Name: Diepe dermale injectie als de een Model van Candida albicans infectie van de huid voor histologisch Analyses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer een diepe dermale injectiemethode met Candida albicans voor histologische analyse van huidinfecties. Deze techniek behoudt de huidarchitectuur en maakt lokalisatie van immuuncellen en pathogeenverdeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

FG wordt ondersteund door de Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Cariplo Foundation (Grant 2014-0655) en Fondazione Regionale per la Ricerca Henelit (FRRB). IZ wordt ondersteund door de NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical School Milton gevonden, CCFA Senior Research Awards (412708), de Eleanor en Miles Shore 50e verjaardag Fellowship-programma, en de Cariplo Foundation ( 2014-0859).

Alles wat de procedures waren goedgekeurd onder de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en geëxploiteerd onder toezicht van de Vakgroep dierlijke bronnen op kinderen's ziekenhuis (boog) in Boston Children's Hospital of goedgekeurd door de Italiaanse Ministerie van volksgezondheid en verricht op grond van de institutionele Animal Care Comité bij de Universiteit van Milaan-Bicocca.
1. C. albicans voorbereiding
<ol><li>Cultuur C. albicans, stam CAF3-113, in buizen met rijke medium (gist extract pepton dextrose (YEPD), 1% (m/v) gistextract, 2% (g/v) van Bacto pepton, 2% (g/v) glucose) aangevuld met uridine (50 mg/L) bij 25 ° C. Onder deze omstandigheden groeit C. albicans als een gist. Opmerking: Andere stammen van C. albicans kunnen worden gebruikt, zoals de klinische isoleren C. albicans stam SC531413. Aangezien wij onlangs is gebleken dat de colitis proces wordt veroorzaakt door het activeren van het aangeboren immuunsysteem14, theoretisch elke C. albicans stam die optimale zowel componenten van de celwand en structuur, alsmede de kunnen afkomstig zijn van de projecties van het hyphal, kan worden gebruikt.</li>
	<li>Bewaken van de cultuur door het tellen van de cellulaire concentratie met behulp van een cel teller analyzer.</li>
	<li>Oogst de cultuur als een concentratie van ongeveer 8 x 106 cellen/mL wordt bereikt. Ook een spectrofotometer gebruiken voor het meten van de OD600. Opmerking: Meestal een waarde van OD600 = 1 komt overeen met een concentratie van de gist van 3 x 107 cellen/mL, maar titratie wordt aanbevolen.</li>
	<li>Resuspendeer de cultuur in YEPD-uridine medium, gebruik HEPES (50 mM, pH 7.5) als een buffer-agent en de cultuur bij 37 ° C voor het opwekken van schimmeldraden formatie uit te broeden. Controleer hyphal formatie onder een microscoop op 100 X vergroting. Hyphal formatie is zichtbaar 5 h na kweken bij 37 ° C; echter gebruiken de cellen 16 h na incubatie bij 37 ° C wanneer het hyphal percentage bijna 95% van de totale cultuur bereikt.</li>
	<li>Als u wilt verder verrijken de voorbereiding in hyphal concentratie, centrifuge aliquots van de cultuur bij 3300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in steriele PBS bij een concentratie van 1 x 108 schimmeldraden/mL.</li>
</ol>2. diepe dermale injectie
<ol><li>24 h prior de infectie-procedure, anesthetize van de muizen met een intraperitoneale injectie van ketamine (80-100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg), en dan scheren de flank van de muizen met behulp van een elektrische clipper. Opmerking: Na elke procedure waarbij anesthesie, plaatst de muizen onder een lamp verwarming totdat zij efficiënt hebben teruggekregen.</li>
	<li>Rusten de muizen gedurende 24 uur om te voorkomen dat een ontsteking als gevolg van het proces van het scheren.</li>
	<li>24 uur na de ingreep scheren, anesthetize de muizen met een intraperitoneale injectie van ketamine (80-100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg).</li>
	<li>Controleer de poot reflex om ervoor te zorgen dat de muizen diep zijn verdoofd. De paw reflex beoordelen door knijpen stevig de poot. Als de verdoving wordt bereikt, wordt het dier pijn niet voelen en niet beweegt.</li>
	<li>C. albicans schimmeldraden in de diepe derma met een 0.3 mL insuline-injectiespuit met een naald van de 30 G x 8 mm in een eindvolume van 50 µL/injectie, overeenkomt met 5 x 106 schimmeldraden/injectie te injecteren.<ol>
<li>Trek de huid van de geschoren flank strak gebruikend twee vingers om het volume rechtstreeks in de diepe derma injecteren. Plaats de naald met een hoek van 10-15° met de schuine kant van de naald naar boven.</li>
		<li>Met deze hoek, zullen het pathogene agens worden ingespoten met een diepte van ongeveer 300-500 µm. Om ervoor te zorgen dat de injectie is goed uitgevoerd, Controleer dat het geïnjecteerde volume vormt een hobbel dat is geabsorbeerd een paar minuten na de injectie. Opmerking: De bult gevormd na de injectie van ongeveer 1 cm2zal worden. Dit is het gebied dat op het punt van de aangewezen tijd voor moleculaire of histologische analyse zal worden verwijderd.</li>
		<li>Punten van minder dan 24 uur (aanbevolen) markeren voor tijd het gebied van infectie met een viltstift, aangezien de bult gevormd met de injectie voor een paar minuten aanhoudt, waarna het wordt geabsorbeerd. Voor de punten van de tijd van 24 uur of meer is deze stap niet vereist, aangezien een maagzweer of een cyste zal duidelijk zichtbaar zijn.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. voorbeeld van de collectie en voorbereiding histologische kleuring
<ol><li>De muizen volgens institutionele procedures euthanaseren.</li>
	<li>Met behulp van chirurgische pincet, trek de huid op de grens van de geïnjecteerde site, eerder is gemarkeerd met de marker pen. Met behulp van chirurgische scharen, accijnzen de geïnfecteerde site door het snijden van de huid na de duidelijke lijn. Opmerking: Wees voorzichtig te scheiden van de huid van het buikvlies via ronde tip schaar.</li>
	<li>Dompel de huid in een wegwerp basis mal gevuld met optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde, met de interne kant van de huid boven. Bevriezen het monster in vloeibare stikstof totdat de verbinding wit wordt. Niet laat de vloeibare stikstof dekking van het monster, voordat het volledig is bevroren, aangezien dit het monster beschadigen zou. Opmerking: Let op! Draag tijdens stap 3.3, een gelaatsscherm voor bescherming tegen vloeibare stikstof.</li>
	<li>Indien de monsters niet onmiddellijk worden gebruikt voor het prepareren van objectglaasjes, bewaar ze snel bij-80 ° C. Opmerking: Monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor onbepaalde tijd.</li>
</ol>4. voorbereiding van de dia 's
<ol><li>Snij het monster doormidden voor te bereiden op de segmenten histologie vanaf het midden van het monster.</li>
	<li>5-µm dikke sneden met een cryostaat gesneden. Opmerking: Voor monsters van de huid, de temperatuur van de cryostaat mag niet hoger zijn dan-25 ° C. Een hogere temperatuur zou veroorzaken, een gedeeltelijk smelten van de H-OCT en daarom niet in de juiste positie de monsters zou worden gehandhaafd ten tijdens de procedure snijden.</li>
	<li>Positief geladen Microscoop dia's gebruiken voor het verzamelen van de segmenten.</li>
	<li>Als de verzamelde segmenten niet kort na de bereiding worden gebruikt, bewaar ze bij-20 ° C. Op dit punt, kunnen segmenten worden achtergelaten bij-20 ° C voor onbepaalde tijd.</li>
</ol>5. de haematoxyline en eosine-kleuring
<ol><li>Vlek van de dia's door onderdompeling in Gill Haematoxyline voor 4 min. Wash de dia's in stromend kraantjeswater voor 5 min.</li>
	<li>Vlek van de dia's door onderdompeling in eosine Y oplossing voor 1 min. Wash de dia's in stromend kraantjeswater voor 5 min. spoelen de dia's met behulp van gedestilleerd water voordat u doorgaat het protocol.</li>
	<li>Uitdrogen door onderdompeling in serieel toenemende concentraties van ethanol oplossingen (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Onderdompelen van de dia's voor 15 s in elke oplossing van ethanol.</li>
	<li>Hiermee schakelt u de dia's gedurende ten minste 2 minuten door onderdompeling in een histologisch clearing-agent.</li>
	<li>Monteer de dia's met behulp van montage medium en omslag enten.</li>
	<li>Verwerven van beelden van de dia's met een Microscoop dia scanner bij een 40 X vergroting.</li>
</ol>6. periodieke Acid-Schiff (BK) kleuring
<ol><li>Herstellen van de dia's met ≥99.5% aceton bij kamertemperatuur voor 1 min. Wash de dia's in stromend kraantjeswater voor 1 min.</li>
	<li>Vlek dia's in 3 wijzigingen van gedestilleerd water door onderdompeling in periodieke zure oplossing (1 g/dL) gedurende 5 minuten wassen met de dia's.</li>
	<li>Vlek van de dia's door onderdompeling in Schiff van reagens voor 15 min. Wash de dia's in stromend kraantjeswater voor 5 min.</li>
	<li>Vlekken van de dia's door onderdompeling in Gill Haematoxyline 5 min. wassen de dia's in stromend kraantjeswater voor 30 s.</li>
	<li>Het uitdrogen van de dia's door onderdompeling in 3 wijzigingen van 100% ethanol. Onderdompelen van de dia's voor 15 s telkens.</li>
	<li>Hiermee schakelt u de dia's gedurende ten minste 2 minuten door onderdompeling in een histologisch clearing-agent.</li>
	<li>Monteer de dia's met behulp van montage medium en omslag enten.</li>
	<li>Verwerven van beelden van de dia's met een Microscoop dia scanner.</li>
</ol>7. voorbeeld van de collectie en voorbereiding van RNA extractie
<ol><li>De muizen volgens institutionele procedures euthanaseren. Verwijder de huid monsters zoals in stap 3.2.</li>
	<li>Dompel de monsters in een tube module-cap 2 mL met 1 mL reagens voor zure guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie. Opmerking: Het protocol hier kan worden onderbroken en de monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C.</li>
	<li>Snij het monster in stukken van ongeveer 0,2 cm2 met behulp van chirurgische pincet. Opmerking: Let op! De meeste van de reagentia voor RNA isolatie zijn giftig en mutagene. Stap 7.3 en 7.4 moet gebeuren onder een zuurkast.</li>
	<li>Het monster Smash met een kraal molen met een snelheid van 20 oscillaties/s voor 20 min. alternatief, een mechanische potter kan worden gebruikt.</li>
	<li>Controleer de effectieve homogenisering van de monsters door op zoek naar de aanwezigheid van intact stukken van huid. Herhaal deze stap als de monsters zijn niet volledig gehomogeniseerd.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters bij 16.000 x g gedurende 1 min. houden het supernatant voor RNA extractie en gooi de pellet. Deze stap wordt uitgevoerd om te elimineren haar en vuil dat de extractie-kolommen kan blokkeren.</li>
	<li>Doorgaan met RNA extractie met behulp van RNA zuivering kolommen14.</li>
	<li>Het gebruik van een spectrofotometer RNA reiniging en concentratie te beoordelen. Als RNA extracten niet onmiddellijk voor cDNA voorbereiding gebruikt worden, slaan de monsters bij-80 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Belkaid, Y., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dialogue+between+skin+microbiota+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dialogue between skin microbiota and immunity.</a> Science. 346 (6212), 954-959 (2014).</li>
<li>Kashem, S. W., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27178391">Skin Immunity to Candida albicans.</a> Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).</li>
<li>Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+trends+in+skin+mycoses+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Epidemiological trends in skin mycoses worldwide.</a> Mycoses. 51, 2-15 (2008).</li>
<li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Bloodstream+Infections+in+US+Hospitals%3A+Analysis+of+24%2C179+Cases+from+a+Prospective+Nationwide+Surveillance+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study.</a> Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
<li>Romani, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14661066">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).</li>
<li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Candida+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Candida infections.</a> J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).</li>
<li>MacCallum, D. M., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+events+in+the+intravenous+challenge+model+for+experimental+Candida+albicans+infections+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice.</a> Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).</li>
<li>Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+external+traumatic+wound+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Animal models of external traumatic wound infections.</a> Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).</li>
<li>Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD86+%28B7-2%29%2C+but+not+CD80+%28B7-1%29%2C+expression+in+the+epidermis+of+transgenic+mice+enhances+the+immunogenicity+of+primary+cutaneous+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections.</a> Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+Candida+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination.</a> Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).</li>
<li>Mear, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).</li>
<li>Leoni, G., Neumann, P. -A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+role+of+immune-epithelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Wound repair: role of immune-epithelial interactions.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).</li>
<li>Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isogenic+strain+construction+and+gene+mapping+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.</a> Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).</li>
<li>Santus, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infections+are+eliminated+by+cooperation+of+the+fibrinolytic+and+innate+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems.</a> Sci Immunol. 2 (15), (2017).</li>
<li>Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/infectdis/Abstract/2010/07000/Candida_albicans_Skin_Abscess_in_a_Heart.6.aspx">Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient.</a> Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).</li>
<li>Pradeu, T., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+danger+theory%3A+20+years+later%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The danger theory: 20 years later.</a> Front Immunol. 3, 287(2012).</li>
<li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+play+in+four+acts%3A+Staphylococcus+aureus+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschreven we een methode van C. albicans infectie te bestuderen van het inflammatoire proces dat wordt gestart bij de ingang van de schimmel in de diepe derma.
Hoewel huid abces formatie een relatief zeldzame gebeurtenis op C. albicans infectie15 is, kan injectie van de schimmel direct in de diepe derma niet alleen de studie van fungale gestuurde abces vorming, maar ook de analyse van specifieke immune cellen die deel uitmaken van bevatten schimm...

Het menselijk lichaam is bedekt met een extreem hoog aantal micro-organismen. De oppervlakte van de huid is de habitat van bijna een miljoen bacteriën per vierkante centimeter1. Dit nummer, echter overeen niet met het volledige scala aan micro-organismen die de huid koloniseert. Naast bacteriën, is het menselijk lichaam gekoloniseerd door vele schimmel soorten, met inbegrip van C. albicans, die in staat zijn om te overleven op de mucosa en de huid niveau2is.
In de afgelopen jaren is het percentage van de mensen gediagnosticeerd met schimmelinfecties enorm toegenomen. Dat komt vooral door het hogere aantal immuungecompromitteerde personen, dat wil zeggen, HIV-positieve patiënten en patiënten die zijn gegaan door chemotherapie of Immunosuppressieve medicijnen na transplantatie3. In een surveillance studie, uitgevoerd in de Verenigde Staten, toonde Wisplinghoff et al. dat 9,5% van de nosocomiale bloedbaan infecties werden veroorzaakt door Candida soorten4. Als gevolg van het toegenomen voorkomen van schimmelinfecties, en met name vanwege het verhoogde percentage van Candida -soorten infecties van de bloedbaan geconstateerde, is begrijpen hoe deze ziekteverwekker ontsnapt aan de controle van het immuunsysteem zeer belangrijk.
C. albicans is een dimorphic schimmel die in verschillende morfologische vormen zoals gist, blastospores, pseudohyphae en schimmeldraden afhankelijk van de omgevingsomstandigheden5 groeit. In zijn hyphal vorm, C. albicans toont van zijn hoogste capaciteit van invasiviteit en heeft de mogelijkheid om te penetreren het epitheel6.
C. albicans infecties zijn bestudeerd met behulp van verschillende experimentele benaderingen. Het meest voorkomende model van infectie is de intraveneuze injectie van C. albicans gist7. Echter houdt dit model niet rekening alle processen die gebeuren voordat de schimmel beheert te verspreiden in de bloedbaan. Een ander model maakt gebruik van de mogelijkheid van C. albicans invasie van het epithelium. Deze methode, ook bekend als het schuurpapier model8, werd ontwikkeld door Gaspari et al. in 19989, en bestaat uit het gebruik van schuurpapier aan de huid, waardoor het stratum corneum alvorens C. albicansabrade. Deze procedure kan de schimmel te doordringen van het epitheel, waardoor de analyse van de invasieve capaciteiten van deze pathogenen. Tot slot, andere modellen van infecties voor de gastro-intestinale10 en11 van de luchtwegen zijn gebruikt in verschillende studies.
De vorming van een wond (zoals in het schuurpapier model) zorgt ervoor dat de activering van verschillende opleidingstrajecten, met inbegrip van immuun cel aanwerving en activering, teneinde het helende proces12. Dit kan veranderen of maskeren de immuunrespons specifiek ontlokte tegen de ziekteverwekker, waardoor verstorende resultaten.
Hier beschrijven we een methode van huidinfectie die eerste wond vorming vermijdt en de inductie van een basale inflammatoire omgeving. Als u wilt behouden de intact epitheliale structuur, injecteren we direct C. albicans in zijn hyphal vorm in de diepe derma. Hoewel een enkele injectie milde ontsteking uitlokken kan, het bedrag van de ontsteking is beperkt en beperkt in vergelijking tot de vorming van een open wond in de zand papieren model. De aanpak die we hier beschrijven maakt het mogelijk de studie van de immuunrespons voor schimmelinfectie en verspreiding terwijl het vermijden van de buitensporige en reeds bestaande inflammatoire omgeving veroorzaakt door mechanische schade.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB4053L</td><td>warm in 37 &deg;C bath before use</td></tr><tr><td>H-OCT compound</td><td>histo-line laboratories</td><td>R0030</td><td></td></tr><tr><td>Gill's Hematoxilyn</td><td>histo-line laboratories</td><td>09-178-2</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution, alcoholic</td><td>histo-line laboratories</td><td>09-209-05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>scharlau</td><td>ET00232500</td><td></td></tr><tr><td>Citro-HISTOCLEAR</td><td>histo-line laboratories</td><td>R0050</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt, mounting medium</td><td>bio-optica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>sigma-aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>PAS staining system</td><td>sigma-aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology</td><td>Applichem PanReac</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Merck Millipore</td><td>8451</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Applichem PanReac</td><td>A1070,0500</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock tubes 2 mL</td><td>eppendorf</td><td>30121597</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>Toxisch, corrosief en mutageen. Gebruik alle benodigde voorzorgsmaatregelen</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>Draag oogbescherming</td></tr><tr><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coulter Counter-Particle Count</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415 R</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC 3000 Microtome Cryostat</td><td>histo-line laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TissueLiser</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle&nbsp;</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Surgical forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base mould disposable</td><td>histo-line laboratories</td><td>2781</td><td></td></tr><tr><td>Positively charged bio microscope slides</td><td>bio-optica</td><td>09-2000</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips 24 x 50 mm</td><td>thermo scientific</td><td>11911998</td><td></td></tr></tbody></table>

diepe dermale injectie als de een model van candida albicans infectie van de huid voor histologisch analyses

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

De huid is een zeer uitgebreide orgaan van het lichaam en, als gevolg van deze grote oppervlakte, het is voortdurend blootgesteld aan micro-organismen. Huid schade kan gemakkelijk leiden tot infecties in de dermis die kan, op hun beurt in de verspreiding van ziekteverwekkers in de bloedbaan resulteren. Inzicht in hoe het immuunsysteem vecht infecties in de zeer vroeg stadium en hoe de host kunt elimineren de ziekteverwekkers is een belangrijke stap om de basis voor toekomstige therapeutische interventies. Hier beschrijven we een model van Candida albicans infectie die de processen die zich tijdens een infectie voordoen, met inbegrip van wanneer het pathogene agens is verstreken, de epitheliale barrière, evenals de immune reactie ontlokte door de C. albicans vroeg kunt visualiseren invasie. We gebruikten deze infectie model histologische analyses die aantonen dat de immuuncellen die infiltreren in de huid, evenals de aanwezigheid en de lokalisatie van het pathogene agens uitvoeren. Monsters genomen nadat de infectie kan worden verwerkt voor RNA extractie.

Door de injectie van het pathogene agens rechtstreeks in de diepe derma blijft de structurele morfologie van het weefsel intact (figuur 1A).
De handhaving van de structurele integriteit van de huid kan de detectie van immune cellen en hun lokalisatie op de site van infectie. De hogere vergroting weergegeven in figuur 1B onthult dat het abces bestaat voornamelijk uit pol...

Hier beschrijven we een protocol waarmee histologische en moleculaire analyse van monsters van de huid na Candida albicans intradermale injectie. Dit protocol behoudt zijn de structurele integriteit van de huid en zorgt voor de lokalisatie van weefsel-ingezeten of nieuw aangeworven immune cellen, alsmede de verspreiding van de ziekteverwekker.

Diepe dermale injectie als de een Model van Candida albicans infectie van de huid voor histologisch Analyses

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

Het algemene doel van deze procedure is om de activering van het immuunsysteem tijdens huidinfecties te observeren door het injecteren van Candida albicans om de huidarchitectuur en de lokalisatie van specifieke immuun- en niet-immuuncellen te behouden. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie, zoals de aard en de lokalisatie van de immuuncellen die tijdens huidinfecties worden aangetrokken en de belangrijkste bemiddelaars die betrokken zijn. Het grote voordeel van deze techniek is het behoud van de structurele architectuur van de huid na schimmelinjectie, waardoor we de lokalisatie van elk type immuuncel kunnen begrijpen.De demonstratie van een deel van de procedure zal worden gedaan door Giulia Stamerra, een promovendus van het laboratorium van Professor Marina Vai. Om te beginnen, inoculeert u C.Albicans-stam CAF3-1 in buisjes met rijk medium dat is aangevuld met 50 milligram per liter uridine en kweekt u deze bij 25 graden Celsius. Onder deze omstandigheden groeit C.albicans als een gistachtige schimmel.Bewaak de kweek door een celteller of een spectrofotometer te gebruiken om de celconcentratie te meten. Wanneer de kweek acht keer 10 tot de zesde cellen per milliliter bereikt, oogst u het monster. Gebruik YEPD-uridine medium met Hepes als buffermiddel om de cellen op te schorsen en incubeer ze bij 37 graden Celsius om hyfevorming te induceren.Na vijf uur in de kweek, wanneer hyfen zichtbaar zouden moeten zijn, controleert u onder een microscoop met 100X vergroting de hyfevorming. Kweek de cellen in totaal 16 uur, waarna 95% van de kweek hyfen zal hebben gevormd. Om de hyfeconcentratie verder te verrijken, centrifugeert u aliquots van de kweek bij 3.300 keer g gedurende vijf minuten.Gooi het supernatant weg en gebruik steriel PBS om de pellet op te schorsen met een concentratie van één keer 10 tot de achtste hyfen per milliliter. Nadat u een geschoren muis hebt verdoofd volgens het tekstprotocol, controleert u de pootreflex om ervoor te zorgen dat het dier diep sedeerd is. Om C.albicans-hyfen in het diepe derm te injecteren, trekt u met twee vingers de huid van de geschoren flank strak, en steekt u vervolgens een 30-gauge acht-millimeter naald die is bevestigd aan een 0,3-milliliter insulinespuit onder een hoek van 10 tot 15 graden in, waarbij de snede van de naald naar boven wijst, en injecteert u een eindvolume van 50 microliter dat overeenkomt met vijf keer 10 tot de zesde hyfen.Als de hoek van de injectie hoger is dan 15 graden, zal het pathogeen te diep in het derm worden geïnjecteerd, waardoor het risico bestaat op schade aan het peritoneum en vooral, het verlies van de mogelijkheid om infecties specifiek op huidniveau te bestuderen. Bij deze hoek wordt het pathogeen geïnjecteerd op een diepte van ongeveer 300 tot 500 micron. Om ervoor te zorgen dat de injectie goed is uitgevoerd, controleert u of het geïnjecteerde volume een bult vormt die na enkele minuten wordt geabsorbeerd.Voor tijdstippen van minder dan 24 uur, gebruikt u een markeerstift om het infectiegebied te markeren, omdat de bult die is gevormd door de injectie enkele minuten aanhoudt. Voor tijdstippen van 24 uur of later, is deze stap niet vereist, omdat ofwel een zweer of een cyste duidelijk zichtbaar zal zijn. Nadat u de muizen gedood heeft volgens institutionele richtlijnen, trekt u met chirurgische pincetten de huid aan de rand van de geïnjecteerde plaats die eerder is gemarkeerd met de markeerstift, en snijdt u vervolgens met chirurgische schaars het geïnfecteerde gebied weg door de huid te snijden volgens de gemarkeerde lijn.Dompel de huid met de binnenkant naar boven in een wegwerpbare basisvorm gevuld met O.C.T.compound. Bevries het monster in vloeibare stikstof totdat de compound wit wordt. Laat de vloeibare stikstof het monster niet bedekken voordat het volledig bevroren is, omdat dit het monster zal beschadigen.Om de dia's voor te bereiden, snijdt u het monster vanuit het midden in twee delen om de plakjes voor histologie voor te bereiden, en snijdt u vervolgens met behulp van een cryostaat plakjes van vijf micron dik. Gebruik positief geladen microscoopglazen om de plakjes te verzamelen. Om H&E-kleuring uit te voeren, dompelt u de dia's gedurende vier minuten in Gill's hematoxylinen, en wast u vervolgens de dia's gedurende vijf minuten in stromend kraanwater.Dompel de dia's een minuut lang in een eosin-Y-oplossing, was de dia's gedurende vijf minuten in stromend kraanwater, en spoel de dia's vervolgens af met gedestilleerd water. Dehydrateer vervolgens de monsters door ze gedurende 15 seconden in een ethanolreeks te dompelen. Om de dia's te verhelderen, brengt u ze over naar een histologisch verheldermiddel gedurende minimaal twee minuten, en gebruik vervolgens montagemedium en dekglasjes om de monsters te monteren.Gebruik een microscoopglasscanner bij 40X vergroting om de dia's te beeldvormen. Voer Period Acid Solution of PAS-kleuring uit door de dia's gedurende een minuut te fixeren in aceton op kamertemperatuur, en was vervolgens de dia's gedurende een minuut in stromend kraanwater. Dompel de dia's gedurende vijf minuten in PAS, en gebruik vervolgens drie veranderingen van gedestilleerd water om de monsters te wassen.Dompel de dia's vervolgens gedurende 15 minuten in Schiff's reagens, en was de dia's gedurende vijf minuten in stromend kraanwater. Dompel het monster gedurende vijf minuten in Gill's hematoxylinen om ze te kleuren, en was de dia's gedurende 30 seconden in stromend kraanwater. Dehydrateer de monsters door ze in drie veranderingen van 100% ethanol gedurende 15 seconden elk te dompelen, en dompel vervolgens de dia's in een histologisch verheldermiddel.Monteer de verhelderde monsters met montagemedium en dekglasjes, en gebruik vervolgens een microscoopglasscanner om de monsters te beeldvormen. Nadat u de muizen gedood heeft en huidmonsters hebt verwijderd zoals eerder in deze video is gedemonstreerd, dompelt u de monsters

deep-dermal-injection-as-model-candida-albicans-skin-infection-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the development of an in vivo mouse model to study the biofilm formation of Candida albicans in subcutaneous tissue. The experiment involves implanting Candida-infected devices in the animal's back region for biofilm development.

Candida albicans Biofilm Formation in an In Vivo Mouse Model

In vivo ruimte-tijdelijke interacties van pathogeen en immuunafweer op het mucosale niveau zijn niet gemakkelijk in beeld te brengen in bestaande gewervelde gastheren. De hier gepresenteerde methode beschrijft een veelzijdig platform om mucosale candidiasis bij levende gewervelden te bestuderen door gebruik te maken van de zwemblaas van de juveniele zebravis als een infectieplaats.

Modelleren candidiasis van de slijmvliezen in larvale zebravis door zwemblaas Injection

We presenteren een experimentele procedure van Candida albicans biofilmontwikkeling in een muis subcutaan model. Schimmelbiofilms werden gekwantificeerd door het bepalen van het aantal kleurvormende eenheden en door niet-invasieve bioluminescentie-beeldvorming, waarbij de hoeveelheid geproduceerd licht overeenkomt met het aantal levensvatbare cellen.

Candida albicans biofilm ontwikkeling op medisch-relevante vreemde lichamen in een muis Subcutane Model Gevolgd door bioluminescentiebeeldvorming

Wasmot fungeert als een ongewervelde model voor gedissemineerde candidiasis. Hier, we detail de infectie protocol en ondersteunende gegevens verstrekken voor de effectiviteit van het model.

De wasmot Waxworm infectie Model voor verspreid Candidiasis

Het doel van dit protocol is het visualiseren van Candida albicans celvorm en lokalisatie in het maagdarmkanaal van zoogdieren.

Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

Dit manuscript beschrijft een methode voor het screenen van middelgrote Candida albicans mutante bibliotheken op morfogenese fenotypes tijdens actieve infectie in een zoogdier gastheer met behulp van niet-invasieve confocale microscopie.

Gebruik van in vivo beeldvorming om te screenen op morfogenese fenotypes in Candida albicans mutante stammen tijdens actieve infectie bij een zoogdiergastheer

Periprothetische gewrichtsinfectie (PJI) veroorzaakt door gevaarlijke ziekteverwekkers komt vaak voor in de klinische orthopedie. Bestaande diermodellen kunnen de werkelijke situatie van PJI niet nauwkeurig simuleren. Hier hebben we een Candida albicans biofilm-geassocieerd PJI-muismodel opgezet om nieuwe therapieën voor PJI te onderzoeken en te ontwikkelen.

Een periprothetisch gewrichtsinfectiemodel van Candida albicans bij muizen

We stellen een muismodel op van C.albicans-geassocieerde kathetergerelateerde infectie (CRI), waarbij biofilm zich vormt op de katheter, en de interactie tussen C.albicans en gastheer goed correleert met de klinische CRI. Dit model helpt bij het screenen van therapieën voor C.albicans biofilm-geassocieerde CRI, waarmee een basis wordt gelegd voor klinische transformatie.

Een kathetergerelateerd Candida albicans-infectiemodel bij muizen

Dit protocol beschrijft de toepassing van antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) in een muizenmodel van orale candidiasis. aPDT werd uitgevoerd met behulp van een in water oplosbaar mengsel van curcuminoïden en blauw LED-licht.

Curcuminoïde-gemedieerde antimicrobiële fotodynamische therapie op een muizenmodel van orale candidiasis

Het huidige protocol beschrijft een muismodel dat gebruik maakt van subcutane dorsale implantatie om implantaat-geassocieerde infecties te onderzoeken, waardoor uitgebreid onderzoek naar pathofysiologische mechanismen mogelijk wordt en de ontwikkeling van diagnostische criteria met gerichte therapeutische strategieën wordt ondersteund.

Diermodel van implantaat-geassocieerde infecties bij muizen

Leer een diepe dermale injectiemethode met Candida albicans voor histologische analyse van huidinfecties. Deze techniek behoudt de huidarchitectuur en maakt lokalisatie van immuuncellen en pathogeenverdeling mogelijk.

Diepe dermale injectie als de een Model van Candida albicans infectie van de huid voor histologisch Analyses

Meer video's verkennen