Name: Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Leer diepe proteoomprofilering met isobaar labelen, uitgebreide vloeistofchromatografie en massaspectrometrie. Deze methode kwantificeert meer dan 10.000 eiwitten voor biomarkeronderzoek en ziekteanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken alle andere lab en faciliteit leden voor nuttige discussie. Dit werk werd slechts gedeeltelijk ondersteund door NI H verleent R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 en ALSAC. De MS-analyse werd uitgevoerd in de St. Jude Children's Research Hospital Proteomics Facility, slechts gedeeltelijk ondersteund door de NIH Cancer Center ondersteuning subsidie P30CA021765. De auteurs bedanken Nisha Badders voor hulp bij het bewerken van het manuscript.

<ol><li>Pagala, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative protein analysis by mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).</li>
<li>Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+proteomics%3A+towards+an+integrative+view+of+proteome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics.</a> Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).</li>
<li>Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Profiling+of+Proteome+and+Phosphoproteome+by+Isobaric+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Extensive+Liquid+Chromatography%2C+and+Mass+Spectrometry.+Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling.</a> Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li>
<li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+throughput+in+targeted+proteomics+assays%3A+54-plex+quantitation+in+a+single+mass+spectrometry+run%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run.</a> Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+approaches+for+analyzing+U1-70K+cleavage+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+proteomics+applied+to+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances of proteomics applied to human diseases.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).</li>
<li>Churchman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Retinoids+in+IKZF1-Mutated+BCR-ABL1+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+mouse-human+phenome-wide+association+to+test+gene+function+and+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk.</a> Nat Commun. 7, 10464(2016).</li>
<li>Mertz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+elution+interactome+analysis+of+the+Mind+bomb+1+ubiquitin+ligase+reveals+a+novel+role+in+dendritic+spine+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).</li>
<li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-line+high+pH+reversed-phase+fractionation+and+nano-liquid+chromatography-mass+spectrometry+method+for+global+proteomic+profiling+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).</li>
<li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li>
<li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase-reversed-phase+liquid+chromatography+approach+with+high+orthogonality+for+multidimensional+separation+of+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides.</a> Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+optimization+of+long+gradient+chromatography+mass+spectrometry+for+deep+analysis+of+brain+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome.</a> J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).</li>
<li>Hebert, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+one+hour+yeast+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The one hour yeast proteome.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMP%3A+a+tag-based+database+search+tool+for+peptide+identification+with+high+sensitivity+and+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+optimization+of+reverse-phase+chromatography+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Niu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Peptide+Fractionation+and+y1+Ion-Based+Interference+Detection+Method+for+Enabling+Accurate+Quantification+by+Isobaric+Labeling+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).</li>
<li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Wenger, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+purification+enables+accurate%2C+multiplexed+proteome+quantification+with+isobaric+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging.</a> Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiNotch+MS3+enables+accurate%2C+sensitive%2C+and+multiplexed+detection+of+differential+expression+across+cancer+cell+line+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes.</a> Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+proteome+quantification+by+DEEP+SEQ+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry.</a> Nat Commun. 4, 2171(2013).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Ahrne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Improvement+of+Quantification+Accuracy+in+Isobaric+Mass+Tag-Based+Protein+Quantification+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments.</a> J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+Optimization+of+Reverse-Phase+Chromatography+for+Shotgun+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Proteomics+and+Phosphoproteomics+Profiling+Reveals+Dynamic+Signaling+Networks+and+Bioenergetics+Pathways+Underlying+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation.</a> Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).</li>
<li>Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+ubiquitination+analysis+by+SILAC+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+phosphopeptide+enrichment+by+phosphate+additive+and+the+analysis+of+human+brain+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome.</a> Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMPg%3A+an+Integrative+Proteogenomics+Pipeline+Identifying+Unannotated+Proteins+in+Human+Brain+and+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+clinical+utility+of+cancer+genomic+and+proteomic+data+across+tumor+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types.</a> Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).</li>
<li>Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteogenomics%3A+concepts%2C+applications+and+computational+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies.</a> Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Beschrijven we een hoge-doorvoer-protocol voor de kwantificatie van eiwitten met een 10-plex isobaar labeling strategie, die is met succes geïmplementeerd in verschillende publicaties12,13,14,32 . In dit protocol, kunnen we maximaal 10 verschillende biologische EiwitSteekproeven in 1 experiment analyseren. We kunnen routinematig identificeren en kwantificeren van ruim 10.000 eiwitten met hoge v...

Vooruitgang in de technologie van de volgende generatie sequencing hebben geleid tot een nieuw landschap voor de studie van biologische systemen en ziekten bij de mens. Dit heeft een groot aantal metingen van het genoom, transcriptome Proteoom, metabolome en andere moleculaire systemen tot tastbare toegestaan. De Spectrometrie van de massa (MS) is een van de meest gevoelige methoden in de analytische chemie, en de toepassing ervan in proteomics is snel uitgebreid na de sequencing van het menselijk genoom. Op het gebied van proteomics, hebben de afgelopen jaren grote vooruitgang in op basis van MS kwantitatieve analyses, met inbegrip van isobaar labeling en multiplexing vermogen gecombineerd met uitgebreide vloeistofchromatografie, naast instrumentatie opgeleverd vooruitgang, waardoor voor snellere, meer nauwkeurige metingen met minder monstermateriaal nodig. Kwantitatieve proteomics geworden een reguliere aanpak voor profilering van tienduizenden van eiwitten en posttranslationele modificaties in zeer complexe biologische monsters1,,2,,3,4 , 5 , 6.
Multiplexed isobaar labeling methoden zoals isobaar tag voor relatieve en absolute kwantificatie (dat wil zeggen, iTRAQ) en tandem massa tag (TMT) MS hebben sterk verbeterd monsters worden verwerkt en steeg het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd in één 1,6,7,8te experimenteren. Samen met andere kwantificatie op basis van MS-methoden, zoals label-vrije kwantificatie en stabiele isotoop labelen met aminozuren in de cultuur van de cel (dat wil zeggen, SILAC), het potentieel van deze technieken in de proteomics is veld aanzienlijke9 ,10,11. De TMT-methode kunnen bijvoorbeeld 10 EiwitSteekproeven te samen in 1 experiment worden geanalyseerd met behulp van 10-plex reagentia. Deze structureel identiek TMT-tags hebben dezelfde totale massa, maar zware isotopen zijn differentieel verdeeld over kooldioxide of stikstof-atomen, resulterend in een unieke verslaggever ion tijdens MS/MS versnippering van elke tag, waardoor de relatieve kwantificatie tussen de 10 monsters. De strategie van de TMT is routinematig toegepast om te bestuderen van de biologische afbraak, progressie van de ziekte, en cellulaire processen12,13,14.
Aanzienlijke technische verbeteringen hebben vloeistofchromatografie (LC)-MS/MS systemen, zowel in termen van LC scheidingen en MS parameters, eiwit identificatie maximaliseren zonder in te boeten kwantificatie nauwkeurigheid verbeterd. Eerste-dimensie scheiding voor peptides door een scheiding techniek met hoge orthogonaliteit aan de tweede dimensie is van cruciaal belang is in dit soort geweer proteomics methode om maximale resultaten20. Hoge-pH reversed-phase vloeistofchromatografie (RPLC) levert betere prestaties dan conventionele sterke catie-uitwisseling chromatografie20. Als hoge-pH RPLC wordt gecombineerd met een tweede dimensie van lage-pH RPLC, zowel analytische dynamisch bereik en eiwit dekking zijn verbeterd, resulterend in de mogelijkheid om het grootste deel van de geuite eiwitten te identificeren bij het uitvoeren van geheel-Proteoom analyse15 ,16,17,18. Andere technische ontwikkelingen omvatten kleine C18 deeltjes (1.9 µm) en uitgebreid lang kolom (~ 1 m)19. Bovendien omvatten andere opmerkelijke verbeteringen nieuwe versies van massaspectrometers met snelle scan tarieven, verbeterde gevoeligheid en resolutie20en verfijnde bioinformatics pijpleidingen voor MS gegevens mijnbouw21.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol waarin de meest recente methodologieën met wijzigingen ter verbetering van zowel de gevoeligheid en de doorvoer, met de nadruk op kwaliteit controlemechanismen gedurende het gehele experiment. Het protocol bevat eiwit extractie en spijsvertering, TMT 10-plex labeling fundamentele pH en zure pH RPLC fractionering, high-resolution MS detectie en verwerking van de gegevens van de MS (Figuur 1). Bovendien voeren we verschillende kwaliteitscontrole stappen voor het oplossen van problemen en de evaluatie van de experimentele variatie. Dit gedetailleerde protocol is bedoeld om onderzoekers te helpen nieuwe naar het veld routinematig identificeren en duizenden eiwitten uit een lysate nauwkeurig te kwantificeren of weefsel.

```html
<table><tbody><tr><td>1220 LC system</td><td>Agilent</td><td>G4288B</td><td></td></tr><tr><td>50% Hydroxylamine</td><td>Thermo Scientific</td><td>90115</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BB24-AU</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly Portfolio Heater</td><td>Phoenix S&T</td><td>PST-BPH-20</td><td></td></tr><tr><td>C18 tips</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-4607</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Fraction Collector</td><td>Gilson</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>Glass Beads</td><td>Next Advance</td><td>GB05</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide (IAA)</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lys-C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive HF</td><td></td></tr><tr><td>nanoflow UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r119.aq.0003</td><td></td></tr><tr><td>Self Pck Columns</td><td>New Objective</td><td>PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Speedva</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD11V</td><td></td></tr><tr><td>TMT 10plex Isobaric label reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td>90110</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Applied Biosystems</td><td>400003</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Xbridge Column C18 column</td><td>Waters</td><td>186003943</td><td></td></tr><tr><td>Ziptips C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>SepPak 1cc 50mg</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td></td></tr></tbody></table>
```

diepe proteoom profilering door isobaar labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en software-bijgewoonde kwantificering

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Vele uitzonderlijke vooruitgang geboekt in de Spectrometrie van de massa (MS)-op basis van proteomics, met bijzondere technische vooruitgang in vloeistofchromatografie (LC) gekoppeld aan massaspectrometrie tandem (LC-MS/MS) en isobaar labeling multiplexing capaciteit. Hier introduceren we een diep-proteomics profiling protocol dat 10-plex tandem massa tag (TMT combineert) labelen met een uitgebreide LC/LC-MS/MS platform, en na MS computationele interferentie correctie op het hele proteomes nauwkeurig te kwantificeren. Dit protocol omvat de volgende hoofdstappen: eiwit extractie en spijsvertering, labelen van de TMT, 2-dimensionale (2D) LC, hoge-resolutie massa spectrometrie en computationele gegevensverwerking. Kwaliteitscontrole stappen zijn opgenomen voor het oplossen van problemen en de evaluatie van de experimentele variatie. Meer dan 10.000 eiwitten in zoogdieren monsters kunnen vol vertrouwen met dit protocol worden quantitated. Dit protocol kan ook worden toegepast op de kwantificatie van post-vertalende wijzigingen met kleine wijzigingen. Deze methode multiplexed, robuuste biedt een krachtige tool voor proteoom analyse in een verscheidenheid van complexe monsters, met inbegrip van celkweek, dierlijke weefsels en menselijke klinische specimens.

We gebruikten een eerder beschreven Kruis-soorten peptide mix om systematisch analyseren het effect van de compressie verhouding in 3 stappen van de grote protocol, met inbegrip van pre-MS fractionering, MS-instellingen en post-MS correctie23. De pre-MS fractionering werd geëvalueerd en geoptimaliseerd met behulp van een combinatie van fundamentele pH RPLC en zure pH RPLC. Voor de analyse van de post-MS, werden alleen soortspecifieke peptiden beschouwd. We gebruikt...

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Het algemene doel van dit experiment is om meer dan 10.000 eiwitten uit cel- of weefsellysaat te identificeren en nauwkeurig te kwantificeren in verschillende geneesmiddelbehandelingen, tijdsverlopen of biologische omstandigheden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van geneeskunde of biologie, zoals welke eiwitten veranderen als reactie op een medicijn of andere biologische stimulus. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de mogelijkheid heeft om nauwkeurig meer dan 70% van het geëxpresseerde proteoom over 10 verschillende experimentele omstandigheden te kwantificeren.De implicatie van deze technologie kan worden uitgebreid tot de diagnose van menselijke ziekten door potentiële biomarkerontdekking. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien optimale cellyse en vloeistofschatting een sleutelrol spelen in downstream-vertering, labeling en scheidingsprocedures. Om dit protocol te beginnen, verwerf gecultiveerde cellen van belang.Was de cellen twee keer met 10 milliliter PBS voor elke wassing. Schep en verzamel de gewassen cellen in een 1,5 milliliter buis met één milliliter PBS. Centrifugeer bij 600 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Verwijder het supernatant en bewaar het op min 80 graden Celsius totdat het klaar is om de cellen te lyse. Verzamel en weeg de gewenste weefsels snel na dissectie. Hierna bewaar ze onmiddellijk in vloeibare stikstof en bewaar ze op min 80 graden Celsius.Bereid de lysisbuffer voor op de dag van het experiment zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg lysisbuffer toe aan het bevroren monster zodat de buffer-tot-monsterverhouding 10 tot één is en de uiteindelijke eiwitconcentratie tussen de vijf en tien milligram per milliliter ligt. Voeg vervolgens glazen bolletjes toe en gebruik een blender om de monsters te lyse bij vier graden Celsius en snelheid acht door gedurende 30 seconden te mengen en vervolgens vijf seconden te rusten, dit herhalen vijf keer of totdat de monsters homogeen zijn.Meet de eiwitconcentratie met behulp van een standaard eiwitkwantificeringstest of een Coomassie-gekleurde SDS-polyacrylamidegel met BSA als standaard. Voeg vervolgens 100% acetonitril toe zodat de uiteindelijke concentratie 10% is en Lys-C-protease een enzym-tot-substraatverhouding van één tot 100 heeft. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee uur om eiwitvertering te laten plaatsvinden.Voeg vervolgens DTT toe zodat de uiteindelijke concentratie één millimolar is. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende één uur. Voeg vervolgens 50 millimolar HEPES toe totdat de ureumconcentratie in de monsters is verdund tot twee molair.Voeg trypsine toe aan elk monster bij een trypsine-tot-eiwitverhouding van één tot 50. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste drie uur. Voeg vervolgens DTT toe totdat de concentratie opnieuw één millimolar is en incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee uur.Voeg iodoaceetamide toe zodat de uiteindelijke concentratie 10 millimolar is. Incubeer in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Quench vervolgens ongereageerde iodoaceetamide door DTT toe te voegen zodat de uiteindelijke concentratie 30 millimolar is.Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Controleer de efficiëntie van de trypsine-vertering zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg vervolgens TFA toe aan elk monster zodat de uiteindelijke concentratie 1% is. Gebruik een pH-strip om de pH van elk monster te meten om te verifiëren dat deze tussen de twee en drie ligt.Voeg indien nodig druppelsgewijs extra TFA toe om een onaanvaardbare pH te bereiken. Centrifugeer de monsters bij 20.000 keer g en kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Verzamel het supernatant en laad de monsters op voorbereide spinkolommen.Centrifugeer bij 100 keer g gedurende drie minuten of totdat het monster volledig door de kolom is gepasseerd om de monsters te binden. Voeg vervolgens 0,5 milliliter 0,1% TFA toe aan elke kolom. Centrifugeer bij 500 keer g gedurende 30 seconden.Voeg vervolgens 125 microliter van een oplossing met 60% acetonitril en 0,1 TFA toe aan elke kolom. Centrifugeer bij 100 keer g gedurende drie minuten om de peptiden uit de kolom te elueren. Reconstrueer elk ontzilt peptidemonster in 50 microliter 50 millimolar HEPES.Controleer met een pH-strip of de pH van elk monster tussen zeven en acht ligt. Los vervolgens de TMT-reagentia op in anhydrisch acetonitril, voeg ze toe aan de monsters en incubeer vervolgens bij kamertemperatuur gedurende één uur. Gebruik vervolgens 10 microliter pipettenpunten ingebed met chromatografiemedia om één microgram van elk monster te ontzilten en analyseer de labelingsefficiëntie zoals beschreven in het tekstprotocol.Onderzoek zes tot tien afzonderlijke peptiden om ervoor te zorgen dat ongelabelde peptiden niet worden gedetecteerd in de gelabelde monsters. Meng vervolgens ongeveer twee microliter van elk monster samen. Gebruik 10 microliter pipettenpunten ingebed met chromatografiemedia om dit mengsel te ontzilten.Analyseer de monsters met LC-MS/MS zoals beschreven in het tekstprotocol. Om te beginnen, solubiliseer het ontzilte gepoolde TMT-gelabelde peptidemonster in 65 microliter buffer A. Gebruik een pH-strip om te controleren of de pH ongeveer 8,0 is. Als het monster nog steeds zuur is, gebruik dan ammoniumhydroxide om de pH zo nodig aan te passen.Fractioneer vervolgens het monster zoals beschreven in het tekstprotocol. Stel de fractiecollector in om elke twee minuten fracties te verzamelen, inclusief de laadtijd. Stel de stroomsnelheid in op 0,4 milliliter per minuut.Verzamel in totaal 80 fracties. Gebruik vervolgens een vacuümconcentrator om elke andere monster volledig te drogen. Gebruik LC-MS/MS om alle 80 fracties te analyseren om ultradiepe proteoomdekking te bereiken.Pak eerst 1,9 micrometer C18-hars in lege kolommen met een binnen

deep-proteome-profiling-isobaric-labeling-extensive-liquid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier beschrijven we een robuuste werkwijze voor de fractionering van plantaardige plasmamembranen in reinigingsmiddelenbestendige en detergent oplosbare membranen gebaseerd op een mengsel van gelabelde en in vivo volledig 15N gemerkt Arabidopsis thaliana celculturen. De procedure wordt toegepast voor vergelijkende proteomics studies om signalering processen te begrijpen.

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

Stabiele isotoop labeling van peptiden door reductieve dimethylering (Redi etikettering) is een snelle, goedkope strategie voor nauwkeurige massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics. Hier laten we een robuuste werkwijze voor de bereiding en analyse van eiwitmengsels met de Redi aanpak die kan worden toegepast op vrijwel elk type monster.

Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

Diepgaande analyses van kankercel-proteomen vergemakkelijken de identificatie van nieuwe doelen voor geneesmiddelen en diagnostische biomarkers. We beschrijven een experimentele workflow voor kwantitatieve analyse van (fosfo-)proteomen in kankercelsubpopulaties afgeleid van vloeibare en vaste tumoren. Dit wordt bereikt door cellulaire verrijkingsstrategieën te combineren met kwantitatieve Super-SILAC-gebaseerde massaspectrometrie.

Kwantitatieve Massaspectrometrische Profilering van Kanker-cel proteoom Afgeleid Van vloeibare en vaste tumoren

Gecombineerd voorloper isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT) is een kwantitatieve proteomics strategie die steekproef multiplexing mogelijkheden van isobarisch labels verbetert. Dit protocol beschrijft de toepassing van cPILOT op weefsels van de ziekte van Alzheimer muismodel en wildtype controles.

Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Beschreven is een proteomica-workflow voor het identificeren van eiwit interactie partners uit een nucleaire subcellulaire fractie met behulp van immunoaffinity verrijking van een gegeven proteïne van belang en label-vrije massaspectrometrie. De workflow omvat subcellulaire fractionering, immunoprecipitatie, filter aided monstervoorbereiding, offline opruimen, massaspectrometrie, en een downstream bioinformatica pijpleiding.

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

We presenteren een geoptimaliseerd tmt-labelprotocol (tandem mass tag) dat gedetailleerde informatie bevat voor elk van de volgende stappen: eiwitextractie, kwantificering, neerslag, spijsvertering, etikettering, indiening bij een proteomics-faciliteit en gegevensanalyses.

TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

Gecombineerde precursor isotopic etikettering en isobaric tagging (cPILOT) is een verbeterde monster multiplexing strategie die in staat is het verhogen van het aantal monsters die gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd met de beschikbare isobaric tags. De integratie van een robotplatform heeft de experimentele doorvoer, reproduceerbaarheid en kwantitatieve nauwkeurigheid sterk verhoogd.

Geautomatiseerde voorbeeldbixing met behulp van gecombineerde precursor-isotopenlabeling en isobaric tagging (cPILOT)

Het beschreven protocol biedt een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-analyse van weefselmonsters met behulp van twee benaderingen: labelgebaseerde en labelvrije kwantificering. Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten, terwijl een labelvrije aanpak kosteneffectiever is en wordt gebruikt om honderden monsters van een cohort te analyseren.

Uitgebreide workflow van op massaspectrometrie gebaseerde Shotgun Proteomics van weefselmonsters

Eiwitthioloxidatie heeft significante implicaties onder normale fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. We beschrijven de details van een kwantitatieve redox proteomics-methode, die gebruik maakt van harsondersteunde vangst, isobare etikettering en massaspectrometrie, waardoor locatiespecifieke identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen van eiwitten mogelijk wordt.

Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie

Leer diepe proteoomprofilering met isobaar labelen, uitgebreide vloeistofchromatografie en massaspectrometrie. Deze methode kwantificeert meer dan 10.000 eiwitten voor biomarkeronderzoek en ziekteanalyse.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering (Video) | JoVE Journal

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Meer video's verkennen