Next-generation Sequencing en Bioinformatics pijpleiding om te evalueren van genetische determinanten van constitutionele ziekte gericht

Het algemene doel van gerichte next-generation sequencing is om de genetische determinanten van verschillende constitutionele ziekten te verduidelijken door zich te concentreren op genomische regio's van bijzonder belang. Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over de genetische ideologie van een ziekte, vooral wanneer er eerder bekende genetische associaties zijn. Deze techniek is zeer efficiënt.

Het produceert miljoenen reads in een korte periode van tijd, we krijgen ze voor een relatief lage prijs, er is een relatief lage computationele belasting, vooral wanneer we het vergelijken met andere next-generation sequencing benaderingen. De implicaties van de techniek strekken zich uit tot de diagnose van neurodegeneratieve ziekten, die fenotypisch en genetisch heterogeen zijn, maar veel bekende geassocieerde genetische loci hebben. Hoewel deze methode vooral gericht is op neurodegeneratieve ziekten, kan deze ook worden toegepast op verschillende andere constitutionele ziekten met eerder geïdentificeerde genomische regio's van belang.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat de bio-informatische verwerking die vereist is voor de uiteindelijke analyse van zeldzame varianten computationeel intensief kan zijn en veel bronnen van fout kan creëren. In deze procedure worden menselijke bloedmonsters verzameld in drie, vier milliliter EDTA K2 buisjes om een totaal volume van ongeveer 12 milliliter te verkrijgen. Centrifugeer de bloedmonsters gedurende 20 minuten bij 750 maal de zwaartekracht.

Dit zal elk monster fractioneren in een bovenste fase van plasma, een dunne middelste fase van leukocyten en een onderste fase van erytrocyten. Pipetteer het plasma van de bovenkant van het bloedmonster met behulp van een wegwerpbare overdrachtspijp. Verdeel in meerdere 500 microliter aliquots en bewaar deze bij min 80 graden Celsius voor toekomstige biochemische analyse.

Extract DNA uit het bloedmonster met een bloedextractiekit volgens de instructies van de fabrikant. Het geëxtraheerde DNA wordt vervolgens gebruikt om een sequencing bibliotheek voor next-generation sequencing voor te bereiden. Zodra de sequencing run voltooid is, vindt u de bestanden in de cloud-based computing omgeving door Runs te selecteren op het navigatiepanel.

Selecteer de juiste sequencing run om naar de run samenvattingspagina te navigeren. Selecteer Download om gegevens uit de cloud te verkrijgen. Selecteer in het dialoogvenster dat verschijnt de FASTQ-bestanden als het bestandstype om te downloaden en klik op Downloaden.

Vanaf de Run Summary pagina van de cloud-based computing omgeving, navigeer naar Charts om de kwaliteit van de sequencing run te analyseren met de verschillende figuren geproduceerd door de computing omgeving. Vanaf de Run Charts pagina, vindt u de figuur gelabeld Data By Cycle, selecteer onder Chart Intensity en onder Channel selecteer Alle Kanalen om de signaalintensiteitsplot te produceren. Selecteer binnen het Run Navigatie paneel de Indexing QC tab om de Indexing Quality Control histogram te vinden, die zich aan de rechterkant van de pagina bevindt.

Vanaf de Run Summary pagina van de cloud-based computing omgeving, klikt u binnen het Run navigatiepaneel op Metrics om naar de kwaliteitsmetrieken te navigeren. Onder Density kelvin per millimeter squared, zorg ervoor dat de clusterdichtheid van de sequencing run binnen het bereik aanbevolen door de gebruikte verrijkingskit ligt. In dit geval, 1.200 tot 1.400 kelvin per millimeter squared.

Onder de Total Percent groter dan of gelijk aan Q30, zorg ervoor dat de waarde groter is dan of gelijk aan 85% reflecterend de kwaliteit van de sequencing reads. Onder Aligned zorg ervoor dat de waarde vergelijkbaar is met het percentage positieve controle dat in de sequencing run is opgenomen. Bijvoorbeeld, als 1% positieve controle werd gebruikt, zou het verwachte gealigneerde percentage ongeveer 1 tot 5% zijn en variaties binnen enkele decimale punten zijn acceptabel.

Begin dit proces door FASTQ sequencing reads te importeren in de gegevensverwerkingssoftware. Klik binnen het navigatiegebied met de rechtermuisknop en selecteer Nieuwe map. Noem de map zodanig dat er duidelijkheid is over de uitgevoerde sequencing run.

Vanaf de werkbalk bovenaan, selecteert u Import en kiest u uit de vervolgkeuzelijst het platform waarmee de sequencing is uitgevoerd. Voor de doeleinden van ONDRISeq, wordt Ilumina gekozen. Navigeer in het dialoogvenster naar en selecteer de FASTQ-bestanden van de sequencing run die wordt verwerkt.

Vanaf de Algemene opties van het dialoogvenster, klik op het vakje naast Paired reads als er gepaarde end chemieën zijn gebruikt voor de sequencing. Vanaf de Paired read informatie van het dialoogvenster, selecteer Paired-end als het voorwaartse read FASTQ-bestand voorkomt vóór het omgekeerde read in de bestandslijst. Stel de Paired read minimum afstand in op één en de maximale afstand tot 1000.

Vanaf de Ilumina opties van het dialoogvenster, selecteer Verwijder mislukte reads. Selecteer vanaf de Quality score vervolgkeuzelijst de NGS-pijplijn die is gebruikt voor de sequencing. Selecteer Volgende onderaan het dialoogvenster.

Selecteer Opslaan en Maak submappen per batch eenheid. Selecteer Volgende onderaan het dialoogvenster. Kies de map die eerder is gemaakt.

Dit is waar de FASTQ-bestanden worden geïmporteerd. Selecteer Voltooien onderaan het dialoogvenster en wacht tot de FASTQ-bestanden zijn geïmporteerd. Klik op het tabblad Processen om de status van de bestandsimport te zien.

Ontwerp vervolgens een workflow binnen de software om resequencing en variant calling uit te voeren volgens de instructies van de fabrikant. Het ontwerpen van de resequencing en variant calling workflow is het moeilijkste aspect van deze procedure. Ons team onderzocht beste praktijken en gebruikte proef en fout om te komen tot de meest robuuste workflow die aan onze behoeften voldoet.

Om de geïmporteerde FASTQ sequencing read bestanden door de aangepaste bio-informatica workflow te laten lopen, begint u door de workflow in de software's toolbox te identificeren en erop te dubbelklikken. In het dialoogvenster dat verschijnt, zoekt u de mappen van FASTQ-bestanden die zijn geïmporteerd in het navigatiegebied. Markeer alle mappen door ze te selecteren in het navigatiegebied en klik vervolgens op het vakje naast Batch.

Gebruik de pijl naar rechts om de bestanden naar geselecteerde elementen te verplaatsen. Klik onderaan het dialoogvenster op Volgende. Controleer in het dialoogvenster de batchoverzicht om er zeker van te zijn dat de juiste FASTQ-bestanden zijn geselecteerd en klik vervolgens op