Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering
November 15th, 2017
We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.
Het algemene doel van dit experiment is om meer dan 10.000 eiwitten uit cel- of weefsellysaat te identificeren en nauwkeurig te kwantificeren in verschillende geneesmiddelbehandelingen, tijdsverlopen of biologische omstandigheden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van geneeskunde of biologie, zoals welke eiwitten veranderen als reactie op een medicijn of andere biologische stimulus. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de mogelijkheid heeft om nauwkeurig meer dan 70% van het geëxpresseerde proteoom over 10 verschillende experimentele omstandigheden te kwantificeren.
De implicatie van deze technologie kan worden uitgebreid tot de diagnose van menselijke ziekten door potentiële biomarkerontdekking. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien optimale cellyse en vloeistofschatting een sleutelrol spelen in downstream-vertering, labeling en scheidingsprocedures. Om dit protocol te beginnen, verwerf gecultiveerde cellen van belang.
Was de cellen twee keer met 10 milliliter PBS voor elke wassing. Schep en verzamel de gewassen cellen in een 1,5 milliliter buis met één milliliter PBS. Centrifugeer bij 600 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.
Verwijder het supernatant en bewaar het op min 80 graden Celsius totdat het klaar is om de cellen te lyse. Verzamel en weeg de gewenste weefsels snel na dissectie. Hierna bewaar ze onmiddellijk in vloeibare stikstof en bewaar ze op min 80 graden Celsius.
Bereid de lysisbuffer voor op de dag van het experiment zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg lysisbuffer toe aan het bevroren monster zodat de buffer-tot-monsterverhouding 10 tot één is en de uiteindelijke eiwitconcentratie tussen de vijf en tien milligram per milliliter ligt. Voeg vervolgens glazen bolletjes toe en gebruik een blender om de monsters te lyse bij vier graden Celsius en snelheid acht door gedurende 30 seconden te mengen en vervolgens vijf seconden te rusten, dit herhalen vijf keer of totdat de monsters homogeen zijn.
Meet de eiwitconcentratie met behulp van een standaard eiwitkwantificeringstest of een Coomassie-gekleurde SDS-polyacrylamidegel met BSA als standaard. Voeg vervolgens 100% acetonitril toe zodat de uiteindelijke concentratie 10% is en Lys-C-protease een enzym-tot-substraatverhouding van één tot 100 heeft. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee uur om eiwitvertering te laten plaatsvinden.
Voeg vervolgens DTT toe zodat de uiteindelijke concentratie één millimolar is. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende één uur. Voeg vervolgens 50 millimolar HEPES toe totdat de ureumconcentratie in de monsters is verdund tot twee molair.
Voeg trypsine toe aan elk monster bij een trypsine-tot-eiwitverhouding van één tot 50. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste drie uur. Voeg vervolgens DTT toe totdat de concentratie opnieuw één millimolar is en incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee uur.
Voeg iodoaceetamide toe zodat de uiteindelijke concentratie 10 millimolar is. Incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Quench vervolgens ongereageerde iodoaceetamide door DTT toe te voegen zodat de uiteindelijke concentratie 30 millimolar is.
Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Controleer de efficiëntie van de trypsine-vertering zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens TFA toe aan elk monster zodat de uiteindelijke concentratie 1% is. Gebruik een pH-strip om de pH van elk monster te meten om te verifiëren dat deze tussen de twee en drie ligt.
Voeg indien nodig druppelsgewijs extra TFA toe om een onaanvaardbare pH te bereiken. Centrifugeer de monsters bij 20.000 keer g en kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Verzamel het supernatant en laad de monsters op voorbereide spinkolommen.
Centrifugeer bij 100 keer g gedurende drie minuten of totdat het monster volledig door de kolom is gepasseerd om de monsters te binden. Voeg vervolgens 0,5 milliliter 0,1% TFA toe aan elke kolom. Centrifugeer bij 500 keer g gedurende 30 seconden.
Voeg vervolgens 125 microliter van een oplossing met 60% acetonitril en 0,1 TFA toe aan elke kolom. Centrifugeer bij 100 keer g gedurende drie minuten om de peptiden uit de kolom te elueren. Reconstrueer elk ontzilt peptidemonster in 50 microliter 50 millimolar HEPES.
Controleer met een pH-strip of de pH van elk monster tussen zeven en acht ligt. Los vervolgens de TMT-reagentia op in anhydrisch acetonitril, voeg ze toe aan de monsters en incubeer vervolgens bij kamertemperatuur gedurende één uur. Gebruik vervolgens 10 microliter pipettenpunten ingebed met chromatografiemedia om één microgram van elk monster te ontzilten en analyseer de labelingsefficiëntie zoals beschreven in het tekstprotocol.
Onderzoek zes tot tien afzonderlijke peptiden om ervoor te zorgen dat ongelabelde peptiden niet worden gedetecteerd in de gelabelde monsters. Meng vervolgens ongeveer twee microliter van elk monster samen. Gebruik 10 microliter pipettenpunten ingebed met chromatografiemedia om dit mengsel te ontzilten.
Analyseer de monsters met LC-MS/MS zoals beschreven in het tekstprotocol. Om te beginnen, solubiliseer het ontzilte gepoolde TMT-gelabelde peptidemonster in 65 microliter buffer A. Gebruik een pH-strip om te controleren of de pH ongeveer 8,0 is. Als het monster nog steeds zuur is, gebruik dan ammoniumhydroxide om de pH zo nodig aan te passen.
Fractioneer vervolgens het monster zoals beschreven in het tekstprotocol. Stel de fractiecollector in om elke twee minuten fracties te verzamelen, inclusief de laadtijd. Stel de stroomsnelheid in op 0,4 milliliter per minuut.
Verzamel in totaal 80 fracties. Gebruik vervolgens een vacuümconcentrator om elke andere monster volledig te drogen. Gebruik LC-MS/MS om alle 80 fracties te analyseren om ultradiepe proteoomdekking te bereiken.
Pak eerst 1,9 micrometer C18-hars in lege kolommen met een binnen
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om meer dan 10.000 eiwitten uit cel- of weefsellysaat onder verschillende omstandigheden te identificeren en nauwkeurig te kwantificeren. Het maakt gebruik van isobare labeling, uitgebreide fractionering en bioinformatica-tools om de nauwkeurigheid van eiwitkwantificering te verbeteren.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Proteomics
- Biochemie
- Celbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitdynamica is cruciaal in de biologie en geneeskunde.
- Accurate kwantificering van eiwitten kan reacties op medicijnen en biologische stimuli onthullen.
- Deze methode kan potentieel helpen bij de ontdekking van biomarkers voor menselijke ziekten.
- Optimale cellysis en vloeistofschatting zijn cruciaal voor succesvolle resultaten.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbaar protocol voor eiwitkwantificering te ontwikkelen in verschillende experimentele omstandigheden.
- Om eiwitten te identificeren die veranderen als reactie op verschillende behandelingen.
- Om de ontdekking van biomarkers voor ziektediagnose te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Isobare labeling voor eiwitkwantificering.
- Uitgebreide fractioneringstechnieken.
- Hoge-resolutie massaspectrometrie.
- Bioinformatica-tools voor data-analyse.
Belangrijkste resultaten
- Vermogen om meer dan 70% van het geëxpresseerde proteoom te kwantificeren.
- Succesvolle identificatie van eiwitveranderingen onder verschillende omstandigheden.
- Aangetoonde effectiviteit van de methode in verschillende biologische contexten.
- Mogelijke implicaties voor ziektediagnose door biomarkerontdekking.
Conclusies
- Dit protocol biedt een robuust raamwerk voor eiwitkwantificering.
- Het kan het onderzoek op het gebied van proteomics en aanverwante vakgebieden aanzienlijk bevorderen.
- Visuele demonstraties verbeteren het begrip van cruciale stappen in het proces.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Deep proteome profiling enables comprehensive target validation by quantitating over 10,000 proteins across multiple experimental conditions, supporting mechanistic de-risking in early discovery. The method enhances predictive confidence in lead identification by providing quantitative, reproducible data on protein expression changes in response to drug treatments or biological stimuli. This capability directly informs portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative measurement of proteome-wide changes in response to perturbations.
- Operational Value: Supports functional target validation by identifying proteins modulated across drug treatments, time courses, or biological conditions.
- Predictive Value: Increases confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity through deep, multiplexed proteomic coverage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, quantitative biological systems for downstream compound screening and biomarker assay development.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility and scalability via extensive fractionation and interference correction for reliable readouts.
- Platform Value: Enables reuse across diverse sample types including cell culture, tissues, and clinical specimens for consistent proteomic profiling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker alignment by quantitating post-translational modifications in disease-relevant systems.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation with robust, QC-protected data generation.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering quantitative, condition-specific proteomic landscapes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling data-driven decisions at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantitating protein dynamics across experimental conditions.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs essential for reliable compound evaluation and structure-activity relationship mapping.
- Analytics: Generates multiplexed, interference-corrected quantitative readouts that enable statistical comparison of protein abundance across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through quantitation of post-translational modifications relevant to disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic profiling platform applicable to multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity through deep, quantitative proteome coverage.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via extensive fractionation and computational interference correction.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via early, data-rich target de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative, condition-specific proteomic responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, mass spectrometry, and bioinformatics for successful execution and data interpretation.
- Dependent on high-resolution LC-MS/MS infrastructure, fractionation systems, and computational tools for interference correction.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, labeling, and QC protocols to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation to post-translational modification analysis requires minor protocol adjustments but maintains core quantitative principles.
- Practical limitations include instrument access, data complexity, and the need for rigorous QC to mitigate ratio compression and ensure accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Preparation of Cells/Tissues
1:45
Protein Extraction, Quality Control Western Blotting, In-solution Digestion, and Peptide Desalting
4:45
TMT Labeling of Peptides
5:50
Extensive High-resolution, Basic pH LC Prefactionation
6:43
LC-MS/MS Preparation and Parameters
7:41
Results: Deep Proteome Profiling Analysis
8:45
Conclusion
