Meten van vervormbaarheid en rode cel heterogeniteit in bloed door Ektacytometry
12 januari 2018
Hier presenteren we technieken voor het meten van de vervormbaarheid van de rode cel en cellulaire heterogeniteit door ektacytometry. Deze technieken zijn van toepassing op de algemene onderzoeken van rode cel vervormbaarheid en specifieke onderzoeken van bloed ziekten gekenmerkt door de aanwezigheid van zowel stijve als vervormbare erytrocyten in omloop, zoals sikkelcelanemie.
Het algemene doel van deze techniek is om de vervormbaarheid van rode bloedcellen en cellulaire heterogeniteit te meten door middel van ektacytometrie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in ektacytometrie, zoals hoe vervormbaar erytrocyten zijn, hoe heterogeen een bloedmonster is en hoe het experiment verandert als functie van de ziekte. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn toegankelijkheid, gemak en betrouwbaarheid bij het meten van de vervormbaarheid en heterogeniteit van rode bloedcelpopulaties.
De technieken kunnen nuttig zijn voor het monitoren van de respons op therapie bij patiënten met sikkelcelanemie. Omdat de vervormbaarheid en heterogeniteit van rode bloedcellen gecorreleerd zijn met hemoglobinesamenstelling en -concentratie. Deze methoden kunnen worden toegepast op andere ziekten die worden gekenmerkt door verminderde vervormbaarheid van rode bloedcellen, zoals diabetes, waarbij verminderde vervormbaarheid van rode bloedcellen kan bijdragen aan microvasculaire ziekten.
Begin met het aansluiten van de nul osmolariteit buis op de lage osmolariteit PVP-oplossing, en de 500 osmolariteit buis op de hoge osmolariteit PVP-oplossing. Zorg ervoor dat de bob volledig in de cup is neergelaten. Start de software en prepareer de machine door Hardware Check te selecteren en vervolgens instrument IO. Laat het instrument de priming cyclus voltooien.
Zodra de cyclus voltooid is, til de bob uit de cup en droog de bob en de cup volledig af met een laag pluisvrij schoonmaakdoekje. Meng een vers afgenomen volbloedmonster voorzichtig door de fles meerdere keren om te draaien. Pipetteer vervolgens 25 microliter volbloed in vijf milliliter iso-osmolariteit PVP-oplossing.
Na het afdekken van de fles, meng voorzichtig door de fles weer meerdere keren om te draaien. Kies vervormbaarheid vanuit het hoofdmenu van de software, maak vervolgens een nieuwe analyse aan en voeg de experimentele details toe. Til vervolgens het deksel van de ektacytometer op en controleer of de bob volledig in de cup is neergelaten en dat de cup draait.
Pipetteer één milliliter PVP bloedoplossing in de ruimte tussen de cup en de bob. Til vervolgens de bob lichtjes om het monster naar beneden te brengen. Wacht tot alle luchtbellen uit de oplossing zijn verdwenen en sluit vervolgens het deksel van de ektacytometer.
Pas de versterking aan op 200 door de pijl langs de scrollbalk in de software te verplaatsen. Wanneer de temperatuur stabiel is op 37 graden Celsius en het diffractiebeeld stabiel is, drukt u op start. Observeer de diffractiepatronen terwijl de dataverzameling vordert om ervoor te zorgen dat ze rond, elliptisch of diamantvormig blijven.
Wanneer de dataverzameling voltooid is, druk het rapport af en maak schoon. Een diffractiepatroon verkregen van gezond bloed in reactie op schuifspanning toont het verwachte elliptische patroon. De verlengingsindex wordt berekend met behulp van de vergelijking die hier wordt getoond.
Wanneer het monster wordt aangezogen, spoel de ruimte tussen de cup en bob door gedeïoniseerd water in de ruimte te spuiten terwijl het instrument in de reinigingscyclus blijft. Zodra de reinigingscyclus voltooid is, til de bob uit de cup en droog de bob en de cup volledig af met een laag pluisvrij schoonmaakdoekje. Goed drogen is cruciaal, omdat resterend water rode bloedcellen zal lyseren, wat interferentie veroorzaakt.
Selecteer exporteren om het rapport op te slaan. Klik ten slotte op de hoofdmenuknop in de software om terug te keren naar de hoofdpagina. Zorg ervoor dat er een stabiel diffractiebeeld op het scherm aanwezig is nadat u een ander monster in de ektacytometer hebt geladen zoals eerder. Pas de cameraversterking aan door een liniaal langs het scherm te bewegen tot het een diffractiehoogte van 3,8 cm produceert. Gebruik een liniaal om de hoogte van het beeld op het computerscherm te verifiëren. Druk vervolgens op start en observeer de dataverzameling zoals eerder.
Deze afbeelding toont een 3,8 cm diffractiepatroon verkregen van bloed van een patiënt met sikkelcelanemie. Na het schoonmaken van de ektacytometer zoals eerder getoond, herhaalt u de procedure om diffractiepatronen te verkrijgen bij 4,5 cm en 5,4 cm hoogtes. Diffractiepatroonvervorming treedt op in heterogene bloedmonsters omdat stijve rode bloedcellen zich niet goed uitlijnen met vervormbare cellen, wat resulteert in een diamantvormig diffractiepatroon.
Dit vervormingspatroon is steeds detecteerbaar naarmate de cameraversterking wordt aangepast om grotere diffractiepatronen te genereren. Voor osmotische gradiënt ektacytometrie, begin met het toevoegen van 250 microliter volbloed aan een fles met vijf milliliter iso-osmolariteit PVP en meng voorzichtig. Kies Osmoscan vanuit het hoofdmenu in de software.
Plaats vervolgens de fles met de bloed-PVP-oplossing onder de naald aan de linkerkant van de machine. Laat de naald zakken totdat deze de bodem van de fles raakt. Zorg ervoor dat de slang goed is aangesloten op de lage en hoge osmolariteit oplossingen voor gradiëntproductie.
Sluit het deksel van de ektacytometer en open de deur aan de onderkant om een zicht op het bloed te krijgen dat de slang binnenkomt. Druk op Nieuwe Analyse en typ de experimentele details in. Nadat de cameraversterking is aangepast naar 200, laat u de machine draaien totdat het bloed vanuit de slang onder het instrument in de cup komt.
Wanneer het computerscherm een stabiel diffractiepatroon toont, begint u met dataverzameling door op de knop Nu starten te drukken in het dialoogvenster. Laat de ektacytometer data verzamelen tot ongeveer 500 milliosmolen per kilogram en stop vervolgens het instrument. Druk het rapport af.
Verwijder vervolgens de oude PVP bloedfles en vervang deze door een schone fles met gedeïoniseerd water. Laat de naald zakken zodat deze de bodem van de fles raakt en druk vervolgens op de knop Spoelen in het dialoogvenster om het gradiëntsysteem te spoelen. Zodra het spoelen vol
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert technieken voor het meten van de deformabiliteit van rode bloedcellen en cellulaire heterogeniteit met behulp van ektacytometrie. Deze methoden zijn bijzonder relevant voor het bestuderen van bloedziekten zoals sikkelcelanemie, waarbij zowel rigide als deformabele rode bloedcellen aanwezig zijn.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Hematologie
- Klinisch onderzoek
Achtergrond
- De vervormbaarheid van rode bloedcellen is cruciaal voor een correcte bloedstroom en microvasculaire functie.
- Cellulaire heterogeniteit kan invloed hebben op de ziekteprogressie en de respons op een behandeling.
- Ektacytometrie biedt een betrouwbare methode om deze parameters te beoordelen.
- Inzicht in de vervormbaarheid kan helpen bij het monitoren van aandoeningen zoals sikkelcelanemie en diabetes.
Doel van de studie
- Om de vervormbaarheid en heterogeniteit van rode bloedcellen in bloedmonsters te meten.
- Om de relatie tussen vervormbaarheid en ziektebeelden te onderzoeken.
- Om een protocol te bieden voor het gebruik van ektacytometrie in klinische omgevingen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van bloedmonsters met iso-osmolaire PVP-oplossing.
- Gebruik van een ektacytometer voor het meten van diffractiepatronen.
- Gegevensverwerving en analyse om de elongatie-index te bepalen.
- Vergelijking van bloedmonsters van gezonde personen en personen met sikkelcelanemie.
Belangrijkste resultaten
- Gezond bloed vertoont de verwachte elliptische diffractiepatronen.
- Sikkelcelbloed vertoont een significante afname in deformeerbaarheid.
- Heterogene bloedmonsters produceren vervormde diffractiepatronen.
- De methoden zijn effectief voor het monitoren van therapieresponsen bij patiënten.
Conclusies
- Ektacytometrie is een waardevol instrument voor het beoordelen van eigenschappen van rode bloedcellen.
- De resultaten benadrukken het belang van de deformabiliteit van rode bloedcellen bij het beheer van ziekten.
- Verder onderzoek kan de toepassingen uitbreiden naar andere bloedgerelateerde aandoeningen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Ektacytometrie biedt een betrouwbare methode voor het meten van de vervormbaarheid en cellulaire heterogeniteit van rode bloedcellen, welke kritieke biomarkers zijn bij hematologische aandoeningen zoals sikkelcelanemie en diabetes. Deze metingen ondersteunen de validatie van targets door mechanische eigenschappen van rode cellen te koppelen aan de hemoglobinecompositie en de ernst van de ziekte, wat mechanische risicoreductie mogelijk maakt in preklinisch en translationeel onderzoek. De techniek verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij het monitoren van therapeutische respons en bij portfoliobeslissingen voor geneesmiddelenontwikkelingsprogramma's gericht op hematologie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de vervormbaarheid van rode bloedcellen te correleren met hemoglobinevarianten en de pathofysiologie van de ziekte.
- Operationele waarde: Maakt functionele doelwitvalidatie mogelijk via kwantitatieve beoordeling van de cellulaire heterogeniteit in bloedmonsters.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de selectie van preklinische modellen door ziekte-relevante systemen te identificeren met meetbare tekortkomingen in de vervormbaarheid.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gestandaardiseerde biologische systemen voor voor downstream screening via de preparatie van iso-osmolaire PVP en kalibratie van de ektacytometer.
- Kwantitatieve output: Genereert de elongatie-index en diffractiepatroonanalyse als reproduceerbare, schaalbare read-outs voor compound screening.
- Hergebruik van het platform: Ondersteunt longitudinale monitoring van therapeutische interventies door middel van consistente, betrouwbare metrieken voor vervormbaarheid en heterogeniteit.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Direct toepasbaar op sikkelcelanemie en andere hemolytische anemieën waarbij heterogeniteit van rode bloedcellen de onderliggende moleculaire pathologie weerspiegelt.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische fasen door biomarker-gealigneerde read-outs te bieden van cellulaire hydratatie, osmotische fragiliteit en oppervlakte-volumeratio's.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert go/no-go-criteria door veranderingen in vervormbaarheid te kwantificeren die gekoppeld zijn aan de hemoglobinecompositie en therapeutische correctie.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Ektacytometrie integreert in het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en preklinische validatie, in het bijzonder voor hematologische indicaties waarbij de mechanica van rode bloedcellen de werkzaamheid en veiligheid van geneesmiddelen beïnvloeden.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door te meten hoe de vervormbaarheid verandert als functie van de ziektestatus en genetische modifiers zoals hemoglobine S, A2 en foetaal hemoglobine.
- Screening: Levert assay-klare systemen met reproduceerbare diffractiepatroonanalyse onder gecontroleerde afschuifspanning- en osmotische gradiëntcondities.
- Analytics: Biedt kwantitatieve afhankelijke variabelen, waaronder de elongatie-index (EI max, EI min) en osmotische fragiliteit (O min) voor vergelijking tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische validatie via gecorreleerde parameters zoals cellulaire hydratatie en osmotische fragiliteit die de hemoglobinecompositie bij sikkelcelziekte weerspiegelen.
- Enterprise Reuse: Functioneert als een herbruikbaar platform voor het monitoren van temporele veranderingen, ziekteprogressie en therapeutische respons bij meerdere aandoeningen, waaronder diabetes en Plasmodium-infectie.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen door mechanische ambiguïteit in het gedrag van rode cellen binnen heterogene bloedpopulaties te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid door gekalibreerde gain-instellingen, temperatuurbeheersing op 37°C en consistente protocollen voor monsterpreparatie.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege detectie van non-responders mogelijk te maken en het risico op falen in een laat stadium in hematologische programma's te verminderen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door vervormingsmetrieken te koppelen aan hemoglobineconcentratie en therapeutische correctie, zoals de effectiviteit van transfusies bij sikkelcelanemie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de verwerking van hematologische monsters en het bedienen van een ektacytometer, inclusief een correcte reiniging om lysis door resterend water te voorkomen.
- Afhankelijk van instrumentatie die in staat is tot laserdiffractie-viscometrie en softwaregestuurde gain-aanpassing voor de acquisitie van het diffractiepatroon.
- Vereist standaardisatie van de monstervoorbereiding tussen teams, inclusief de verdunning van volbloed in iso-osmolair PVP en protocollen voor mengen door omkeren.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij uitbreiding naar modelsystemen met variërende rode celmorfologie of hemoglobinexpressieprofielen.
- Beperkt tot metingen op populatieniveau; lost de deformabiliteit van individuele cellen niet op, waardoor complementaire methoden zoals microscopie nodig zijn voor subcellulaire analyse.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Ektacytometer Set-up
1:48
Measuring Deformability as a Function of Increasing Shear Stress
4:10
Measuring Cellular Heterogeneity
5:20
Osmotic Gradient Ektacytometry
7:16
Results: Diffraction Pattern Distortion and Relationship to Hemoglobin
8:41
Conclusion
