Beoordeling van antilichaam gebaseerde Drugs gevolgen voor lymfkliertest beenmerg en peritoneale Macrophage activering
December 26th, 2017
Antilichaam gebaseerde drugs hebben een revolutie teweeggebracht in behandeling voor inflammatoire ziekten. Naast directe gevolgen hebben voor concrete doelstellingen, kunnen antilichamen macrofagen tot anti-inflammatoire activeren. Dit protocol beschrijft hoe anti-inflammatoire macrofaag activering kan worden beoordeeld in vitro met behulp van de muis het beenmerg macrofagen en in vivo, met behulp van peritoneale macrofagen.
Het algemene doel van deze experimenten is om de effecten van antilichaam-gebaseerde geneesmiddelen op anti-inflammatoire activeringstoestanden van macrofagen te bepalen met behulp van muisbeenmerg en peritoneale macrofagen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken op het gebied van immunologie, zoals of specifieke antilichaamgeneesmiddelen werken door macrofagen te veranderen in een IL-10 producerende anti-inflammatoire activeringstoestand. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de respons meet van primaire muismacrofagen uit het beenmerg in vitro en de buikholte in vivo.
Voer deze procedure uit in een steriele kap. Bevestig een geëuthaniseerde muis op zijn rug op een schuimplaat met zijn ledematen uitgestrekt. Reinig vervolgens de poten met 70%ethanol.
Maak vervolgens een ondiepe snede van ongeveer twee millimeter diep om de huid en vacht van het oppervlak van elke achterpoot te verwijderen. Vervolgens, dissecteren de weefsels om de scheenbeenderen en dijbeenderen te bereiken. Om de scheenbeenderen en dijbeenderen te verwijderen, snijd het bot en de spieren net onder het heupgewricht en boven de enkels.
Verwijder vervolgens zoveel mogelijk spierweefsel van de botten. Reinig vervolgens de botten met 70%ethanol en laat het een minuut verdampen. Plaats vervolgens de botten in een zes-puts plaat gevuld met beenvlees medium.
In de plaat, trim een millimeter van beide uiteinden van de dijbeenderen zodat hun binnenholten worden blootgelegd. Zorg ervoor dat een 26-gauge naald toegang heeft tot de holten. Scheid vervolgens het scheenbeen en dijbeen van de kniegewricht.
Steek vervolgens de naald die aan een 10 milliliter spuit is bevestigd in een botholte en verzamel het beenmerg. Trek het beenmerg uit alle vier de botten in een 50 milliliter conische buis met vijf milliliter beenvlees medium. Spuit het medium en merg omhoog en omlaag meerdere keren.
Of vortex op een lage snelheid om klonters in de suspensie voorzichtig te verspreiden. Strengen van merg moeten worden opgebroken in kleine vlokken merg van minder dan een halve millimeter lang. Vul vervolgens de buis aan tot 50 milliliter met beenvlees medium en breng het over in een 75 vierkante centimeter weefselkweekkolf.
Incubeer het beenmerg gedurende een uur. Tijdens de incubatie zullen de gerijpte cellen zich hechten aan de kolf en zullen de gewenste hematopoëtische voorlopercellen in suspensie blijven. Breng de suspensie over in een 50 milliliter conische buis en centrifugeer de cellen neer tot een pellet.
Vervolgens gooit u de supernatant weg en suspendeert u het cellenpellet in vijf milliliter MCSF-kweekmedium. Pas vervolgens de celdichtheid aan tot 500.000 per milliliter en laad 30 milliliter in een nieuwe 75 vierkante centimeter kolf. Blijf de cellen kweken en controleer op dag vier, zeven en tien dat de cellen hechtend en licht vertakt zijn met behulp van een omgekeerde fasecontrast-breekveldmicroscoop.
Bij het controleren van de cellen, gooit u het medium met de niet-hechtende cellen weg. Was vervolgens de hechtende cellen één keer met IMDM en voeg 30 milliliter vers MCSF-kweekmedium toe aan de kolf. Op dag tien vervangt u het medium met acht milliliter enzymvrije EDTA-gebaseerde celdissociatiebuffer om de cellen te verzamelen.
Incubeer de cellen kort, schraap de cellen voorzichtig en controleer of ze zijn vrijgekomen met behulp van een microscoop. Zodra de cellen zijn vrijgekomen, brengt u de buffer met de cellen over in een 50 milliliter conische buis. Spoel vervolgens de kolf drie keer met vijf milliliter IMDM om meer cellen te verzamelen.
Trek alle collecties samen, centrifugeer ze en suspendeer het pellet in drie milliliter MCSF. Tel nu de cellen en pas hun concentratie aan tot één miljoen per milliliter. Plaat vervolgens 100 microliter celsuspensie per put in een 96-puts vlakke bodemplaat.
De hele plaat moet vulbaar zijn. Kweek de cellen ongeveer een uur tot ze hechtend zijn. Stimuleer ze vervolgens met verschillende concentraties LPS of intraveneuze immunoglobuline of beide bereid in IMDM.
Voer alle manipulaties in duplicaat of triplicate uit en zorg ervoor dat u onbehandelde controles bijhoudt. Incubeer vervolgens de cellen gedurende 24 uur en analyseer de supernatanten. Bereid een milliliter spuit voor met de vereiste hoeveelheid intraveneuze immunoglobuline en LPS en bevestig een 26-gauge naald.
Gebruik voor controles PBS plus LPS in plaats daarvan. Houd de muis vast bij zijn nek terwijl u zijn achterste en staart met één hand vastzet. Richt u op het rechteronderkwadrant van de buik en steek de naald in een hoek van 30 tot 40 graden met de bevel omhoog en steek deze ongeveer 1,5 centimeter in.
Injecteer vervolgens de bolus. Na een uur, verzamel peritoneale macrofagen na het euthanaseren van de muis. In een steriele kap, speld de geëuthaniseerde muis vast op een schuimplaat met gespreide ledematen en steriliseer de buik met 70%ethanol.
Maak vervolgens een ondiepe twee millimeter incisie langs de middellijn en trek de buikhuid los. Vermijd het doorboren van de peritoneale wand. Vul vervolgens een vijf milliliter spuit volledig met steriel PBS bij een pH van 7,4 en injecteer de muis met een 25 of 27-gauge naald, aan de bovenkant van de buikholte, vanaf beide kanten, naar de middellijn, met de bevel van de naald omhoog.
Trek de naald eruit en masseer het peritoneum gedurende 10 seconden om de cellen los te maken. Steek vervolgens de naald weer in de holte en verzamel ongeveer 3,75 milliliter lavasvloeistof. Breng de lavasvloeistof over in een 15 milliliter conische buis op ijs.
Herhaal de injectie, massage en verzameling van lavasvloeistof nog drie keer en breng alle collecties in dezelfde buis. Tijdens de laatste verzameling kan het gemakkelijker zijn om de lavasvloeistof van de andere kant van de muis te verwijderen. Centrifugeer vervolgens de cellen neer en suspendeer ze in 500 microliter plateermedium.</
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel schetst een protocol voor het beoordelen van ontstekingsremmende macrofaagactivering geïnduceerd door antilichaam-gebaseerde geneesmiddelen. Het beschrijft methoden voor het evalueren van muis beenmerg macrofagen in vitro en peritoneale macrofagen in vivo.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Farmacologie
Achtergrond
- Antilichaam-gebaseerde therapieën hebben de behandeling van ontstekingsziekten getransformeerd.
- Macrofagen spelen een cruciale rol bij ontsteking en kunnen worden geactiveerd tot een ontstekingsremmende toestand.
- Inzicht in macrofaagactivering kan leiden tot betere therapeutische strategieën.
- Deze studie richt zich op de effecten van specifieke antilichaamgeneesmiddelen op het gedrag van macrofagen.
Doel van de studie
- Om te onderzoeken hoe antilichaam-gebaseerde geneesmiddelen macrofaagactiveringstoestanden beïnvloeden.
- Om te bepalen of deze geneesmiddelen een IL-10 producerende ontstekingsremmende activeringstoestand in macrofagen bevorderen.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van primaire muismacrofagen.
Gebruikte methoden
- Isolatie van beenmergmacrofagen uit muisdij- en scheenbeenderen.
- Kweek en stimulatie van macrofagen met LPS en immunoglobuline.
- Verzameling en analyse van peritoneale macrofagen na injectie van behandelingen.
- Beoordeling van macrofaagactiveringstoestanden door analyse van supernatant.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie en kweek van beenmerg- en peritoneale macrofagen.
- Aangetoonde veranderingen in macrofaagactiveringstoestanden in reactie op antilichaambehandelingen.
- Een gedetailleerde methodologie geboden voor toekomstige studies in macrofaagbiologie.
- De belangrijkheid van macrofaagactivering in therapeutische contexten benadrukt.
Conclusies
- Antilichaam-gebaseerde geneesmiddelen kunnen macrofaagactiveringstoestanden effectief veranderen.
- Dit protocol dient als een waardevol hulpmiddel voor immunologisch onderzoek.
- Verdere studies zijn nodig om de implicaties van deze bevindingen in klinische omgevingen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Evaluating the effects of antibody-based drugs on murine macrophage activation provides critical insight into immunomodulatory mechanisms relevant to biologic drug development. This approach enables mechanistic de-risking by clarifying whether candidate therapeutics induce anti-inflammatory states, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. Understanding macrophage responses informs portfolio decisions, especially for biologics targeting immune pathways in inflammatory and autoimmune indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding antibody-induced macrophage polarization.
- Supports biological de-risking by quantifying anti-inflammatory cytokine production, such as IL-10.
- Clarifies pathway engagement and functional target validation for antibody-based candidates.
- Facilitates predictive confidence in advancing immunomodulatory biologics.
Screening & Assay Development
- Prepares validated primary macrophage systems for downstream compound screening workflows.
- Standardizes cytokine quantification assays for reproducibility and cross-study comparability.
- Enables robust measurement of drug-induced changes in macrophage activation states.
- Supports reliable evaluation of candidate biologics in immune cell-based assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro and in vivo macrophage activation data with disease-relevant models in mice.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of immunomodulatory mechanisms.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for biologics with immune-modifying activity.
- Supports mechanistic de-risking for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling functional assessment of antibody-based drugs on primary macrophages both in vitro and in vivo.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antibody-induced anti-inflammatory macrophage states and pathway activation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cytokine readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers measurable outputs such as IL-10 and IL-12/23p40 levels for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease models to inform biomarker alignment and mechanism-of-action studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating diverse antibody-based biologics across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immunomodulatory drug development.
- Operational Value: Standardizes macrophage activation assays for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management for biologics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated immune mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary immune cell isolation and cytokine quantification.
- Needs access to sterile tissue culture, ELISA, and western blotting infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data analysis.
- Adaptable to genetically modified mouse models for mechanistic studies.
- Limited by species differences and the need for careful interpretation of murine data for human translation.
