Name: Een In Vivo Duo-kleur methode voor Imaging-vasculaire Dynamics na Contusive dwarslaesie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Leer een in vivo duo-kleur twee-foton beeldvormingsmethode om vasculaire dynamiek te volgen na contusieve dwarslaesie bij Sprague-Dawley ratten. Deze techniek biedt inzicht in acute vaatveranderingen en mogelijke neuroprotectieve strategieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, verdienste Review Award I01 BX002356 van het US Department of Veterans Affairs, Craig H Neilsen Stichting 296749, Indiana ruggenmerg en hersenen verwonding Research Foundation ( ISCBIRF) van Indiana State Department of Health (019919), en Mari Hulman George Endowment fondsen.

Alle chirurgische en dierlijke omgang werden uitgevoerd zoals goedgekeurd onder de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (National Research Council) en de richtlijnen van de Indiana University School van geneeskunde institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. chirurgische voorbereiding
<ol>
	<li>Steriliseren alle chirurgische hulpmiddelen met inbegrip van de stabilisator van de wervelkolom. Reinig de chirurgische tabel en alle omliggende gebied met 70% ethanol. Voor de voorbereiding van de niet-survival chirurgische ingreep, plaatst u een schone chirurgische pad op de bovenkant van een 37 ° C verwarming pad.</li>
	<li>Gebruik de zes weken oude Sprague-Dawley (SD) rat voor deze studie. Weeg- en anesthetize van de rat met een intraperitoneale injectie van ketamine (87,7 mg/kg) en xylazine (12.3 mg/kg) mengsel. Goede fase van anesthesie bevestigen wanneer het dier ophoudt te reageren op een prikkel van Teen snuifje. Subcutaan injecteren 0.01-0,05 mg/kg buprenorfine en 5mg/kg Carprofen voorafgaand aan de operatie.</li>
	<li>Scheren van de rat in 2 gebieden: het gebied van de cervicale wervelkolom op de rug en de nek regio aan de kant van de borst. De gebieden van de huid met betadine chirurgische scrub en doekjes van 70% alcohol swab. Toepassing oog zalf om te voorkomen dat droge ogen tijdens de operatie. Plaats het dier in een liggende positie op de schone chirurgische pad.</li>
</ol>
2. externe halsslagader catheterisatie
<ol>
	<li>Zoek de externe halsslagader door het vinden van het punt van de pols in de buurt van het sleutelbeen en knippen met een schaar van de kleine voorjaar te maken van een verticale insnijding ter plaatse, die de Kruis-punt van 3 anatomische punten: caudal ramus van juiste onderkaak, grotere tuberculum van opperarmbeen en manubrium (figuur 1A). Isoleren van het vaartuig met behulp van voorjaar schaar en fijne pincet. Bind het distale uiteinde met 1 steriele chirurgische hechtdraad lijn (Figuur 1 c)20.</li>
	<li>Bereiden een 1 mL spuit gevuld met zoutoplossing en verbonden met een speciale katheter is gemaakt van een 21-gauge naald (figuur 1B). Maken een kleine snede met behulp van een paar micro schaar op het vaartuig en schuif de katheter in het schip.<ol>
		<li>Beveilig de naald door koppelverkoop van zowel het proximale en distale einde (Figuur 1 c). De gespecialiseerde katheter is gemaakt van een naald 21-gauge. De platte tip slijpen en lassen met een tip van een ander 21-gauge naald afgesneden stuk 2-mm. Dit kan voorkomen dat de katheter uit uitglijden buiten. 
		Opmerking: Een kleine hoeveelheid bloed stroomt in de naald wordt aangegeven dat de naald een bloedvat met succes is ingevoerd.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. spine Stabilization en C5-C7 laminectomie
<ol>
	<li>Plaats het dier in een horizontale positie. De huid langs de middellijn snijden met een mes van de scalpel No. 15 op het gewenste niveau van het spinale. Ontleden de spier lagen van de 5th 7th cervicale wervels (C5-C7) bilateraal de laterale facetten (figuur 2A)21bloot te stellen. 
	Opmerking: Zoek de tweede thoracale wervel (T2) door het vinden van de piek tussen de scapulae. Tellen omhoog van de wervel T2 te vinden de C7 wervel21,22,23,24.</li>
	<li>Het stabiliseren van de wervelkolom van de rat met behulp van een gemodificeerde stabiliserende apparaat. Maak een gleuf aan beide zijden van het laterale Vertebrale bot. Schuif de roestvrij stalen armen onder de blootgestelde transverse proces facetten en draai de schroeven om stabiliteit (figuur 2B).</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de C5-C7 laminae (laminectomie, figuur 2C).</li>
	<li>Plaats een kleine hoeveelheid zoutoplossing doordrenkte gelfoam bovenop de blootgestelde dura mater te houden gehydrateerd (figuur 2D).</li>
</ol>
4. installatie van twee-foton (2P) Imaging venster
<ol>
	<li>De kleine stukjes spullen van gelfoam in de kloof tussen spieren en botten van de wervel, ook spullen van een dunne lijn van gelfoam tussen het ruggenmerg en vertebrale beenderen en vervolgens gebruik van weefsel Lijm lijm voor het afdichten van de omgeving van spier-bot. Wacht 5 minuten voor volledige droogheid (figuur 2E). 
	Opmerking: Deze stap wordt voorkomen effectief dat toekomstige bloeden in het venster en leakiness van onderdompeling oplossingen.</li>
	<li>4% agar met ddH2O in een magnetron bereiden. Nadat de agar volledig is opgelost, wachten tot het weer een tastbaar temperatuur. Vul een steriele injectiespuit 1 mL met agar oplossing en het pijp op de rand van het venster om te bouwen van een muur (2E figuur). De oplossing snel stolt en blijft flexibel om de lens of de doelstelling om vrij te bewegen.</li>
	<li>Als u klaar bent voor imaging, verwijder de gelfoam en plaats immersie vloeistof in het venster voor 2P imaging (figuur 2F). Breng het gestabiliseerde dier in de donkere kamer van 2-foton microscoop en plaats het venster 2P imaging direct onder de lens. Lager de lens zorgvuldig in het imaging venster.</li>
</ol>
5. injectie van eerste fluorescente kleurstof en basislijn Imaging
<ol>
	<li>Bereiden van 0,5 mL Rhodamine B isothiocyanaat-Dextran (4 mg/mL gemiddeld molecuulgewicht ~ 70kDa) in een zoutoplossing. Vul een steriele injectiespuit 1 mL met de oplossing en de spuit verbinden de eerder geïnstalleerde katheter. 
	Opmerking: Het voorbereiden van de fluorescente kleurstof oplossing voordat gebruik wordt aanbevolen.</li>
	<li>De eerste kleurstof door zeer langzaam het indrukken van de spuit te injecteren (figuur 3B). Gebruik eerst het oculair te identificeren op het gebied van belang. Gebruiken een last gekoppeld apparaat (CCD) camera voor het verkrijgen van een helder-veld beeld van de oppervlakte bloedvat patronen bij lagere vergroting als een mijlpaal afbeelding. Overschakelen naar de scanmodus laser en open vervolgens de 2P denkbaar software voor het verzamelen van beide afbeeldingen en lijn-scan gegevens.</li>
	<li>Selecteer de juiste 2P laser excitatie golflengte, kracht en fluorescerende kanalen (rood voor eerste kleurstof) te koppelen aan de fluorophores gebruikt in het verbeelde weefsel, en vervolgens uitvoeren in vivo imaging (3E figuur). Houd het dier op een verwarming pad tijdens het hele proces.</li>
</ol>
6. C7 Contusive letsel met behulp van LISA apparaat
<ol>
	<li>Het uitvoeren van een C7 middellijn kneuzingen letsel met behulp van een apparaat van de Louisville letsel systeem apparaat (LISA) volgens een eerder gangbaar protocol25,26.<ol>
		<li>Kortom, plaats het dier in het werkgebied van de LISA na kalibratie.</li></ol></li></ol>Na een nulpunt instelling selecteren en aan te passen van weefsel verplaatsing (0.800 mm in dit geval), klikt u op de knop "Uitvoeren Experiment" van de software te leiden tot de release van het botslichaam en het maken van de schade.
		<li>Plaats na de schade nog een klein stukje van zoutoplossing doordrenkte gelfoam bovenop de blootgestelde dura mater te houden gehydrateerd.</li>
	
	
	<li>Herhaal stap 4.3 en opnieuw uitvoeren in vivo imaging op hetzelfde gebied zichtbaar met de eerder ingespoten rode kleurstof (Figuur 3 c &#38; F).</li>
	<li>De dierlijke achterkant overbrengen in de chirurgische tabel en houd het dier verdoofd met passende verdoving na het IACUC-IUSM-protocol.</li>

7. injectie van tweede fluorescente kleurstof en na letsel Imaging
<ol>
	<li>0,5 mL fluoresceïne isothiocyanaat-dextran (4 mg/mL, gemiddeld molecuulgewicht ~ 70 kDa) in een zoutoplossing bereiden dezelfde zoals in 5.1. Vul de oplossing in een 1-mL steriele injectiespuit en verbinden met de eerder geïnstalleerde katheter.</li>
	<li>Overdracht van de gestabiliseerde dierlijke terug binnen de 2P Microscoop donkere kamer en herstellen via een image eenzelfde ruimte met het rode kanaal voor de eerste kleurstof en het groene kanaal voor de tweede kleurstof (cijfers 3D &#38; G).</li>
	<li>Aan het einde van beeldvorming, laat de rat van het spinale stabilisatie-apparaat en schoon de agar muur.</li>
</ol>
8. dierlijke offer
<ol>
	<li>Na imaging, offeren de rat na de transcardial perfusie protocol27. Verzamelen van de monsters van het ruggenmerg en corrigeren in 4% PFA.</li>
</ol>
9. offlinegegevens analyse: Kwantificering van schip Diameters
<ol>
	<li>De afbeeldingsbestanden overbrengen in een workstation voor off-line analyse.</li>
	<li>ImageJ openen en selecteer "file" en kies vervolgens eerder ruwe gegevens opgeslagen en open de bijbehorende enkel installatiekopiebestand dat (figuur 4B).</li>
	<li>Kalibreer de afbeelding door het selecteren van "Analyseren" gevolgd door "Set schaal" (figuur 4C). De waarde in "Afstand in pixels" geplaatst wordt berekend met behulp van de vergelijking weergegeven in figuur 4A. De kalibratie van de optische lens 2-foton bepaalt de standaardwaarde in de vergelijking. De waarde van "opticalZoom" wordt aangetroffen in Excel Extensible Markup Languagefile (XML-bestand) die zijn gekoppeld aan de enkel installatiekopiebestand dat (figuur 4B).</li>
	<li>Tekenen van een lijn die loodrecht op de lengteas van het vaartuig (Figuur 4 d1 &#38; E1) en selecteer "Analyseren" gevolgd door "Maatregel". De meting van de diameter van het vaartuig wordt weergegeven in het resultaatvenster (Figuur 4 d2 &#38; E2). Herhaal 3 keer over het schip naar het verwerven van de gemiddelde waarde.</li>
</ol>
10. offline Data-analyse: Kwantificering van rode bloed cellen (RBC) snelheid
<ol>
	<li>De lijn-scan bestanden overbrengen naar het werkstation voor analyse.</li>
	<li>Start de ImageJ-software en selecteer "file" en kies vervolgens onbewerkte gegevens eerder hebt opgeslagen en alle bijbehorende lijn-scan bestanden met de extensie naam ".ome" openen.</li>
	<li>Open "Afbeelding" en selecteer "Stapels" gevolgd door "Afbeeldingen stapelen". Alle OME bestanden converteren naar een enkele afbeelding stapel TIFF-bestand.</li>
	<li>Start van Matlab software en klik op "Open", selecteer "LSPIV_parallel.m"-codebestand. Opmerking: Matlab code voor LS-PIV kan worden gedownload op https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18</li>
	<li>Selecteer in de volgende orders: "Run" &#62; "Map wijzigen" &#62; "slagader". Kies de afbeelding stapel TIFF-bestand gegenereerd in 10.3.</li>
	<li>Typ "Y" en druk op Enter.</li>
	<li>Plaatst een cursor aan de linker- en rechterkant van de afbeelding respectievelijk, en het programma wordt gestart voor het verwerken van de gegevens.</li>
	<li>Aan het eind van het programma, voer 2 waarden voor het berekenen van de definitieve lezen: "de conversiewaarde van de pixel_meter", en "scan-tijd conversiewaarde". Beide kunnen worden gevonden in het XML-bestand dat is gekoppeld met lijn-scan gegevens. De uiteindelijke waarde wordt uitgedrukt als het gemiddelde en de standaarddeviatie van de snelheid in de eenheden van millimeter per seconde (mm/s).</li>
</ol>

<ol><li>National Spinal Cord Injury Statistical Center. <a target="_blank" href="https://www.nscisc.uab.edu/Public/Facts%20and%20Figures%20-%202017.pdf">Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance.</a> SCI Data Sheet 2016. , (2016).</li>
<li>Dumont, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+spinal+cord+injury%2C+part+I%3A+pathophysiologic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms.</a> Clin Neuropharmacol. 24 (5), 254-264 (2001).</li>
<li>Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+current+evidence+for+apoptosis+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury.</a> J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).</li>
<li>Liu, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+phospholipase+A2+in+mediating+spinal+cord+secondary+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel role of phospholipase A2 in mediating spinal cord secondary injury.</a> Ann Neurol. 59 (4), 606-619 (2006).</li>
<li>Wu, X., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA%2FRho+kinase+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">RhoA/Rho kinase in spinal cord injury.</a> Neural Regen Res. 11 (1), 23-27 (2016).</li>
<li>Li, X. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+methylprednisolone+and+rosiglitazone+promotes+recovery+of+neurological+function+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Combination of methylprednisolone and rosiglitazone promotes recovery of neurological function after spinal cord injury.</a> Neural Regen Res. 11 (10), 1678-1684 (2016).</li>
<li>Kulkarni, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+spinal+cord+injury%3A+MR+imaging+at+1.5%5BTitle%5D)+AND+%22T.+Radiology%22%5BJournal%5D)">Acute spinal cord injury: MR imaging at 1.5.</a> T. Radiology. 164 (3), 837-843 (1987).</li>
<li>Tator, C. H., Koyanagi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+mechanisms+in+the+pathophysiology+of+human+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal cord injury.</a> J Neurosurg. 86 (3), 483-492 (1997).</li>
<li>Kobrine, A. I., Doyle, T. F., Martins, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+blood+flow+in+the+rhesus+monkey+by+the+hydrogen+clearance+method%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Neurol%22%5BJournal%5D)">Spinal cord blood flow in the rhesus monkey by the hydrogen clearance method.</a> Surg Neurol. 2 (3), 197-200 (1974).</li>
<li>Rivlin, A. S., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+spinal+cord+blood+flow+in+rats+after+severe+cord+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma.</a> J Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).</li>
<li>Koyanagi, I., Tator, C. H., Theriault, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+rubber+microangiography+of+acute+spinal+cord+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Silicone rubber microangiography of acute spinal cord injury in the rat.</a> Neurosurgery. 32 (2), 260-268 (1993).</li>
<li>Noble, L. J., Wrathall, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+analyses+of+lesion+development+and+functional+status+after+graded+spinal+cord+contusive+injuries+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Correlative analyses of lesion development and functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat.</a> Exp Neurol. 103 (1), 34-40 (1989).</li>
<li>Maikos, J. T., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+damage+to+the+blood-spinal+cord+barrier+due+to+mechanical+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due to mechanical trauma.</a> J Neurotrauma. 24 (3), 492-507 (2007).</li>
<li>Tei, R., Kaido, T., Nakase, H., Sakaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+spinal+cord+hypoperfusion+of+circumscribed+areas+after+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Secondary spinal cord hypoperfusion of circumscribed areas after injury in rats.</a> Neurol Res. 27 (4), 403-408 (2005).</li>
<li>Cohen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-spinal+cord+barrier+permeability+in+experimental+spinal+cord+injury%3A+dynamic+contrast-enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Blood-spinal cord barrier permeability in experimental spinal cord injury: dynamic contrast-enhanced MRI.</a> NMR Biomed. 22 (3), 332-341 (2009).</li>
<li>Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuating+and+sensory-induced+vasodynamics+in+rodent+cortex+extend+arteriole+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (20), 8473-8478 (2011).</li>
<li>Schaffer, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+cortical+surface+microvessels+reveals+a+robust+redistribution+in+blood+flow+after+vascular+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion.</a> PLoS Biol. 4 (2), e22(2006).</li>
<li>Kim, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Line-scanning+particle+image+velocimetry%3A+an+optical+approach+for+quantifying+a+wide+range+of+blood+flow+speeds+in+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals.</a> PLoS One. 7 (6), e38590(2012).</li>
<li>Tang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+axonal+dieback%2C+blood+flow%2C+and+calcium+influx+with+methylprednisolone+therapy+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury.</a> Sci Rep. 5, 9691(2015).</li>
<li>Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jugular+vein+catheterization+for+repeated+blood+sampling+in+the+unrestrained+conscious+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 84-94 (2002).</li>
<li>Walker, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+vertebral+stabilization+method+for+producing+contusive+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A novel vertebral stabilization method for producing contusive spinal cord injury.</a> J Vis Exp. (95), e50149(2015).</li>
<li>Anderson, K. D., Sharp, K. G., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+cervical+contusion+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Bilateral cervical contusion spinal cord injury in rats.</a> Exp Neurol. 220 (1), 9-22 (2009).</li>
<li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contusion+model+of+severe+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A contusion model of severe spinal cord injury in rats.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+cell+transplantation+for+targeting+cervical+ventral+horn+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li>
<li>Zhang, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+contusion+based+on+precise+vertebral+stabilization+and+tissue+displacement+measured+by+combined+assessment+to+discriminate+small+functional+differences%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences.</a> J Neurotrauma. 25 (10), 1227-1240 (2008).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tissue+Displacement-based+Contusive+Spinal+Cord+Injury+Model+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice.</a> J Vis Exp. (124), (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Egawa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+analysis+of+vascular+permeability+in+mice+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 3, 1932(2013).</li>
<li>Farrar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li>
<li>Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+axonal+interactions+with+microglia+and+macrophages+in+a+mouse+dorsal+column+crush+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury.</a> J Vis Exp. (93), e52228(2014).</li>
<li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Vis Exp. (59), e2760(2012).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia%2C+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).</li>
<li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een uitdaging voor vasculaire studies na SCI is de technische beperking omdat traditionele technieken grotendeels beperkt tot de vasculaire structuur wijzigingen in postmortem monsters zijn. Deze roman in vivo imaging hierboven beschreven methode kunt dynamische meting van de bloedstroom en bijbehorende parameters (snelheid en vaartuig diameter) met 2 P-LSM in levende ratten. Hierdoor ook herhaalde onderzoek in de dezelfde sets van schepen op verschillende tijdstippen na contusive SCI. Vorige 2-foton microscopie beeldvormingstechnieken niet konden vangen de vasculaire structuren na trauma als gevolg van het weglekken van een enkele tracer. Onze duo-kleur ontwerp maakt dynamische vasculaire imaging voor traumatische modellen. De flexibiliteit van deze methode biedt bovendien een kans voor het genereren van een temporele-ruimtelijke Profiel van acute vasculaire wijzigingen na SCI.
Er zijn verschillende kritische stappen in onze in vivo duo-kleur beeldvorming methode. Ten eerste, het is fundamenteel voor de fysieke stabiliteit van ruggenmerg vóór time-lapse beeldvorming, met name de vermindering van ademhaling beweging artefact. We ontwierpen de vorm van spinale klemmen om de hoogte van de spinale wervel iets tijdens stabilisatie. Dus de beweging van het ruggenmerg correleren aan de ademhaling dier kunnen sterk verminderd (Figuur 1 d-F, 2B). Het is raadzaam om te controleren de stabiliteit van het ruggenmerg vóór het begin van elke imaging sessie. Als het ruggenmerg mislukt om stabiliteit te bereiken, moet de aanpassing plaatsvinden om de uitlijning en de krapte van ruggenmerg klemmen. Tweede, perifere weefsel (bot, spier laag en huid) bloeden in de beeldvorming venster kan het risico van besmetting van de weergave. Voor een goede beeldvorming sessie, moet gelfoam en weefsel Lijm lijm worden toegepast op het omringende weefsel voor doelmatige preventie. Ten derde hebben de fluorescente kleurstoffen die we kiezen een vergelijkbare grootte als albumine (66 kDa), dat de belangrijkste ultrahoog moleculair gewicht bloed plasma-eiwit is. Homeostatische voorwaarden bleven de kleurstoffen grotendeels binnen het schip vergelijkbaar als albumine28. Na de schade, de kleurstoffen doorgegeven via de verstoorde endothelial structuur en gelekt in het parenchym, waardoor een aanzienlijk verhoogde fluorescerende intensiteit in het perifeer gebied van de therapieën (figuur 3F-G). Daarnaast zijn er twee redenen waarom we ervoor externe halsslagader catheterisatie kiezen. Eerst, kan het een consequent toegankelijk route van levering bieden op elk moment van het experiment. Ten tweede, het kan worden gebruikt als een route voor toekomstige behandeling injectie.
Hoewel onze in vivo duo-kleur methode vermag verlenen van een nieuwe plek voor traumatische vasculaire beeldvorming studies, moeten sommige waarschuwingen met betrekking tot deze techniek worden aangepakt. Momenteel, deze techniek is ontworpen om te beoordelen van vasculaire veranderingen op 2 punten van de tijd (basislijn en 1 na blessuretijd punt), maar het is mogelijk om over te schakelen op meerdere tijdstippen als extra fluorescente kleurstoffen en kanalen beschikbaar zijn. Hoewel er verschillende studies met behulp van geïmplanteerde glazen venster voor chronische intravital imaging, geen enkel van hen basislijngegevens kunt aan op hetzelfde vaartuig na traumatisch letsel19,29,30, 31,-32. In tegenstelling tot deze studies is onze venster een neen-glazen venster. Dit is handig voor pre- en post letsel beeldvorming, maar het kan zijn uitdagend voor het herstel van het venster voor de lange termijn waarneming. Onze toekomstige onderzoek is bezig met de technische verbetering voor chronische imaging. Het vasculaire systeem is samengesteld uit verschillende typen van schip (slagader, veneuze en capillaire) en zijn allemaal verschillend in aspecten van morfologie en functie. Differentiatie tussen vaartuig typen tijdens imaging kon helpen om pesten uit een duidelijk patroon van vasculaire veranderingen. Het bovenstaande protocol is afhankelijk van de waarnemer die identificatie van de vaartuigen die op basis van morfologie en snelheid; echter kan een slagader-specifieke kleurstof eenvoudig worden toegevoegd aan het geven van een meer definitieve indeling tussen vaartuig typen33.
Deze techniek is niet alleen beperkt tot evaluaties op contusive en andere traumatische modellen, zoals crush letsel en de schade van de straling, maar ook op studies gericht op verstoring van de BSCB, zo goed als vasculaire permeabiliteit verandert. Naast SCI, kan worden gebruikt om de studie van de vasculaire wijzigingen na andere neurodegeneratieve ziekten zoals Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en multiple sclerose (MS). Het zou bovendien overdraagbaar aan een transgene diermodel te bestuderen van de dynamische neurovasculaire interactie. Als een krachtige screening tool, konden toekomstige studies gebruiken de beeldvormende techniek die hier beschreven om te beoordelen van de effectiviteit van behandeling voor dwarslaesie.
Kortom, is in vivo duo-kleur methode een betrouwbare, real-time, in vivo benadering hulpmiddel voor beoordelen van dynamische vasculaire veranderingen, die ideaal is voor karakterisering van temporele-ruimtelijke vasculaire profiel en screening voor behandelingen verminderen van secundaire schade na SCI.

Traumatische dwarslaesie (SCI) is een gemeenschappelijk verwonding leidt tot aantasting van de motorische, sensorische en autonome functie. Volgens de nationale Spinal Cord Injury statistische Center (NSCISC) in 2016, ongeveer 282,000 personen werden getroffen terwijl 69% van hen voornamelijk als gevolg van verkeersongevallen waren of1valt. Deze patiënten vereisen vaak intensieve zorg; geen effectieve behandeling is echter momenteel beschikbaar. Nieuwe effectieve strategieën naar SCI zijn derhalve dringend noodzakelijk.
SCI is voornamelijk verdeeld in twee fasen: letsel van de primaire en secundaire schade. De primaire schade omvat de fysieke belediging veroorzaakt hemorragische necrose op de site van effect2, gevolgd door een reeks secundaire schade gebeurtenissen, zoals ontsteking, cel apoptosis en demyelinisatie van de resterende axonen, die geleidelijk leiden aan de uitbreiding van de morfologische en functionele tekorten3,,4,,5,6. Bloeding is het eerste zichtbare teken van schade, die een onmiddellijke Vasculaire verstoringen in de acute fase van SCI7,8aangeeft. Een neuroprotectieve strategie ter vermindering van de vroege vasculaire schade herstel van de patiënten kan verbeteren, maar dit vereist een beter begrip van de pathofysiologische mechanismen van vroege na letsel vasculaire gebeurtenissen.
Ondanks eerdere studies verschillende methoden gebruiken voor het bestuderen van ruggenmerg therapieën, blijven significante beperkingen. De meeste gedeelde nadeel is monstes alleen postmortem, bijvoorbeeld waterstof klaring9, autoradiografie10, microangiogram8, vasculaire corrosie afgietsels11en immunohistochemistry12 ,,13. Maar Laser Doppler flowmetrie noninvasive real-time bewaking van ruggenmerg bloed stroom14 biedt, is het niet in staat om te onderscheiden tussen de vasculaire systemen en vasculaire morfologische veranderingen detecteren. Dynamische Contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) is ook noninvasive, maar het lage resolutiebeelden genereert en een dure infrastructuur15vereist.
Hoewel in vivo imaging met behulp van 2-foton laser scanning microscopie (2 P-LSM) is ontwikkeld voor het bestuderen van de vasodynamics in de cortex16,17,18, een beperkt aantal studies hebben aangetoonde vasculaire wijzigingen na een SCI. Tang et al. hebben veranderingen in de bloedstroom aan de rand van de site van de laesie in een hemisection model19, maar imaging getoond nadat een contusive letsel is moeilijker om twee redenen. Eerst, zou een traditionele optische glas over de schade-site niet houden van de mechanische impact en blijven functioneren voor imaging. Tweede, het weglekken van tracer in het parenchym wegens bloeding creëert problemen met na letsel beeldvorming.
Hier presenteren we een nieuwe duo-kleur beeldvorming methode, waarmee de dezelfde individuele vaartuigen op pre- en post letsel tijdstippen imaging. Daarnaast geeft het een temporele-ruimtelijke Profiel van vasculaire dynamische veranderingen na een contusive SCI. Het heeft ook het potentieel voor imaging op meerdere na blessuretijd punten. Dit protocol kan rechtstreeks worden toegepast op transgene dieren te bestuderen neurovasculaire interactie.

<table><tbody><tr><td>Purdue Products Betadine Surgical Scrub</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td>Huidsterilisatie</td></tr><tr><td>Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg)</td><td>Patterson Veterinary&nbsp;</td><td>07-881-9413, 07-890-5745</td><td>Verdovingsmiddel</td></tr><tr><td>Buprenorfine(0.03 mg/mL)&nbsp;</td><td>Patterson Veterinary&nbsp;</td><td>07-891-9756</td><td>Pijnstiller</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-844-7425</td><td>Niet-steroïdale anti-inflammatoire drug</td></tr><tr><td>Dukal Gaasjes&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-490</td><td>Huidsterilisatie</td></tr><tr><td>Decon Ethanol 200 Proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-450</td><td>Huidsterilisatie</td></tr><tr><td>Artificial Tears Eye Ointment</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-870-5261&nbsp;</td><td>Voorkomen uitdrogen van ogen&nbsp;</td></tr><tr><td>Wattenstaafjes met katoen</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>1006015</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate&ndash;Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>Gemiddeld mol gewicht 70kDa</td></tr><tr><td>Fluoresceïne isothiocyanate&ndash;dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46945</td><td>Gemiddeld mol gewicht 70kDa</td></tr><tr><td>Instrument Sterilisator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-50</td><td>voor sterieliseringen van chirurgische gereedschappen</td></tr><tr><td>Spinaal stabilisator set</td><td>Op maat gemaakt door Norton Neuroscience Institute</td><td></td><td>Neem contact op met Y. Ping Zhang voor details. (yipingzhang50@gmail.com)</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M Animal Care Products</td><td>1469SB</td><td>Weefselkleefmiddel</td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Henry Schein</td><td>9083300</td><td>Bloed stoppen</td></tr><tr><td>Noyes Spring Scissors</td><td>F.S.T</td><td>15013-12</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps- Dumont #5</td><td>F.S.T</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>laminectomie</td></tr><tr><td>Chirurgische retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Schelp</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12&nbsp;</td><td>Huid snijden</td></tr><tr><td>Schelpblad #15</td><td>Royal-Tek</td><td>BS2982</td><td>Huid snijden</td></tr><tr><td>micro gebogen schaar</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td>Kan van elke verkoper zijn</td></tr><tr><td>3-0 vicryl hechtdraad</td><td>Ethicon</td><td>J393H</td><td>Kan van elke verkoper zijn</td></tr><tr><td>Zijde Zwarte Geweven Niet-Resorbeerbare Hechtdraad, 3-0, C-7, Reverse Sned, 18"</td><td>LOOK</td><td>786</td><td>Kan van elke verkoper zijn</td></tr><tr><td>1 ml spuit</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200.V0</td><td>Kan van elke verkoper zijn</td></tr><tr><td>21 gauge naald</td><td>BD</td><td>305165</td><td>Kan van elke verkoper zijn</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>Kan van elke verkoper zijn</td></tr><tr><td>Twee-foton Laser Scanning Microscoop</td><td>Bruker Fluorescence Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LISA apparaat</td><td>Op maat gemaakt door Norton Neuroscience Institute</td><td></td><td>Neem contact op met Y. Ping Zhang voor details. (yipingzhang50@gmail.com)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu Corporation</td><td></td><td>Beeldvormingssoftware</td></tr><tr><td>PrairieView</td><td>Prairie Technologies/Bruker</td><td></td><td>Twee-foton beeldvormingssoftware</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Beeldanalysesoftware</td></tr><tr><td>Matlab statistiek toolbox</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td>https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle</td><td>Beeldanalysesoftware</td></tr></tbody></table>

een in vivo duo-kleur methode voor imaging-vasculaire dynamics na contusive dwarslaesie

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Dwarslaesie (SCI) veroorzaakt aanzienlijke Vasculaire verstoringen op de site van letsel. Vasculaire pathologie treedt op onmiddellijk na SCI en blijft tijdens de fase van acute schade. In feite, endotheliale cellen lijken te zijn de eerste om te sterven na een contusive SCI. De vroege vasculaire gebeurtenissen, met inbegrip van verhoogde doorlaatbaarheid van de bloed-ruggenmerg barrière (BSCB), vasogenic oedeem veroorzaken en bijdragen aan evenementen van de schadelijke secundaire schade veroorzaakt door complexe schade mechanismen. Gericht op de vasculaire verstoring, daarom zou een belangrijke strategie ter beperking van de secundaire schade cascades die aan de histologische en functionele waardeverminderingen na SCI. bijdragen Eerdere studies werden vooral uitgevoerd op postmortem monsters en konden de dynamische wijzigingen van de vasculaire netwerk vast te leggen. In deze studie, hebben we een in vivo duo-kleur twee-foton beeldvorming methode ontwikkeld om te controleren van acute vasculaire dynamische veranderingen na contusive SCI. Deze aanpak maakt het mogelijk opsporen van de bloedstroom, vaartuig diameter en andere vasculaire pathologieën op verschillende plaatsen van de dezelfde rat pre-en post letsel. Globaal, is deze methode biedt een uitstekende plek voor het onderzoeken van vasculaire dynamiek.

De methode is in staat om te controleren in vivo dynamische spinale vasculaire veranderingen in individuele vaartuigen pre- en post-traumatische SCI. Ten eerste, een katheter wordt geïnstalleerd via de externe halsslagader toegang voor latere fluorescente kleurstof injecties (figuur 1A-C, Figuur 3). In de tweede stap, wordt een gespecialiseerde apparatuur gebruikt voor het stabiliseren van de blootgestelde C5-C7 (Figuur 1 d-F, figuur 2A-B). Deze stabilisatie stap kunt elimineren ademhaling artefacten en gestage imaging bieden. Na laminectomie (figuur 2C) is de volgende stap de installatie van 2 P imaging venster over C5-C7 (figuur 2D-F). Minimaliseren van perifere weefsel rond de spinale imaging venster bloeden is van cruciaal belang voor succesvolle vasculaire imaging. De volgende stap is om te injecteren rhodamine-dextran fluorescente kleurstof (rood) via de eerder genoemde katheter met landmark en de kaart de vasculaire netwerk als de basislijn (figuur 3A-B, E). Na C7 middellijn contusive letsel met matige Ernst, FITC-dextran (groen) wordt ingevoerd op de gewenste post blessuretijd punten (figuur 3A &#38; D). De schoonheid van de duo-kleur-methode is dat men kan nog steeds het detecteren van de vasculaire structuur met behulp van de tweede kleurstof, wanneer de eerste kleurstof reeds uit in parenchym vanwege blessure (Figuur 3 g gelekt).
Tijdens de vergadering van beeldvorming is het raadzaam om te houden van het dier op een verwarming pad om core lichaamstemperatuur na de inductie van de anesthesie.
Onze duo-kleur methode, kan de diameter en rode bloedcellen snelheid (de snelheid van de RBC) van individuele vaartuigen worden gemeten en berekend. Voor diameter, kan men ImageJ gebruiken voor het meten van het schip op zijn grootste diameter voor 3 herhalingen na kalibratie (Figuur 4). Voor snelheid, worden lijn-scan beelden gemeten met behulp van Matlab programma (MATLAB R2013a) voor het berekenen van de RBC snelheid (Figuur 5)18. Op basis van de morfologie, stroomsnelheid van bloed en de diameter van het vaartuig, de schepen kunnen worden ingedeeld in 2 categorieën: slagader en ader (zie tabel 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig1.jpg"> 
Figuur 1 . Halsslagader catheterisatie en wervelkolom stabilisatie. (A) een schematische tekening voor het lokaliseren van de externe halsslagader. (B) de gespecialiseerde katheter is gemaakt van een naald 21-gauge. De tip was grond plat en gelaste met een stuk van 2 millimeter tip van een ander 21-gauge naald afgesneden. (C) een schematisch diagram van catheterisatie. De distale einde is afgebonden eerst, gevolgd door de proximale katheter stabilisatie, eindigend met de bevestiging van de naald samen met het schip (vaartuig afbinding, blauwe pijlpunten). (D) een beeld van de gemodificeerde wervelkolom stabilisator. Een venster van de C5-C7 vóór laminectomie (E) en na laminectomie en contusive SCI (F) wordt weergegeven. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig2.jpg"> 
Figuur 2 . Schematisch diagram van optische venster installatie stap voor stap. (A) stap 1: bloot van de wervel door snijden huid en spieren langs de middellijn. (B) stap 2: de stabilisatie van de wervelkolom. (C) stap 3: laminectomie. (D) stap 4: behouden van het vocht van het ruggenmerg door het plaatsen van een stuk van zoutoplossing doordrenkte gelfoam. (E) stap 5: afdichting van de gaten met steriele gelfoam en vetbond. Na het drogen, is een laagje agar muur gebouwd op de rand van het venster. (F) stap 6: als u klaar bent voor imaging, verwijderen de gelfoam en plaats immersie vloeistof binnen 2 P imaging venster. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig3.jpg"> 
Figuur 3 . De in vivo duo-kleur methode procedure stapsgewijze. De hele procedure bestaat uit 5 stappen (A). Na stap 1 en stap 2, een paar dextran tracers met een grootte van ongeveer 70 KDa zijn geïnjecteerd in de juiste volgorde op het etiket van het ruggenmerg therapieën voor (,B en C) en na contusive SCI (D). (E)-(G) vertegenwoordiger 2P beelden weergeven het ruggenmerg therapieën bij stap 3 tot en met stap 5. Witte pijlen wijzen naar eerste golf rode kleurstof lekkende gebieden (F en G), turquoise pijlpunten weergegeven tweede golf groene kleurstof lekkage (G). Schaal bar = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig4.jpg"> 
Figuur 4 . Verwerving en kwantificering van spinale vaartuig diameters. Na de bereiding, één afbeeldingsbestanden worden verworven onder 2 P microscopie, samen met XML-bestanden van gekalibreerde waarden (B). (A) de vergelijking wordt weergegeven van de berekening van de "pixel per micron" op basis van waarden van de optische zoom. Na kalibratie in ImageJ (C), vaartuig diameters zijn gemeten op 3 punten langs de longitudinale as voordat (D1) en na (E1) letsel. (D2) en (E2) de gemeten waarden weergegeven. (F) kwantificering van schip diameters op basislijn en 30 min na letsel. Schaal bar = 50 µm. gegevens worden weergegeven als bedoel ± SD, *** p &#60; 0.0001, tweezijdige gepaarde t-test.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig5.jpg"> 
Figuur 5 . Verwerving en kwantificering van spinale schip snelheid. De dossiers van het beeld van de lijn-scan zijn verworven onder 2 P microscopie voor het berekenen van één vaartuig snelheden. (A) een voorbeeld van een geselecteerde vaartuig en de methode te beoordelen bloedvat RBC snelheid. (B) een arteriële voorbeeld van lijn-scan afbeelding en bijbehorend perceel bestand voor berekening van snelheid, evenals een voorbeeld van een ader (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Slagader</td>
			<td>Ader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morfologie</td>
			<td>Rechte, gladde, dikke vaatwand</td>
			<td>Takken, ruwe randen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stroomsnelheid van bloed</td>
			<td>Snel</td>
			<td>Traag maar varieert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diameter</td>
			<td>30-80 µm</td>
			<td>100-250 µm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: Criteria voordeidentificatie van schip typen

We voeren een in vivo imaging methode met behulp van twee verschillende fluorescente kleurstoffen om dynamische spinale vasculaire wijzigingen na een contusive dwarslaesie bij volwassen Sprague-Dawley ratten te houden.

Een In Vivo Duo-kleur methode voor Imaging-vasculaire Dynamics na Contusive dwarslaesie

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Het algemene doel van deze in vivo duo-kleurige tweede foton beeldvormingsmethode is om de acute vasculaire dynamische veranderingen in de wervelkolom te bewaken die optreden na een contuserende ruggenmergletsel. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over hoe deze dynamische vasculaire veranderingen de pathologische progressie en de functionele tekorten die optreden na ruggenmergletsel beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven traditionele technieken met behulp van promoderne monsters is dat het bewijs levert van de acute vasculaire dynamica van ruggenmergletsel binnen een levend dier.De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de behandeling van ruggenmergletsel, aangezien deze methode ons in staat stelt potentiële neuroprotectieve strategieën te onderzoeken die gericht zijn op vroege vasculaire reparatie. We hadden voor het eerst het idee voor deze duo-kleurige beeldvormingsmethode toen we ontdekten dat sequentiële injectie van contrasterende fluorescentiekleuren ons in staat stelt om verstoorde vaten na ruggenmergletsel te visualiseren. Voordat u met de procedure begint, bevestigt u het juiste niveau van sedatie door gebrek aan reactie op teenprik van een zes weken oude vrouwelijke Sprague Dawley rat gevolgd door subcutane injectie van pijnstilling en een ontstekingsremmend middel.Scheer de rat in het cervicale wervelgebied en in het nekgebied aan de borstzijde van het dier en veeg de blootgestelde huid af met een Betadine chirurgische scrub en 70% alcoholdoekjes. Breng zalf aan op de ogen van het dier en plaats de rat in de rugligging op een steriele chirurgische pad bovenop een verwarmingspad van 37 graden Celsius onder een steriele microscoop. Zoek het pulserende punt nabij het sleutelbeen om de externe jugulaire ader te lokaliseren en gebruik een paar kleine steriele veerscharen om een verticale incisie te maken op de kruising van de caudale tak van de rechter onderkaak, het grote tuberkel van het opperarmbeen en het borstbeen.Gebruik de veerscharen en fijne pincetten om het jugulaire vat te isoleren en gebruik een steriele chirurgische hechtlijn om het distale uiteinde van het vat te binden. Gebruik vervolgens een paar microscharen om een kleine incisie in de vaatwand te maken en schuif een gespecialiseerde katheter gemaakt van een naald van 21 gauge verbonden aan een enkele milliliter spuit gevuld met zoutoplossing in het vat. Als er een kleine hoeveelheid bloed in de naald komt, is de inbrenging succesvol.Bevestig de naald aan de proximale en distale uiteinden. Om de wervelkolom te stabiliseren, draai het dier in rugligging en gebruik een mesje nummer 15 om de huid langs de middenlijn op de gewenste wervelniveaus te snijden. Lokaliseer de tweede thoracale wervel door de punt tussen de schouderbladen en tel opwaarts van T2 om de C7-wervel te vinden.Dissecteer de spierlagen van de vijfde tot de zevende cervicale wervels bilateraal om de laterale facetjes bloot te leggen en maak een snede aan beide zijden van het laterale wervelbeen. Schuif de roestvrijstalen armen van een gemodificeerde stabiliserende inrichting onder de blootgestelde facetjes van het dwars uitsteeksel en draai de schroeven vast om de wervelkolom te stabiliseren. Verwijder vervolgens zorgvuldig de C5 tot C7-lamellen en plaats een klein stukje in zoutoplossing gedrenkt gelfoam op de blootgestelde dura mater om het gehydrateerd te houden.Om het tweede foton beeldvormingsvenster te maken, plaats kleine stukjes gelfoam in de opening tussen de spieren en de wervelbotten en een dunne lijn gelfoam tussen het ruggenmerg en de wervelbotten. Vervolgens verzegelt u het omringende spierbeengebied met weefselkleefstof. de meest kritische stap bij het voorbereiden van een succesvol beeldvormingsvenster is ervoor zorgen dat er geen kleine bloedingen in het venster zijn.Laat de lijm ongeveer vijf minuten drogen, vul een steriele enkele milliliter spuit met warme 4% agar en doseer een muur agar langs de rand van het venster. De agar zal snel stollen terwijl het flexibel blijft. Om een basislijnbeeld te verkrijgen, verwijdert u eerst het gelfoam en voegt u duikvloeistof toe aan het venster.Plaats het gestabiliseerde dier in de donkere kamer van de tweede foton microscoop met het tweede foton beeldvormingsvenster direct onder een objectief met lage vergroting en laat de lens voorzichtig in het venster zakken. Vul een steriele enkele milliliter spuit met 0,5 milliliter vers bereide Rhodamine B isothiocyanate dextran oplossing en verbind de spuit met de katheter. Druk de zuiger heel langzaam in om de kleurstof af te geven en gebruik het oculair om het gebied van belang te identificeren en gebruik een beeldkoppelingscamera om een landmark helder veldbeeld van de oppervlakte bloedvatpatronen te verkrijgen.Open vervolgens de tweede foton beeldvormingssoftware om de stroom in te schakelen en selecteer de geschikte laser excitatiegolflengte. Selecteer vervolgens het juiste tweede foton laservermogen, HV-niveau en fluorescente kanaal dat overeenkomt met het geïnjecteerde fluorofoorexperiment en beeld het weefsel af door het beeldvormingsvenster om zowel beelden als lijnscangegevens te verzamelen. Om de C7 middenlijn contusie letsel te introduceren, plaats de rat op een Louisville Injury System Apparaat en selecteer een 0 punt instelling.Pas vervolgens de weefselverplaatsing aan en klik op experiment uitvoeren om de botsing of loslating te activeren die het letsel veroorzaakt. Plaats vervolgens een klein stukje in zoutoplossing gedrenkt gelfoam op de blootgestelde dura mater om het gehydrateerd te houden en open nieuwe beelden door het beeldvormingsvenster met behulp van dezelfde beeldvormingsparameters. Breng het dier terug naar de donkere kamer en injecteer 0,5 milliliter vers bereid fluoresceïne isothiocyanate dextran in de katheter.Breng vervolgens het dier terug naar de donkere kamer van de microscoop en verkrijg beelden in beide fluorofoorkanalen. Rhodamine dextran fluorescente kleurstof injectie maakt het mogelijk om een landmark beeld vast te leggen voor het in kaart brengen van het vasculaire netwerk op basislijn. Na de genera

an-vivo-duo-color-method-for-imaging-vascular-dynamics-following

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een minimaal invasieve protocol om de muis te wervelkolom te stabiliseren en uit te voeren...

In vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met behulp van twee-foton Microscopie

Live-Imaging van de dorsale wortel Axonen na Rhizotomy

We presenteren een protocol dat gebruikmaakt van twee-foton excitatie time-lapse microscopie om gelijktijdig de dynamica van axon- en myeline-verwondingen in real time te visualiseren. Dit voorgestelde protocol maakt studies mogelijk van zowel intrinsieke als extrinsieke factoren die het lot van centrale gemyeliniseerde axonen na verwonding kunnen beïnvloeden en kunnen bijdragen aan permanente klinische handicaps.

Een Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model Mechanismen van axonale degeneratie Beoordeel in real-time

Twee-foton intravital beeldvorming kan worden gebruikt om interacties tussen verschillende celtypen in het ruggenmerg in hun oorspronkelijke weefselomgeving in een botmerg chimerisch dier met een traumatische ruggenmergverplettering in de dorsale kolom te onderzoeken.

Intravitale Imaging van Axonale Interacties met Microglia en macrofagen in een muis Dorsale Column Crush Injury

Contrastverbeterde echografie is een betrouwbaar in-vivo hulpmiddel voor het kwantificeren van de bloedstroom in het ruggenmerg in een experimenteel model van ruggenmergletsel bij ratten. Dit artikel bevat een uitgebreid protocol voor de toepassing van deze techniek in combinatie met een contusiemodel van thoraxaal ruggenmergletsel.

Contrast Enhanced Imaging Ultrasound voor de Beoordeling van Spinal Cord Blood Flow in Experimentele Spinal Cord Injury

Een nieuw ex vivo voorbereiding voor het afbeelden van de muis ruggenmerg. Dit protocol maakt twee-foton beeldvorming van levende cellulaire interacties gehele ruggenmerg.

Twee-foton Imaging van Cellular Dynamics in de Muis Spinal Cord

Fototrombose is een minimaal invasieve en zeer reproduceerbare procedure om focale ischemie in het ruggenmerg te induceren en dient als een model voor ruggenmergletsel bij muizen.

Photothrombosis-geïnduceerde focale ischemie als een model van Spinal Cord Injury in Muizen

Hier presenteren we een combinatie van laser Doppler perfusie imaging (LDPI) en lokale bloed stromen en zuurstof verzadiging (SO2), evenals een gestandaardiseerde procedure voor de invoering van ruggenmerg laser Doppler perfusie toezicht (LDPM) voor het meten van spinal cord trauma's op rat.

Met behulp van Laser Doppler Imaging en toezicht voor het analyseren van ruggenmerg microcirculatie in Rat

De microcirculatie van het ruggenmerg speelt een cruciale rol bij dwarslaesie. De meeste methoden laten geen real-time beoordeling van de microcirculatie van het ruggenmerg toe, wat essentieel is voor de ontwikkeling van microcirculatiegerichte therapieën. Hier stellen we een protocol voor met behulp van Laser-Doppler-Flow Needle-sondes in een groot diermodel van ischemie / reperfusie.

Real-time beoordeling van ruggenmergmicroperfusie in een varkensmodel van ischemie / reperfusie

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Leer een in vivo duo-kleur twee-foton beeldvormingsmethode om vasculaire dynamiek te volgen na contusieve dwarslaesie bij Sprague-Dawley ratten. Deze techniek biedt inzicht in acute vaatveranderingen en mogelijke neuroprotectieve strategieën.

Een In Vivo Duo-kleur methode voor Imaging-vasculaire Dynamics na Contusive dwarslaesie

Meer video's verkennen