Hoogefficiënte Gene verstoring van lymfkliertest en menselijke hematopoïetische voorlopercellen door CRISPR/Cas9

Het algemene doel van dit protocol is om snel en efficiënt gendisruptie te bereiken door middel van CRISPR/Cas9 en primaire hematopoëtische voorlopercellen met behulp van een ribonucleoproteïne-aanpak. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden op het gebied van normale en maligne hematopoëse, zoals wat de moleculaire en fenotypische gevolgen zijn van het verlies van gen X. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het uiterst eenvoudig, snel en kosteneffectief is. De geschatte tijd die nodig is vanaf het ontwerp van het experiment tot de uitvoering is korter dan een week.

Hoewel deze methode is geoptimaliseerd voor hematopoëtische voorlopercellen, kan deze worden toegepast op andere celtypen, zoals primaire T-cellen, muis- en humane hematopoëtische cellijnen en primaire leukemiemonsters. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we ontdekten hoe andere CRISPR/Cas9-leveringsbenaderingen, inclusief plasmiden en virussen, ofwel toxisch waren voor onze cellen of een langdurige wachttijd hadden. Om single-guide RNA's van belang te ontwerpen, navigeert u eerst naar de CRISPRscan-website.

Op basis van de cel van belang, klikt u op de muis- of menselijke knop en voert u vervolgens het gen van belang in de UCSC-zoekbalk in en klikt u op gaan. Zoom vervolgens in op het exon dat u wilt targeten. Controleer of er single-guide RNA-doelsequenties staan vermeld onder de CRISPRscan-voorspellingen onder de kop Genen.

Klik vervolgens op een doel-single-guide RNA gelabeld als een groen rechthoek en kopieer de volledige sequentie die onder de Oligo-sequentie wordt weergegeven. Plak vervolgens de sequentie in een tekstdocument. Voeg vervolgens de nucleotiden ATAGC toe aan het drie-prime-uiteinde van de sequentie.

Plaats de bestelling voor de volledige lengtesequentie. Nu, om de DNA-sjabloon voor de single-guide RNA te synthetiseren, lost u op en verdunt u de single-guide RNA-voorwaartse en universele omgekeerde primers. Voeg vervolgens alle reagentia in een PCR-buis toe om de overlappende PCR uit te voeren.

Na het samenstellen van de PCR-reactie, plaatst u de buis in een thermocycler en voert u het programma uit. Zodra het programma voorbij is, zuivert u het PCR-product met behulp van DNA-zuiveringskolommen. Verdun het DNA in 11,5 microliters elutiebuffer.

Gebruik vervolgens elutiebuffer als blanco op de spectrofotometer. Meet de concentratie van het monster-DNA op de spectrofotometer. Meng eerst het geëluteerde DNA, deoxynucleotidefosfaten, reactiebuffer en T7 RNA-polymerase-enzymmix in de PCR-stripbuisjes.

Bewaar vervolgens het monster gedurende vier uur bij 37 graden Celsius. Breng vervolgens het RNase-reinigingsmiddel aan om RNase van de gebruikte handschoenen te verwijderen. Pas vervolgens het volume van elk RNA-monster aan op 50 microliters met nuclease-vrij water.

Zuiver het RNA volgens de instructies van de fabrikant. Elueer ten slotte het RNA in 50 microliters nuclease-vrij water. Gebruik eerst het nuclease-vrije water om de spectrofotometer blanco te stellen en meet vervolgens de concentratie van het geëluteerde RNA.

Gebruik trypanblauwe uitsluiting om het aantal cellen te tellen. Verzamel voor elke replicaat 200.000 levensvatbare cellen per replicaat en voeg vervolgens fosfaatgebufferd zout oplossing toe om de cellen te wassen. Draai vervolgens de buis 300 keer g gedurende zeven minuten.

Na de centrifugering, verwijdert u voorzichtig het supernatant. Tijdens het centrifugeren, incubeert u 1,5 microgram Cas9 met één microgram van het totale single-guide RNA in een PCR-buis gedurende 20 tot 30 minuten. Dit is om de Cas9-sgRNA RNP-complexen voor elke replicaat voor te bereiden.

Na het berekenen van het volume van de verdunningsbuffer T dat nodig is, lost u de verkregen cellenpellet op in de verdunningsbuffer T.Voeg vervolgens 10 microliters van de opgeloste celsuspensie toe aan de PCR-buis met de Cas9-sgRNA RNP-complexen. Schakel vervolgens de elektroporatie-eenheid in. Schuif de cuvette in de cuvettehouder.

Voeg vervolgens drie milliliter buffer E toe.Stel de voorwaarden in op het elektroporatieapparaat. Om de elektroporatie uit te voeren, houdt u eerst de elektroporatiepipet vast, schuift u de klauw uit en grijpt u de schijf in de pipettip, drukt u de pipet vervolgens stevig naar beneden om de tip vast te zetten. Meng vervolgens het monster door het 10 keer op en neer te pipetten.

Zuig 10 microliters van het monster op en zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn. Steek vervolgens de punt direct in de elektrolytische buffer in de elektroporatiecuvette. Druk vervolgens op Start op het scherm.

Laat het volledige bericht op het scherm verschijnen. Verwijder vervolgens de pipet uit de cuvette. Spuit vervolgens de inhoud van de cuvette in de put gevuld met nieuw HSPC-kweekmedium.

Om de efficiëntie van de Cas9-sgRNA RNP-elektroporatie te bestuderen, worden HSPC's geïsoleerd uit de muizen geëlektroporeerd met single-guide RNase die targeting heeft op GFP of tdTomato. Deze HSPC's drukken ubiquitair GFP of tdTomato tot expressie. Flowcytometrische analyse toont ongeveer 75 en 74%verlies van GFP of tdTomato-expressie in de HSPC's op het niveau van eiwitten.

Vervolgens wordt een T7-endonuclease één-based assay uitgevoerd met PCR-versterkte DNA van de GFP-locus van de geëlektropoerde cellen. Dit is om de efficiëntie van gendisruptie van GFP te kwantificeren. ImageJ-software wordt gebruikt om de verhouding van de intensiteiten van de gekliefde en ongekliefde banden te berekenen om het percentage kliefing te berekenen.

De efficiëntie van drie verschillende single-guide RNA's die zich richten op humaan CD45 wordt getest in de HL-60 AML-cellijn. Flowcytometrie toont single-guide RNA1 als de meest efficiënte met 98%knockout-efficiëntie in vergelijking met de controle. Vervolgens wordt CD45-knockout ook uitgevoerd in primaire humane navelstrengbloed CD34-positieve HSPC's met behulp van single-guide RNA1.

Flowcytometrische analyse