enables quantitative imaging readouts that can be automated via image analysis software to assess compound effects on MET formation across dose ranges.
- Analytics: Delivers multiparametric data (chromatin, citrullinated histones, protease co-expression) enabling statistical comparison of experimental groups for target prioritization.
- Translational Research: Facilitates cross-species comparison (human and mouse lung macrophages) and ex vivo tissue validation, strengthening preclinical-to-clinical translatability.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple inflammatory targets and disease models beyond initial validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in macrophage activation studies by providing direct, visual evidence of extracellular trap formation and molecular co-expression.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, staining, and imaging workflows, improving inter-lab reproducibility and data consistency in immune profiling.
- Strategic Value: Informs early portfolio decisions by linking target inhibition to measurable reductions in pathogenic MET formation, decreasing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of immunomodulatory candidates based on functional macrophage phenotype modulation rather than binding affinity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, confocal microscopy operation, and image analysis for accurate MET detection and quantification.
- Dependent on access to confocal laser scanning microscopes with appropriate objectives (e.g., 20X air, 40X oil) and laser lines for multichannel fluorescence detection.
- Necessitates standardized antibody panels and titration protocols to ensure specific detection of chromatin, citrullinated histones, and granule proteases across sample types.
- Involves optimization steps for antigen retrieval in FFPE lung tissue, including pressure-based retrieval in Tris-EDTA pH 9.0, to maintain epitope accessibility.
- Limited by the need for careful wash steps to preserve delicate extracellular trap structures during staining, as aggressive handling may disrupt NET/MET morphology.
