Name: CRISPR-gemedieerde reorganisatie van chromatine lusstructuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Leer de CLOuD9-methode voor chromatine-lusreorganisatie met CRISPR-dCas9 om genexpressie selectief en reversibel te moduleren. Deze techniek helpt onderzoekers de relatie tussen chromatinestructuur en transcriptiedynamiek te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, P. Batista, E. Calo en het gehele Wang laboratorium voor technische ondersteuning en kritische lezing van het manuscript. S.L.M. heeft gesteund in dit werk via de NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) en het National Cancer Institute (1F99CA222541-01). K.C.W. wordt ondersteund door een Career Award voor medische wetenschappers uit het Burroughs-Wellcome-Fonds, en is een Donald E. en Delia B. Baxter Stichting faculteit geleerde.

1. gRNA Design
<ol><li>Selecteer een programma voor het ontwerpen van standaard gRNA te ontwerpen de gids RNAs10. Aanvullende paren van de eerder ontwikkelde CLOuD9 constructies9 gebruiken (dat wil zeggen, ten minste 1 S. aureus (CSA) en 1 S. pyogenes (CSP) bouwen) voor elk experiment.<ol>
<li>Binnen de geselecteerde online design tool, gebruikt u de Protospacer aangrenzende Motif (PAM) reeks "NGG" met een lengte van de gids van 20 bp voor CSP en de PAM volgnummer "NNGRRT" met een lengte van de gids van 21 voor CSA.</li>
		<li>Kies gidsen gebaseerd op specificiteit scoren en gidsen op beide strengen te maximaliseren kansen op het verkrijgen van een werkende gids ontwerpen.</li>
		<li>Bestel 2 oligonucleotides per gids van een oligo-fabrikant: voor de voorwaartse oligo, "caccg" aan het einde 5' van de gids-reeks, en voor de omgekeerde oligo toevoegen, "aaac" toevoegen aan de einde 5' en 'c' aan de 3'-eind alvorens te bestellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In eerste instantie het ontwerp van 3-5 gRNAs voor elk gebied van belang, verspreid over een gebied van de bp 250-1000. Beoordelen van de gRNA gericht op efficiëntie als volgt:<ol>
<li>Kloon geïdentificeerd gRNAs in een actieve Cas9 plasmide (zie stap 3) en Transient transfect in 293T cellen (zie stap 4)11.</li>
		<li>Groeien van cellen voor 2-3 d in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (pen strep), dan oogst en pak genomic DNA12.</li>
		<li>Beoogde regio's versterken door de polymerase-kettingreactie (PCR). Uitvoeren van producten op een 1,5% agarose gel en te zuiveren van geschikte banden.</li>
		<li>Voert een T7 endonuclease test zoals beschreven in de Guschin, et al.. protocol13,14. Opmerking: Efficiënte gidsen worden bepaald om te snijden DNA op de doelsite.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. de celkweek
<ol><li>Cellen in een gezond en actief delen staat te handhaven.<ol>
<li>Voor K562s, cultuur in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 media met 10% FBS en 1% pen strep.<ol>
<li>Groeien K562s in een maatkolf van 25 cm2 gekanteld nek voor onderhoud en aanpassen van de celdichtheid aan 400.000 cellen per mL per dag.</li>
			<li>Nadat K562s hebben al getransduceerde met CLOuD9 construeert, 2 µg/mL puromycin en 100 µg/mL hygromycin toevoegen aan onderhoud media.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voor 293Ts, cultuur in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% FBS en 1% pen strep.<ol>
<li>293Ts in 10 cm2 platen groeien en gesplitst bij confluent.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. plasmide voorbereiding en gRNA inbrengen15
Opmerking: Plasmide kaarten zijn beschikbaar in het aanhangsel en inleidingen gebruikt in de voorbeeld-experimenten zijn beschikbaar in de aanvullende tabel 1.
<ol><li>Meng 5 µg voor het lentivirale CRISPR-plasmide met 3 µL van BsmBI, 3 µL van alkalische fosfatase, 6 µL van 10 x Buffer en 0.6 µL van vers bereide 100 mM DTT. Breng het totale volume aan 60 µL met ddH2O en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten om te verteren en dephosphorylate van de plasmide.</li>
	<li>Gel zuiveren het verteerd plasmide en elueer in ddH2O.</li>
	<li>Meng 1 µL van elk van de gekoppelde gidsen op 100 µM met 1 µL van 10 x T4 afbinding Buffer, 6.5 µL van ddH2O en 0,5 µL T4 PNK, tot 10 µL totale volume. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten, dan 95 ° C gedurende 5 min, en vervolgens oprit tot 25 ° C bij 5 ° C/min. Opmerking: Dit zal het paar van gidsen ontharden.</li>
	<li>Verdun de ontharde gidsen (uit stap 3.3) 1:200 in ddH2O.</li>
	<li>Meng 1 µL van het verteerd plasmide uit stap 3.2 met 0,5 µL van de verdunde ligaturen gidsen vanaf stap 3.4, 2.5 µL van 2 x Buffer 1 µl van ddH2O en 0,5 µL van Ligase, om een 5.5 µL totale reactie. Incubeer dit bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten tot het afbinden van de gidsen voor de BsmBI verteerd plasmide.</li>
	<li>De nieuwe ligaturen plasmide uit stap 3.5 omvormen Stbl3 bacteriën en versterken met behulp van een plasmide voorbereiding methode.</li>
</ol>4. lentivirus productie
<ol><li>Graaf 750.000 293T cellen per putje voor een zes-well plaat met behulp van een hemocytometer en zaad ze in DMEM met 10% FBS en 1% pen strep. Een goed gebruik voor elke constructie.</li>
	<li>24 h na het zaaien, media omzetten in verse antibioticum-vrije DMEM met 10% FBS.</li>
	<li>Verdun in een buis, 11 µL van lipide gebaseerde transfectiereagens met 150 µL van het OptiMEM medium, per reactie11.</li>
	<li>Verdun in een aparte buis, 2 µg van de CLOuD9 lentivirale vector plasmide uit stap 3.6, 0.35 µg pMDLg/pRRE, 1 microgram van pRSV-Rev en 0,65 µg pMD2.G met 150 µL van het OptiMEM medium, per reactie11.</li>
	<li>Voor elke reactie, het mengsel van verdunde lentivirale plasmide toevoegen aan de verdunde lipide gebaseerde transfectiereagens op een 1:1-verhouding, en incubeer gedurende 5 min11.</li>
	<li>Het gehele volume van elke gemengde complex uit stap 4.5 in de respectieve putten van de antibiotica-vrij 293T cellen uit stap 4.2 toevoegen.</li>
	<li>48 uur later verzamelen virale productie media door pipetteren in een verse buis en de spin naar beneden bij 300 x g gedurende 5 min. Na het centrifugeren, door het supernatant naar een verse buis te verwijderen van de overblijvende cel puin te verplaatsen.</li>
	<li>Gebruiken van virale productie media onmiddellijk voor de transductie van doelcellen of bevriezen bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.</li>
</ol>5. lentivirus signaaltransductie van cellen
<ol><li>250 µL voor elke virale construct van belang (samengesteld uit complementaire CLOuD9 plasmiden) toevoegen aan een conische tube van 15 mL met 80.000 cellen voor de toepassing van CLOuD9.</li>
	<li>Zodat het totale volume van media in elk kegelvormig tot 1 mL met antibioticum-vrije media, en polybrene toevoegen aan een eindconcentratie van tussen 1-8 µg Mo/mL (de maximale concentratie van polybrene getolereerd door het celtype gebruikt moet experimenteel worden bepaald).</li>
	<li>Spin cellen bij 800 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer door pipetteren zonder het verwijderen van het supernatans dat virale. Verplaats de hele celsuspensie naar een cel cultuur plaat.</li>
	<li>24u na signaaltransductie, cellen van de spin naar beneden bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Gecombineerd virale supernatant en resuspendeer de cellen in regelmatige cel voedingsbodems.</li>
	<li>Op de volgende dag, puromycin (1 µg/mL voor 293T cellen) en hygromycin (25 µg Mo/mL voor 293T cellen) toevoegen aan het kweekmedium cel selecteren voor dubbel getransduceerde cellen. Experimenteel bepalen de juiste concentraties van puromycin en hygromycin voor een bepaald celtype voorafgaand aan het begin van de experimenten.</li>
	<li>Houden van cellen in de selectie media voor ten minste 3 d voordat alle downstream experimenten en gedurende de duur van alle experimenten in selectie media.</li>
</ol>6. cel dimerisatie en Wash uit
<ol><li>Toevoegen van 1 mM Abscisic zuur (ABA) of een gelijkwaardige hoeveelheid dimethylsulfoxide (DMSO) voor besturingselementen aan de cultuur van de cel aan het dimerize van de CLOuD9 geselecteerd en getransduceerde cellen. ABA te gebruiken binnen 6 maanden na de datum van ontvangst, koud houden en beschermen tegen licht in gebruik. 2 mM ABA kan worden gebruikt indien nodig.<ol>
<li>Omzetten in media dagelijks voorzien van verse ABA (of DMSO voor besturingselementen) voor de duur van de experimenten. Opmerking: Geen limiet op de lengte van de dimerisatie nog geconstateerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Omgekeerde dimerisatie door eliminatie van media met ABA en wassen van cellen met genoeg fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) ter dekking van het oppervlak van de plaat twee keer. Daarna cultuur cellen in ABA-vrije media een un-dimerized toestand te handhaven.</li>
</ol>7. Immunoprecipitation en Co-immunoprecipitations
Opmerking: Controleer alle buffers fris en onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik.
<ol><li>Na voltooiing van de dimerisatie experimenten, verzamelen en spin down cellen, dan supernatant gecombineerd.</li>
	<li>Dwarslijn en bevriezing van cellen<ol>
<li>Maak een verse voorraad van 1% formaldehyde in PBS bij kamertemperatuur met verse materialen. Voor elke 2 miljoen cellen, zachtjes resuspendeer met 1 mL van de 1% formaldehyde bij kamertemperatuur gedurende precies 10 minuten, terwijl het draaien. Opmerking: Gebruik een minimumgrootte voor het volume van 10 mL voor crosslinking minder dan 10 miljoen cellen.</li>
		<li>Doven crosslinking met de toevoeging van glycine aan een eindconcentratie van 0,125 M, gevolgd door incubatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, terwijl het draaien.</li>
		<li>Spin down cellen en wassen van 1-2 x met ijskoude PBS. Cel pellets kunnen module in vloeibare stikstof bevroren en opgeslagen bij-80 ° C of onmiddellijk gebruikt worden. Opmerking: De warmte zal formaldehyde crosslinks omkeren. Als het stormde, kunnen cellen rechtstreeks worden opgeslagen in-80 ° C zonder de module bevriezen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiden van geconjugeerde antilichaam/kraal Opmerking: Optimaliseren voorwaarden voor gekozen antilichaam (dat wil zeggen, het testen van verschillende lysis buffers voor lysis van de cel en het uitvoeren van IP) wellicht de moeite waard. Twee gemeenschappelijke buffers, Farnham lysis-buffermengsel en bewerkt RIPA buffer, kunnen een significant effect op het rendement van de IP- en ultrasoonapparaat rendement hebben. Alle composities van de buffer kunnen worden gevonden in de Tabel van materialen. Bovendien, houd er rekening mee dat chromatine ultrasoonapparaat kan enkele uren duren.<ol>
<li>Resuspendeer kralen door vortexing kort al naargelang het gekozen antilichaam.</li>
		<li>Een passend bedrag van kralen voor het experiment overbrengen in een 1,5 mL-buis. Als uitgangspunt, 20 µL van parels voor elke 1 µg van antilichaam te gebruiken. Voeg nog geen antilichamen. Opmerking: Gebruik 10 µg antilichaam met 200 µL van parels voor 1 mg totaal lysate als uitgangspunt, tenzij het is bekend dat het antilichaam meer of minder efficiënt dan dat zou kunnen inhouden. Voor lage overvloed eiwitten, kan deze verhouding moeten worden aangepast.</li>
		<li>Als gebruikt Farnham lysis-buffermengsel, wassen 3 x in IP-verdunning buffer. Als met behulp van RIPA lysis-buffermengsel, wassen 3 x in RIPA lysis-buffermengsel.</li>
		<li>Resuspendeer kralen in een eindvolume van de dezelfde buffer uit stap 7.3.3 (IP-verdunning of RIPA buffer) thats > 1 x en < 5 x het oorspronkelijke volume. dat wil zeggen Gebruik voor 100 µL eerste kraal volume, tussen 100 en 500 µL definitieve resuspensie volume.</li>
		<li>Antilichaam aan gewassen kralen nu met een geschikte concentratie toevoegen. Voor een goede HA of vlag antilichaam aan IP-CLOuD9 constructies, gebruik van antilichamen op 1:50 (µg eiwit: µg eiwit lysate) en incubeer tussen 8 + h en 's nachts bij 4 ° C, terwijl het draaien. Als alternatief, Incubeer gedurende 2-4 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Verwijder het supernatant van kralen en negeren.</li>
		<li>Wash kralen 3 x met de Wash-buffer.</li>
		<li>Resuspendeer in een minimale omvang van de buffer gebruikt voor overnachting incubatie met de antilichamen (IP-verdunning of RIPA buffer). Houden koude tot gecombineerd met eiwit lysate.</li>
	</ol></li>
	<li>Bewerk de chromatine ultrasone trillingen ten<ol>
<li>Eerst lyse cellen met de toevoeging van zwelling buffer cel pellets op ijs voor 10 min, flicking cellen elke paar minuten om te voorkomen dat regelen. Opmerking: In het algemeen, 500 µL van de zwelling van de buffer is toegevoegd aan 25 miljoen cellen en vanuit daar geschaald, maar doen niet gebruik minder dan 500 µL buffer voor < 25 miljoen cellen.</li>
		<li>Dounce handmatig zowel rechtsom en linksom, 13 x elk.</li>
		<li>Kernen van de spin naar beneden bij 4 ° C gedurende 5 minuten bij de 1.500 x g. gecombineerd het supernatant volledig en herhaal dit om te resterende bovendrijvende vloeistof verwijderen, dan wegen de cel pellet in mg.</li>
		<li>Proteaseinhibitor toevoegen aan kernen lysis-buffermengsel (Farnham buffer of RIPA buffer, hierboven, kies een).</li>
		<li>10 x bedrag van kernen lysis-buffermengsel aan Ingehuld kernen aan resuspendeer toevoegen (bijvoorbeeld het toevoegen van 1 mL lysisbuffermengsel kernen aan een pellet 0.100 g). Kort vortex en lyse voor 10 min op ijs. Opmerking: Houd in mening de grootte van de buis ultrasoonapparaat. Ideaal volume is vaak < 1 mL, dus monsters worden verdeeld moeten mogelijk als pellets zeer groot zijn.<ol>
<li>Voor Co-IP, bewerk ultrasone trillingen ten kernen kort te solubilize materiaal quench SDS naar een peil waarop algemene immunoprecipitation met 2-3 volumes van verdunning buffer, dan gaat u verder met stap 7.4.6. Voor zeer gevoelige antilichamen, voegt u meer verdunning buffer om verdere verlaging van de concentratie van SDS. Opmerking: Stop ultrasoonapparaat als lysate wist; het zal veranderen van een dekkend/transparant wit naar volledig transparant. Houd de monsters zo koud mogelijk en doen niet over Bewerk ultrasone trillingen ten.</li>
			<li>Voor ChIP, grondig Bewerk ultrasone trillingen ten DNA om te verkrijgen 150-1000 bp DNA-fragmenten, dan gaat u verder met stap 7.4.6.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Spin uit onoplosbare materiaal op maximale snelheid gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Oplosbaar materiaal overbrengen in een verse buis.</li>
		<li>Voor Co-IP, meten van de concentratie van eiwit en overgaan tot de pulldown in stap 7.5.</li>
		<li>Voor ChIP, het verwijderen van een hoeveelheid van 10 µL lysate gewist en voeg 40 µL IP-elutie buffer en 6 µL 5 M NaCl aan dat voor een totaal van 56ul. Kook gedurende 15 minuten staan bij 95 ° C, voeg 5-10 µL van 3 M NaOAc pH 5 en schoon te maken op een PCR zuivering kolom. Meten van de concentratie van DNA door het meten van de absorptie bij 260 nm en in alle monsters standaardiseren. Dan overgaan tot pulldown in stap 7.5. Opmerking: Extra lysate kan worden module bevroren bij-80 ° C en gebruikt op een later tijdstip, maar de beste resultaten worden verkregen van de fresh lysate. Als bevriezing, doen geen vorst/dooi lysate meer dan eens.</li>
	</ol></li>
	<li>Keuzelijst<ol>
<li>Een geschikte hoeveelheid van een eiwit lysate overbrengen in een verse buis. Als gebruikt Farnham lysis-buffermengsel, Verdun in 2.1 volumes van IP-verdunning buffer (boven).</li>
		<li>100 µL van supernatans voor invoercontrole gereserveerd en bewaren bij 4 ° C tot de volgende dag.</li>
		<li>Voeg parel/antilichaam conjugaat nu vanaf stap 7.3.8 aan monsters.</li>
		<li>Monsters bij 4 ° C's nachts draaien en zorgen er genoeg volume voor vloeibare beweging in 1,5 mL tubes.</li>
	</ol></li>
	<li>Wassen en elueer<ol>
<li>Na overnachting rotatie, sla het supernatant als het niet-bindende deel. Vervolgens kralen wassen 3-5 x in IP-verdunning buffer.</li>
		<li>IP-elutie buffer bij kamertemperatuur, zonder remmers te bereiden.</li>
		<li>Elueer complexen met 50 µL elutie buffer geschud op een draaikolk bij 67 ° C gedurende 15 min. overdracht elutie tot een nieuwe koker en herhaal met nog eens 50 µL. Combineer ze allebei voor een totale 100 µL elutie. Opmerking: Als er te veel achtergrond van deze procedure elutie, warmte kan worden verminderd of geëlimineerd tijdens het schudden/incubatie. Dit in het algemeen vermindert het rendement van de doelstelling eiwit maar leiden tot aanzienlijke afname van de achtergrond.</li>
	</ol></li>
	<li>Omkeren van crosslinks door verwarming bij 67 ° C gedurende > 4 h. Opmerking: Dit is niet strikt noodzakelijk zijn voor mede IPs maar nuttig kan zijn.<ol>
<li>Voor Co-IP, om ervoor te zorgen volledige dimerisatie tussen de doelstellingen van belang, voer eluaten op een SDS-pagina gel en sonde met antistoffen tegen de HA tag of tag van de vlag, zoals aangegeven, allemaal op 1: 1.000. Ga verder met stap 8.</li>
		<li>ChIP-qPCR, om ervoor te zorgen correct lokalisatie en doelgerichtheid van elk onderdeel van de CRISPR-dCas9, schoon elutie product op een kolom en elueer in 10 µL. uitvoeren real-time kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) van gezuiverde DNA. Inleidingen gebruikt in de gepresenteerde gegevens zijn beschikbaar in de aanvullende tabel 1. Ga verder met stap 8.</li>
	</ol></li>
</ol>8. RNA extractie en kwantitatieve PCR
<ol><li>Om te onderzoeken de CLOuD9-geïnduceerde veranderingen in genexpressie, eerst isoleren en zuiveren van totaal RNA van zowel controle cel korrels en pellets, dimerized cel.</li>
	<li>Maken van cDNA (cDNA) uit de gezuiverde RNA door omgekeerde transcriptie17 en qPCR-analyses uitvoeren. De inleidingen zijn beschikbaar in de aanvullende tabel 1.</li>
</ol>9. chromosoom conformatie Capture Assay
<ol><li>Testen8observeren van veranderingen in de frequentie van genomic loci contacten geïnduceerd door CLOuD9, uitvoeren van chromosoom conformatie vastleggen (3C).</li>
	<li>3C afbinding producten in twee sets van dubbele waarden voor elk van de drie biologische wordt gerepliceerd door kwantitatieve PCR in real time te kwantificeren. Normaliseren monsters naar de 3C-signalen van de locus tubuline. De inleidingen zijn beschikbaar in de aanvullende tabel 1.</li>
</ol>

<ol><li>Krivega, I., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+looping+as+a+target+for+altering+erythroid+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).</li>
<li>Matharu, N., Ahituv, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+loops+in+major+folds%3A+Enhancer-promoter+looping%2C+chromatin+restructuring%2C+and+their+association+with+transcriptional+regulation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease.</a> PLoS Genet. 11, e1005640(2015).</li>
<li>Dekker, J., Martí-Renom, M. A., Mirny, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+three-dimensional+organization+of+genomes%3A+interpreting+chromatin+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data.</a> Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).</li>
<li>Kim, A., Dean, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22610406">Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription.</a> Mol Cells. 34, 1-5 (2012).</li>
<li>Petrascheck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+looping+induced+by+a+transcriptional+enhancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).</li>
<li>Ameres, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+DNA-loop+formation+blocks+transcriptional+activation+by+an+SV40+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer.</a> EMBO J. 24, 358-367 (2005).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Long-Range+Genomic+Interactions+at+a+Native+Locus+by+Targeted+Tethering+of+a+Looping+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor.</a> Cell. 149, 1233-1244 (2012).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+developmentally+silenced+globin+genes+by+forced+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping.</a> Cell. 158, 849-860 (2014).</li>
<li>Morgan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+Nuclear+Architecture+through+CRISPR-Mediated+Chromosomal+Looping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping.</a> Nature Communications. 8, 13 July (2017).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17 (1), 148(2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Lipofectamine+2000+Reagent%22">Lipofectamine 2000 Reagent</a>. , Invitrogen by Life Technologies. (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22DNeasy+Blood+%26+Tissue+Kit+Handbook%22">DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook</a>. , QIAGEN. (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Determining+Genome+Targeting+Efficiency+using+T7+Endonuclase+I+%28M0302%29%22">Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302)</a>. , New England BioLabs. (2016).</li>
<li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).</li>
<li>Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. , 83-87 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNeasy+Mini+Handbook%22">RNeasy Mini Handbook</a>. , QIAGEN. (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+VILO+cDNA+Synthesis+Product+Information+Sheet%22">SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet</a>. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2015).</li>
<li>Theunissen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+culture+conditions+for+induction+and+maintenance+of+naive+human+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).</li>
<li>Mokry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genome-wide+analysis+of+transcription+factor+occupancy%2C+RNA+polymerase+II+binding+and+steady+state+RNA+levels+identify+differentially+regulated+functional+gene+classes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes.</a> Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).</li>
<li>Drier, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oncogenic+MYB+feedback+loop+drives+alternate+cell+fates+in+adenoid+cystic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma.</a> Nat Genet. 48, 265-272 (2016).</li>
<li>Ryan, R. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+enhancer-associated+rearrangements+reveals+mechanisms+of+oncogene+dysregulation+in+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma.</a> Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).</li>
<li>Montavon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+archipelago+controls+Hox+genes+transcription+in+digits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits.</a> Cell. 147, 1132-1145 (2011).</li>
<li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

The most kritische stappen in CLOuD9 chromatine looping zijn: 1) ontwerpen of met behulp van de juiste gRNAs, 2) veranderende media dagelijks op CLOuD9-getransduceerde cellen, met inbegrip van ABA of DMSO, 3) behoud van versheid van ABA, en 4) het uitvoeren van nauwkeurige en zorgvuldige beoordeling van chromatine bevleesdheid.
De grenzen van CLOuD9 bevinden zich voornamelijk in de mogelijkheid om het ontwerp van de gidsen voor de doel-regio van keuze. Gids RNAs de belangrijke taak van het lokaliseren van de componenten van de dCas9 tot doel DNA regio's worden dimerized en de werkzaamheid van de gidsen zijn gebaseerd op hun specifieke doelsite. Zonder de juiste gRNA componenten geïnduceerde het systeem zal niet zitten kundig voor vormen omkeerbaar CLOuD9 lussen. Dus, door het ontwerpen van meerdere hulplijnen voor elk gebied van belang en de gidsen verspreiden over een gebied van 250-1000 bp, ten minste één succesvolle gids zal worden gezorgd. Gids locatie is ook integraal aan nauwkeurige resultaten. Het is belangrijk om te voorkomen dat gidsen gelegen in transcriptie factor bandplaatsen of andere kritieke gebieden om te voorkomen dat de effecten van de achtergrond zoals omhoog of omlaag regulering van de transcriptie. Bovendien kan de precieze locatie van de CLOuD9 constructie iets invloed transcriptie van het target-gen. Dit benadrukt het belang van het testen van meerdere paren van gidsen voor elk doel gebied, voor het identificeren van de meest robuuste paar voor experimentele doeleinden. Verder, in elk paar van doelregio's, de CSA constructie moet worden gericht met gRNAs voor S. aureus, en de constructie van de CSP moet worden gericht met gRNAs voor S. pyogenes voor het targeten van specificiteit.
Om ervoor te zorgen nauwkeurige resultaten en juiste dimerisatie, is het ook belangrijk om de versheid van de cellulaire omgevingen na de transductie van de CLOuD9 constructies. Dagelijkse media wijzigen en de toevoeging van verse dimerizer (of besturingselement) zorgt ervoor dat de aanvullende constructies zal in de nabijheid blijven en behouden van de gewijzigde chromatine bevleesdheid. Bovendien is van essentieel belang voor het verkrijgen van authentieke resultaten garanderen de ABA is vers en op de juiste wijze is opgeslagen volgens de fabrikant protocol (geopend binnen 6 maanden, koud, beschermd tegen het licht gehouden).
Met name werd de ABA dimerizer voor CLOuD9 gebruikt met de ABI en PYL dimerisatie eiwitten, in plaats van de meer algemeen gebruikt FRB en FKBP systeem. De noodzaak van een rapalog voor het FRB/FKBP systeem zou hebben beperkt de toepasselijkheid van CLOuD9, als gevolg van de toxiciteit voor kankercellen. Het alternatieve systeem van de ABI/PYL omzeild deze beperking, effectief inschakelen van CLOuD9 als meer in het algemeen benutbare.
Gezamenlijk hebben we CLOuD9, een unieke en robuuste technologie die kan onder dwang, maar omkeerbaar maakt als volgt contactpersonen tussen luchtverontreiniging over lange afstand doel genomic loci ontwikkeld. Via inducerende chromatine lussen, we laten ook zien dat CLOuD9 kan worden gebruikt om wijzigen genexpressie in de juiste context van de cellulaire. Het aanpassingsvermogen van de technologie zorgt voor de onbeperkte studie van de interactie tussen elke twee genomic loci, zonder voorafgaande kennis van de regio's in een lus of mechanismen in een lus. Bovendien kan CLOuD9 van unieke aantoonbare omkeerbaarheid verder onderzoek van de looping mechanismen in ziekte en ontwikkeling. Terwijl de gevolgen van de op-target van chromatine looping zijn duidelijk aangetoond, moet er nog worden gegevens bieden inzicht in de effecten van uit-target in een lus en de latere effecten op de lussen op de doelsoort.
Onze gegevens ziet u slechts een paar toepassingen van dit instrument, maar impliceert het belangrijke onderliggende idee dat chromatine regeling is een indicatie van de genexpressie. Onze technologie kan worden gebruikt om te studeren en onthullen de nuances van de structuur van de chromatine in genregulatie, waardoor het algemene begrip van de rol van de chromatine vouwen in de transcriptie van genen. Een beter begrip van de subtiliteiten van transcriptionele dynamiek kan het voortouw nemen in onderzoek en behandeling van kanker, erfelijke ziekten en aangeboren aandoeningen, in welke verschillende chromatine Vergadering ongetwijfeld gen expressie20verandert, 21,22,23. Latere werk met behulp van de CLOuD9 technologie zal verlichten verdere details over de regeling en de dynamiek van de chromatine domeinen en hoe ze rijden vouwen om stabiele genexpressie in zowel de ontwikkeling als de ziekte.

De relatie tussen chromatine vouwen in de kern en de specifieke organisatie van het genoom oogstte significant belang in de afgelopen jaren, zoals is gebleken te zijn nauw samen met gene expression1,2. Hoewel de precieze relatie tussen gene activiteit en modulatie van de structuur van de chromatine onduidelijk blijft, het heeft zijn veronderstelde dat de interacties tussen chromosomale contacten als gevolg van dynamische driedimensionale chromatine organisatie dienen een Gene regulerende functie3. Inderdaad, dergelijk effect is ook aangetoond bij de menselijke globine gen locus, waar de locus controle regio (LCR) de activiteit van het globine-genen in een ontwikkelingsachterstand specifieke wijze regelt door het creëren van een lus van de chromatine tussen de twee regio's4. In zowel deze en andere regio's is het echter onduidelijk of chromatine looping is een oorzaak of gevolgen van wijzigingen in genexpressie.
Tot nu toe bleef de uitdagingen bij het bestuderen van dit verschijnsel niet opgelost. Bijvoorbeeld, betrokken andere pogingen tot inducerende chromatine lussen wijzigen de lineaire opeenvolging van DNA of ingewikkelde procedures vereisen een overvloed aan achtergrondkennis op specifieke elementen die looping5,6vergemakkelijken, 7,8. Bovendien, terwijl eerdere werk heeft gesuggereerd dat chromatine lussen station genexpressie in een specifieke en beperkte context7,is8, het niveau op welke chromatine transcriptie wereldwijd in een lus raakt onzeker. Al belangstelling voor de gevolgen van luchtverontreiniging over lange afstand in een lus op genexpressie is gegroeid in de afgelopen jaren voortdurend, blijven er onbeantwoorde vragen over de vaststelling van en het behoud van de chromatine contacten ga gene activiteit bestaan.
De technologie die we hebben ontworpen maakt gebruik van de nuclease gebrekkig geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) - CRISPR - geassocieerde proteïne 9 (dCas9), te voorzien in breed toepasbare gerichte elke genomic loci9. Deze technologie elimineert de complexe kwesties in verband met wijzigingen van de lineaire opeenvolging van DNA en is toegankelijk zonder significante voorkennis van bepaalde onderdelen van de oneindige lus terecht. De tool is het meest opvallend, universele en breed toepasbare chromatine lussen herkend in ontwikkeling zo goed zoals in een verscheidenheid van ziekten, zoals kanker. De kracht van CLOuD9 wordt aangetoond door een omkeerbaar wijziging van de structuur van de lussen aan effectief moduleren genexpressie.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp; media</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>Voor K562 celcultuur</td></tr><tr><td>DMEM media</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1X, voor 293T celcultuur</td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>Addgene plasmid</td><td>#52961</td><td>Voor CLOuD9 plasmide ontwikkeling</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12253</td><td>Voor lentivirus productie</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12259</td><td>Voor lentivirus productie</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12251</td><td>Voor lentivirus productie</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668-019</td><td>Voor lentivirus productie</td></tr><tr><td>anti-HA antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>3724</td><td>Voor immunoprecipitatie</td></tr><tr><td>anti-Flag antilichaam</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>Voor immunoprecipitatie</td></tr><tr><td>DNeasy Blood and Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Voor DNA extractie</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td>Voor RNA extractie</td></tr><tr><td>RNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Voor RNA extractie</td></tr><tr><td>Superscript VILO</td><td>Life Technologies</td><td>11754-050</td><td>Voor cDNA&nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR Green I MasterMix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>Voor qPCR analyse</td></tr><tr><td>Light Cycler 480II</td><td>Roche</td><td></td><td>Voor qPCR analyse</td></tr><tr><td>anti-H3K4me3 antilichaam</td><td>AbCam</td><td>ab8580</td><td>Voor ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>anti-RNA Pol-II antilichaam</td><td>Active Motif</td><td>61083</td><td>Voor ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>EDTA vrije protease inhibitor</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Voor eiwitextractie</td></tr><tr><td>4-12% Tris Glycine gel</td><td>Biorad</td><td></td><td>Elke grootte, voor western blot</td></tr><tr><td>anti-Rabbit HRP antilichaam</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2030</td><td>Voor western blot</td></tr><tr><td>anti-muis HRP antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>7076S</td><td>Voor western blot</td></tr><tr><td>K562 en H3K293 ChIP-Seq data</td><td>Encode</td><td>ENCSR000AKU</td><td>Voor ChIP-seq analyse</td></tr><tr><td>K562 en H3K293 ChIP-Seq data</td><td>Encode</td><td>ENCSR000APE</td><td>Voor ChIP-seq analyse</td></tr><tr><td>K562 en H3K293 ChIP-Seq data</td><td>Encode</td><td>ENCSR000FCJ</td><td>Voor ChIP-seq analyse</td></tr><tr><td>K562 en H3K293 ChIP-Seq data</td><td>GEO</td><td>GSM1479215</td><td>Voor ChIP-seq analyse</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A voor Immunoprecipitatie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>Voor immunoprecipitatie</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G voor Immunoprecipitatie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10004D</td><td>Voor immunoprecipitatie</td></tr><tr><td>RNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>Voor RNA zuivering</td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldehyde Methanol-vrij</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Voor crosslinking</td></tr><tr><td>PX458 Plasmid</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>Aanbevolen actieve Cas9 plasmide voor gRNA klonen, maar elk actief Cas9 plasmide kan</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Zuivering Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Voor PCR zuivering</td></tr><tr><td>FastDigest BsmBI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0454</td><td>Voor het klonen van geleide RNA's</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EF0651</td><td>Voor het klonen van geleide RNA's</td></tr><tr><td>10X FastDigest Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B64</td><td>Voor het klonen van geleide RNA's</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extractie Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Voor het klonen van geleide RNA's</td></tr><tr><td>10X T4 Ligation Buffer</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>Voor het klonen van geleide RNA's</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>Voor het klonen van geleide RNA's</td></tr><tr><td>2X Quick Ligase Buffer</td><td>NEB</td><td>B2200S</td><td>Voor het klonen van geleide RNA's</td></tr><tr><td>Quick Ligase</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td>Voor het klonen van geleide RNA's</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Farnham lysis buffer</td><td></td><td></td><td>1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water oplossing (niet-EDTA), en 1 mM EDTA in water</td></tr><tr><td>Gewijzigde RIPA buffer</td><td></td><td></td><td>1% NP40/Igepal, 0.5% natrium deoxycholaat, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, en 1% protease inhibitor water oplossing (niet-EDTA) in PBS pH 7.8 of 7.4</td></tr><tr><td>IP verdunningsbuffer</td><td></td><td></td><td>0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor</td></tr><tr><td>Wasbuffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, en 1% natrium deoxycholaat</td></tr><tr><td>Zwellingsbuffer</td><td></td><td></td><td>0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM kaliumacetaat, 15 mM magnesiumacetaat, 1% NP-40</td></tr><tr><td>Verdunningsbuffer</td><td></td><td></td><td>0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 en 167 mM NaCl</td></tr><tr><td>IP elutie buffer</td><td></td><td></td><td>1% SDS, 10% NaHCO3 &nbsp;</td></tr></tbody></table>

crispr-gemedieerde reorganisatie van chromatine lusstructuur

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recente studies hebben duidelijk aangetoond dat luchtverontreiniging over lange afstand, driedimensionale chromatine interacties spelen een belangrijke rol in de regulatie van genexpressie, maar of in een lus is verantwoordelijk voor of een gevolg van wijzigingen in genexpressie nog steeds is in een lus onbekend. Tot voor kort, is chromatine looping invloed van de verordening van gene activiteit en cellulaire functie relatief dubbelzinnig, en beperkingen in de bestaande methoden voor het manipuleren van deze structuren voorkomen diepgaande verkenning van deze interacties. U kunt oplossen door deze onzekerheid, we een methode voor selectief en omkeerbare chromatine lus opnieuw organisatie ontworpen met behulp van CRISPR-dCas9 (CLOuD9). De dynamiek van het systeem van CLOuD9 is aangetoond door de succesvolle lokalisatie van CLOuD9 constructies te richten genomic loci te moduleren lokale chromatine conformatie. De mogelijkheid om te keren van de geïnduceerde contactpersoon en herstellen van de endogene chromatine conformatie is bovenal ook bevestigd. Modulatie van genexpressie met deze methode stelt de capaciteit te regelen van cellulaire genexpressie en onderstreept de grote mogelijkheden voor toepassingen van deze technologie bij het creëren van stabiele DOVO chromatine loops die sterk van invloed zijn op gene expressie in de context van kanker en ontwikkeling.

Chromatine looping speelt een belangrijke rol in genregulatie; Nochtans, zijn er geen technologische vooruitgang, die het mogelijk voor selectieve en omkeerbare wijziging van chromatine loops maken. Hier beschrijven we een krachtig systeem voor chromatine lus opnieuw organisatie met behulp van CRISPR-dCas9 (CLOuD9), aangetoond dat zij selectief en omkeerbaar moduleren genexpressie bij gerichte loci.

CRISPR-gemedieerde reorganisatie van chromatine lusstructuur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Deze methode kan ons helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot genexpressie die ons precies laten zien hoe chromatinestructuur de genexpressie beïnvloedt en hoe chromatineorganisatie de transcriptiedynamiek reguleert. We ontwikkelden deze technologie omdat we de chromosomale architectuur konden kunnen beheersen om het creëren van chromatineloop over lange afstand mogelijk te maken. Terwijl op hetzelfde moment hebben de mogelijkheid om de chromatine context om te keren om de endogene chromosomale structuur te herstellen.Deze methode is ontworpen voor gebruiksgemak en brede toepasbaarheid. We maakten gebruik van een niet-toxische dimerizer en orthogonale soorten dcas9 om het systeem breder te kunnen gebruiken. We ontwikkelden deze methode omdat we de al lang bestaande kip-en-het-ei-vraag wilden kunnen beantwoorden of genexpressie chromosomale architectuur krijgt of dat chromosoomstructuur leidt tot veranderingen in genexpressie.Het ontwerp van de CRISPR-gids RNA sequenties en het onderhoud van de celculturen worden beschreven in het tekstprotocol. Plasmid kaarten en de primers gebruikt zijn er vermeld in. Begin met het plasmidepreparaat door vijf microgram van het lentivirale CRISPR-plaskaan te mengen met drie microliter van BsmB1 drie microliters alkalisch fosfor zes microliter van 10x spijsverteringsbuffer en 0,6 microliter vers bereide 100 millimolar DTT.Breng het totale volume op 60 microliter dubbel gedestilleerd water en broed het mengsel gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius om het plasmid te verteren en te de-fosforyleren. Vervolgens, gel zuiveren de verteerd plasmid in de lus plasmid en dubbel gedestilleerd water. Bereid vervolgens annealing reacties voor de gids RNA paren.Combineer een microliter van elke gids RNA op 100 micromolar met een microliter van 10x T4 ligatie buffer 6,5 microliter van dubbel gedestilleerd water en 0,5 microliter T4 PNK voor een totaal reactievolume van 10 microliters. Om de geleide RNA-paren aan hun doelsequenties te laten uitbroeden de mengsels bij 37 graden Celsius op 30 minuten, gevolgd door een incubatie bij 95 graden Celsius gedurende 5 minuten en vervolgens geleidelijk de temperatuur verlagen tot 25 graden celsius door het met vijf graden celsius per minuut te verlagen. Verdun vervolgens de geannealed gids RNAs op een tot tweehonderd in dubbel gedestilleerd water.Nu, bereid de twee ligatie reacties voor. Meng een microliter van de verteerde plasmid met 0,5 microliter van een verdunde perivaneale geleider RNAse 2,5 microliter 2,5 microliter 2x ligatiebuffer een microliter dubbel gedestilleerd water en 0,5 microliter ligase. Incubeer de reacties bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om de geleiders BsmB1 verteerd plasmid te binden.Zet vervolgens de nieuw ligated plasmide om in stabiele drie bacteriën en versterk de bacteriën met behulp van een plasmide bereidingsmethode. Op een zes-put plaat, per goed, zaad 750, 000 2n3 Tcells in DMEM met 10%FBS en 1%pen strep. Gebruik een put voor elke constructie en incubeer de cellen voor 24 uur.De volgende dag, verander het medium naar verse antibioticum free-DMEM met 10%FBS. Direct na het veranderen van het medium voor elke put van vergulde cellen bereiden een buis van Lentivirus productie mengsel. Verdun per reactie 11 microliter lipidentransfectiereage met 150 microliter van het Opti-MEM-medium voor elke reactie.Dan in aparte buizen bereiden het DNA. Combineer twee microgrammen van de CLOud9 lentivirale vector plasmid met twee microgrammen van de andere lentivirale verpakkingscomponenten. Verdun dit mengsel in 150 microliter van het Opti-MEM medium.Combineer vervolgens gelijke volumes van het verdunde linzenplasmidmengsel in het verdunde transfectionreagemiddel op basis van lipide en broed de mengsels gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur uit. Voeg vervolgens aan elke put van cellen een buis van de bereide mengsels toe en zet de incubatie voort. 48 uur later, breng de virale productiemedia van de plaat putten in kegels en draai ze naar beneden op 300 g gedurende vijf minuten.Breng vervolgens de supernatant over op verse buizen om het gepelde puin weg te gooien. Gebruik nu onmiddellijk de virale productiemedia om de doelcellen te transduceren of te bevriezen bij 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Begin met het toevoegen van 250 microliter van elke virale constructie van belang, die in dit geval bestaat uit complementaire CLOud9 plasmiden aan een 50 milliliter conische buis met 80.000 cellen.Voeg vervolgens genoeg Polybrene toe, zodat het tussen de één en acht microgram per milliliter in oplossing is. Pas vervolgens het totale volume in elke buis aan op één milliliter met behulp van antibioticavrije media. Nu om het contact tussen de virusdeeltjes en de cellen te verhogen, draaien de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op 800 g.Dan opnieuw op te schorten de cellen op de supernatant door pipetten. Laad vervolgens de suspensie van de cellen op kweekplaten en kweek ze gedurende 24 uur. De volgende dag, het verzamelen van de cellen.Centrifugeren ze op 300 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en opnieuw op te schorten in normaal medium. De volgende dag, voeg puromycine en hygromycine aan het medium om te selecteren voor dubbel getransduceerde cellen. De juiste concentratie antibioticum moet vooraf voor elk celtype worden bepaald.Vervolgens ontcunken de cellen in de selectiemedia gedurende ten minste drie dagen voordat u verdergaat met downstreamtoepassingen en de cellen en selectiemedia blijft onderhouden. Om de cloud9 geselecteerde en getransduceerde cellen te verdrijzen voeg een millimolar ABA aan de cultuur schotel. Voeg voor besturingselementen DMSO toe en onderhoud de cellen met ABA of DMSO voor de duur van het experiment.Om de dimerisatie te keren, was de cellen met voldoende PBS om het oppervlak van de plaat twee keer te bedekken. Daarna, cultuurcellen in ABA-vrije media om ze te onderhouden in een ongedimeriseerde staat. Een adequaat gebruik van het CLOud9-systeem veroorzaakt omkeerbaar contact van de complementaire CSA- en CSP CLOud9-constructies door de toevoeging of verwijdering van ABA naar celkweekmedia.De CSA- en CSP-constructies zijn gelokaliseerd op geschikte genomische regio's met behulp van standaard CRISPR-gids RNAse. Chromatine immunoprecipitatie gevolgd door kwantitatieve PCR werd gebruikt om de nauwkeurige lokalisatie in targeting van elke CLOud9 component te waarborgen. Bovendien co-immuuneropreceptatie met en zonder ABA geverifieerde CSA en CSP dimerization in aanwezigheid van de ligand evenals de omkeerbaarheid in de afwezigheid van de ligand.Na ABA dimerization werd meer contact tussen bèta-globine en de LCR gemeten door chromosoombevestiging. Dit werd echter niet waargenomen in de controles die alleen de CSA of alleen de CSP-constructie bevatten. Het maken van de LCR beta-globine interactie niet volledig elimineren van de endogene LCR globin contact.Het alleen toegevoegd aan de oorspronkelijke contactpersoon. De toename van bèta-globine LCR contacten werden waargenomen door middel van 72 uur van dimerization, ongeacht de exacte regio binnen de beoogde LCR of de beta-globin promotor regio. Ten slotte werd de omkeerbaarheid van het systeem bevestigd met chromosoombevestiging na het verwijderen van ABA.Dit resulteerde in de volledige vernieuwing van de endogene bevestiging. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om media te veranderen en voeg verse dimerized CLOud9 getransduceerde cellen elke dag. Vergeet niet dat het werken met lentivirus zeer gevaarlijk kan zijn en alle voorzorgsmaatregelen die worden gebruikt bij BSL 2 moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.

crispr-mediated-reorganization-of-chromatin-loop-structure

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Chromatine Interactie Analyse door Gekoppeld-End Tag Sequencing (Chia-PET) is een methode...

Chromatine Interactie Analyse met gepaarde-End Tag Sequencing (Chia-PET) voor het in kaart brengen van chromatine Interacties en begrijpen Transcriptie Verordening

Verordening van de chromatine-milieu is een essentieel proces nodig is voor goede genexpressie. Hier beschrijven we een methode voor het beheersen van de genexpressie door de aanwerving van chromatine-aanpassen machines gen-specifieke en omkeerbare wijze.

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome's in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

Deze methode is ontworpen om de vorming van PRC2-gemedieerde chromatine-domeinen in cellijnen te volgen, en de methode kan worden aangepast aan vele andere systemen.

Een methode om de Novo vorming van Chromatin domeinen te bestuderen

Het genoom is georganiseerd in de nucleaire ruimte in verschillende structuren die kunnen worden onthuld door middel van chromosoom conformatie capture technologieën. De hi-c-methode in de kern biedt een genoombrede verzameling chromatine-interacties in Drosophila-cellijnen, die contactkaarten genereert die kunnen worden verkend met megabaseresolutie op beperkingsfragmentniveau.

Hi-C in nucleus in drosophilacellen

DNA-gordijn, een high-throughput single-molecule beeldvormingstechniek, biedt een platform voor real-time visualisatie van diverse eiwit-DNA-interacties. Het huidige protocol maakt gebruik van de DNA-gordijntechniek om de biologische rol en het moleculaire mechanisme van Abo1 te onderzoeken, een Schizosaccharomyces pombe bromodomein-bevattend AAA+ ATPase.

Het ontcijferen van moleculair mechanisme van histonassemblage door DNA-gordijntechniek

Het protocol beschrijft methoden voor geclusterde, regelmatig tussenliggende korte palindromale herhalingen (CRISPR)-gebaseerde epigenoombewerking in menselijke cellijnen met behulp van plasmide-DNA-transfectie en mRNA-nucleofectie.

CRISPR-epigenoombewerking in menselijke cellen met behulp van plasmide-DNA-transfectie en mRNA-nucleofectieafgifte

Sequentiële zout winning van chromatine gebonden eiwitten is een nuttig instrument voor het bepalen van de bindende eigenschappen van grote eiwitcomplexen. Deze methode kan worden gebruikt om te evalueren van de rol van individuele subeenheden of domeinen in de algehele affiniteit van een eiwit complex om te bulk chromatine.

Sequentiële zout extracties uit te voeren voor de analyse van Bulk chromatine bindende eigenschappen van chromatine complexen wijzigen

DNA-eiwit interacties zijn essentieel voor meerdere biologische processen. Tijdens de evaluatie van cellulaire functies is de analyse van DNA-eiwitinteracties onontbeerlijk voor het begrijpen van genregulering. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) is een krachtig instrument om dergelijke interacties in vivo te analyseren .

Analyse van de c-KIT Ligand Promoter Gebruik van Chromatine Immunoprecipitatie

Dit werk beschrijft een protocol voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van een volwassen T-cellijn van de muis. Dit protocol is geschikt om de verdeling van specifieke histonenmerken op specifieke promotor sites of genoombreed te onderzoeken.

Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP) in Muis T-cellijnen

Leer de CLOuD9-methode voor chromatine-lusreorganisatie met CRISPR-dCas9 om genexpressie selectief en reversibel te moduleren. Deze techniek helpt onderzoekers de relatie tussen chromatinestructuur en transcriptiedynamiek te begrijpen.

CRISPR-gemedieerde reorganisatie van chromatine lusstructuur

Meer video's verkennen