Multiplexed immunofluorescentie analyse en kwantificering van Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cellen
8 februari 2018
Bestuderen van tumor communicatie kan identificeren prognostische of voorspellende biomarkers voor klinische respons op immunotherapie. Hier wordt gepresenteerd, is een innovatieve methode op basis van in situ fluorescentie multispectrale imaging te analyseren en automatisch verschillende subpopulaties van CD8 tellen+ T cellen. Deze reproduceerbaar zijn en betrouwbare techniek is geschikt voor grote cohort analyses.
Het algemene doel van deze multiplexed immunofluorescentieanalyse is om cellen automatisch te tellen op basis van hun fenotype. Deze methode maakt multifluorescentie en automatische celtelling mogelijk om het fenotype en de functie van tumor-immuuncellen binnen een tumormicro-omgeving te analyseren. Deze technologie maakte de generatie van twee soorten samengestelde prognoses mogelijk die voorspeld worden door uw markers die rechtstreeks zijn afgeleid van de tumormicro-omgeving.
Over het algemeen kunnen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat de fenotypingprocedure erg lang is en de resulterende ruwe gegevens verdere verwerking vereisen. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we probeerden het fenotype en de immunologische interacties van annhodge miranty-cellen te karakteriseren. Na het ontdooien, gebruikt u een papieren handdoek om de dia's rond de weefselsecties voorzichtig te drogen en omcirkel dan de weefsels met een hydrofobe barrièrepen.
Wanneer de barrière is opgedroogd, fixeert u de monsters in 100% aceton gedurende vijf minuten, gevolgd door twee minuten luchtdrogen, en spoelt u vervolgens de dia's gedurende 10 minuten in TBS. Behandel de dia's met 3 druppels 0,1% Avidin gedurende 10 minuten in het donker, en tik of klap dan met de dia's om het weefsel te bedekken met de Avidin-oplossing. Voeg 3 druppels 01% biotine toe aan elk monster, tik of klap vervolgens met de biotine over de monsters, gevolgd door een TBS-was zoals zojuist gedemonstreerd.
Blokkeer vervolgens alle niet-specifieke bindingen met 100 microliter 5% normaal serum in TBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, tikt u op de dia's om het overtollige serum te verwijderen en incubeert u de dia's gedurende een uur in een bevochtigde kamer in 100 microliter van de primaire antilichaamcocktail van belang. Was de dia's met antilichamen in TBST gedurende vijf minuten.
Na het drogen, label de cellen met 100 microliter van de secundaire antilichaamcocktail van belang gedurende 30 minuten in de bevochtigde kamer, gevolgd door een 10 minuten wassen in TBS. Incubeer de gedroogde dia's met secundaire antilichamen in 100 microliter van de tertiaire antilichaamcocktail van belang gedurende 30 minuten gevolgd door 10 minuten TBS-was. Aan het einde van de was, droog de dia's en monteer de weefsels met een dapi-gesupplementeerd montagemedium.
Dek vervolgens elke dia af met een dekglas en laat het montagemedium minimaal twee uur uitharden. Om de dia's te scannen, opent u de microscoopsoftware en laadt u het beeldscanprotocol. Laad de eerste dia op de microscoopstandaard.
Klik vervolgens in de bedieningsbalk op 'Belichting instellen' en pas de belichtingstijd voor elke filter aan totdat een voldoende maar niet verzadigend signaal wordt verkregen. Klik op 'Start' in het bovenste paneel en open de LabID-map. Voer de ID van de eerste dia in en klik op 'Volgende'.
Om het overzicht van de dia onder fel veldlicht bij een 4x-vergroting te verkrijgen, klikt u op 'Monochroom beeldvorming' en zoekt u het specimen. Om het gebied van het weefsel te selecteren dat zal worden gescand, drukt u op de controletoets en gebruikt u de cursor om de gebieden van belang te selecteren of deselecteren die bij de 4x-vergroting zullen worden gescand. Om een fluorescerend rood/blauw/groen beeld van elk gebied te verkrijgen, klikt u op 'Laagvermogen beeldvorming'.
Voor selectie van een hoog vermogen veld, drukt u op de controletoets en selecteert u minimaal vijf gebieden van belang die overeenkomen met de gebieden van het weefsel die bij de 20x-vergroting zullen worden gescand. Klik vervolgens op 'Hoogvermogen beeldvorming' om een multispectrale beeldacquisitie van elk veld te verkrijgen en klik op 'Gegevensopslag' om de beelden op te slaan in de juiste Lab ID-map. Om een nieuw project aan te maken onder het bestandsmenu, selecteert u 'Nieuw project', onder het menu 'Zoeken' selecteert u 'Celsegmentatie' en onder het menu 'Fenotyping' selecteert u 'Fenotyping' en klik vervolgens op 'Configureren'.
Selecteer in beeldformaat 'Multispectraal'. In steekproefformaat, kies fluorescentie. Om de representatieve beelden in het project te integreren, klikt u onder het bestandsmenu op 'Afbeelding openen' en selecteert u 10-30 representatieve beelden van de hele serie.
Om de autofluorescentie te verwijderen, opent u de ongeverfde dia en selecteert u de bibliotheekbron en de juiste fluoroforen. Klik op 'Autofluorescentie' en selecteer het gebied van autofluorescentie op de lege dia. Om een samengesteld beeld te genereren, selecteert u 'Alles voorbereiden' om de fluorescentiebibliotheek en de autofluorescentiespectra te integreren.
Klik op het oogpictogram om het beeldeditorpaneel te openen en deselecteer autofluorescentie om het autofluorescentie signaal te trimmen. Selecteer een geschikte kleur voor elke marker. Om de cellen te segmenteren, selecteert u in het compartimentmenu 'Kernen en membraan'.
Stel onder het kernenmenu DAPI in als nucleaire tegendye. Klik op 'Cellen segmenteren' en controleer de segmentatie van de kernen in de celmembranen. Om de cellen te fenotyperen, klikt u onder het fenotypemenu op 'Toevoegen'.
Om de celfenotype categorieën te creëren, selecteert u meer dan vijf representatief voor Fluorophor en Fluorophor combinatie, en klikt u op 'Classifier trainen'. De classifier creëert een algoritme dat een fenotype voor elke cel toeschrijft met een betrouwbaarheidsinterval. Zoom en controleer de fenotypes van de cellen.
Klik vervolgens op 'Alles fenotyperen' om het fenotypealgoritme en het beeldproject op te slaan, selecteer onder het bestandsmenu 'Project opslaan'. Geef vervolgens de naam van het project en sla het op. Om een batchanalyse van de serie uit te voeren, selecteert u 'Batchanalyse' en selecteert u het opgeslagen project.
Selecteer een map voor het opslaan van de gegroepeerde gegevens. Voeg de te analyseren beelden toe en
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een innovatieve multiplex immunofluorescence analysemethode voor het automatisch tellen van tumor immuuncellen op basis van hun fenotype. De techniek is ontworpen om het tumor micro-omgeving te analyseren en prognostische biomarkers voor immunotherapie respons te identificeren.
Belangrijkste studie componenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Oncologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Het tumor micro-omgeving speelt een cruciale rol in kankerprogressie en behandelingsrespons.
- CD8 + T cellen zijn belangrijk voor immuunrespons in tumoren.
- Bestaande methoden voor celtelling kunnen tijdrovend zijn en uitgebreide gegevensverwerking vereisen.
- Deze studie beoogt de analyse van immuuncel fenotypes te stroomlijnen.
Doel van studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor automatisch tellen van immuuncellen in tumormonsters.
- Om grote cohortanalyses in kankeronderzoek mogelijk te maken.
- Om de begrip van immuuninteracties binnen het tumor micro-omgeving te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Multiplex immunofluorescence voor celfenotype analyse.
- In situ fluorescentie multispectrale beeldvorming voor automatisch tellen.
- Preparatie van weefselsecties met hydrofobe barrières voor beeldvorming.
- Gegevensverwerkingstechnieken om celpopulaties te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt efficiënt tellen van CD8 + T cel subpopulaties mogelijk.
- Resultaten wijzen op potentiële prognostische markers afgeleid van het tumor micro-omgeving.
- De techniek is reproduceerbaar en geschikt voor grootschalige studies.
- Verbeterd begrip van immuunceldynamica in tumoren.
Conclusies
- Deze innovatieve methode verbetert de analyse van tumor immuuncellen.
- Het biedt een raamwerk voor het identificeren van biomarkers voor immunotherapie.
- De aanpak kan worden aangepast voor verschillende onderzoekstoepassingen in oncologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Multiplexed immunofluorescence analysis enables automated quantification of immune cell phenotypes in the tumor microenvironment, supporting target validation and biomarker discovery in immuno-oncology. By measuring co-expression of inhibitory receptors such as PD-1 and Tim-3 on CD8+ T cells, the method provides predictive confidence for patient stratification and therapeutic response. This approach addresses a key discovery-stage challenge: translating spatial immune profiling into actionable insights for portfolio triage and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by clarifying PD-1 and Tim-3 co-expression patterns on tumor-infiltrating CD8+ T cells.
- Operational Value: Enables biological de-risking through functional target validation of exhaustion markers in renal cell carcinoma.
- Strategic Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by linking PD-1+/Tim-3+ T-cell frequency to poor prognosis and relapse risk.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via standardized multispectral imaging and phenotyping.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility and quantitative outputs through automated cell counting and segmentation.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse by integrating fluorescence library preparation and autofluorescence removal.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through correlation of PD-1+/Tim-3+ CD8+ T cells with prognostic scoring in renal cell carcinoma.
- Operational Value: Supports translational continuity from discovery to preclinical validation via composite imaging and phenotype algorithm training.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by identifying Tim-3 co-expression as a functionally relevant biomarker independent of PD-1 alone.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling immune profiling that informs target confidence and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying PD-1 and Tim-3 co-expression on CD8+ T cells in the tumor microenvironment.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through automated multispectral imaging and standardized phenotyping workflows.
- Analytics: Generates quantitative measurements such as PD-1 MFI and double-positive cell percentages to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via prognostic correlation in renal cell carcinoma specimens, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for immune profiling across tumor types, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in T-cell exhaustion pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of multiplexed immunofluorescence for immune cell quantification.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early biomarker identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on PD-1+/Tim-3+ T-cell thresholds linked to relapse.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, multispectral imaging, and image analysis software for phenotyping.
- Dependent on instrumentation including fluorescence microscopes with multispectral capabilities and environmental controls for slide preparation.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, exposure settings, and phenotyping algorithms across sites.
- Involves adaptation considerations for varying tissue types, fixation methods, and antigen retrieval protocols.
- Includes practical limitations such as lengthy phenotyping procedures and complex raw data processing requiring post-acquisition quality checks.
