Immunoglobuline Gene sequentieanalyse In chronische lymfatische leukemie: Van patiënt materiaal reeks interpretatie

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het chronische lymfatische leukemieveld, zoals de nauwkeurige prognose van patiënten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig, snel en zeer nauwkeurig is. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot robuuste prognosticatie, met name risicocertificeringen bij patiënten met chronische lymfatische leukemie, omdat de nauwkeurige prognose later therapeutisch beheer van de ziekte kan definiëren.

Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, zoals de PCR-productselectie en digestsequentieanalysetypen zijn moeilijk te leren omdat ze zowel precisie als ervaring vereisen. Om deze procedure te beginnen, voeg 200 microliter EDTA toe aan een 50 milliliter steriele opvangbuis. Voeg 20 milliliter perifeer bloed en 15 milliliter RPMI-medium toe aan de buis en pipet twee tot drie keer op en neer om te mengen.

Voeg vervolgens 15 milliliter dichtheidsgradiëntmedium toe aan een nieuwe 50 milliliter opvangbuis. Leg de perifere bloedoplossing langzaam op het dichtheidsgradiëntmedium, zodat de helling niet wordt verstoord. Centrifuge op 800 keer G gedurende 20 minuten met de centrifuge rem uit.

Gebruik vervolgens een steriele Pasteur pipet om de mononucleaire celring te verzamelen die zich heeft gevormd tussen de bovenste plasmaplaatjeslaag en de gemiddelde laag van de dichtheidsgradiënt en breng deze over naar een nieuwe steriele 15 milliliter opvangbuis. Voeg RPMI medium zodanig dat het uiteindelijke volume is 12 milliliter en pipet de oplossing op en neer te mengen. Centrifuge op 800 keer G gedurende acht minuten.

Gooi de supernatant weg en hang de celpellet opnieuw op met 10 milliliter RPMI-medium. Centrifuge opnieuw op 750 keer G gedurende acht minuten. Gooi hierna de supernatant weg en los de celpellet op in één milliliter PBS.

Met behulp van een nieuwe Bauer plaat, vormen een cel tellen door het mengen van 20 microliter van het monster en 80 microliter van een tot 10 Turk oplossing. Als de downstreamverwerking van het monster niet op dezelfde dag is gepland, centrifugeren van het monster op 750 keer G gedurende acht minuten. Gooi de supernatant weg en bewaar de celpellet op min 80 graden Celsius.

Bereid eerst de primermix voor met behulp van equimolar-hoeveelheden van elke subgroepprimer om onpartijdige versterking te garanderen. Meng de PCR-reagentia zoals vermeld in tabel twee van het tekstprotocol. Voeg 0,5 microliter TAP polymerase toe aan de PCR-buis met de gemengde PCR-reagentia.

Voeg vervolgens 100 nanogram gDNA of twee microliter cDNA toe. Voer het thermische PCR-protocol uit zoals beschreven in tabel drie van het tekstprotocol. Controleer hierna op PCR-producten van ongeveer 500 basisparen bij gebruik van IGHV-literprimers of 350 basisparen bij gebruik van de IGHPFR1-primermixen.

Om te beginnen met pcr-productzuivering, laadt u het totale volume van het PCR-product op een drie procent laag smeltende agarosegel. Laat de PCR-producten op de gel draaien totdat ze van de achtergrond scheiden. Accijns de scherpe prominente PCR banden en vervolgens zuiveren en elute hen.

Als twee herschikkingen worden gedetecteerd, moeten beide banden afzonderlijk worden verwijderd en gesequenced. Volg de instructies van de fabrikant met betrekking tot de specifieke volumes die u wilt gebruiken om exo-sap op te ruimen. Voorzichtig vortex elk monster te mengen en uitbroeden ze op een PCR blok op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Activeer de enzymen door ze gedurende 15 minuten te verwarmen tot 85 graden Celsius. Laad hierna een kleine hoeveelheid van de PCR-producten op een drie procent agarosegel om de zuiverheid van het product te beoordelen. Het laatste controlepunt voorafgaand aan de sequencing is het bepalen van de klonaliteit van het monster met behulp van fragmentanalyse.

Om te beginnen met het analyseren van de volgorde, start de juiste software. Geef de soort op, zoals homo sapiens, en het receptortype of de locus. Tempo de sequenties worden geanalyseerd in fasta formaat en met inbegrip van id's in het tekstgebied in batches van maximaal 50 sequenties per run.

Kies vervolgens een van de volgende drie weergaveopties voor de resultaten. Gedetailleerde weergave:kies deze optie om de resultaten voor elke reeks afzonderlijk te krijgen. Syntheseweergave:kies deze optie om een overzichtstabel samen te stellen die is besteld door IGHV-gen- en allelnaam of op volgorde-invoervolgorde.

Deze optie biedt ook een uitlijning van sequenties die in een ingediende batch zijn toegewezen aan hetzelfde IGHV-gen en allel, en ten slotte, Excel-bestand. Kies deze optie om alle uitvoerbestanden op te bieden als spreadsheets die in één bestand zijn opgenomen. Alleen het gebruik van IGHV liter primers maakt de versterking van de volledige lengte van de herschikte IGHV mogelijk, waardoor de werkelijke HSM-belasting kan worden bepaald.

Het verwachte PCR-product is ongeveer 500 basisparen. In zeldzame gevallen waar IGHV liter primers niet kunnen versterken van de clonotypic IG herschikking, IGHBFR1 primers kunnen worden gebruikt. Het verwachte PCR-product is ongeveer 350 basisparen.

De verkregen sequenties worden vervolgens geanalyseerd met behulp van de IMG TV Quest tool. In de eerste rij in de resultatentabel wordt de functionaliteit van de reeks weergegeven, omdat een IG-herschikte reeks productief of onproductief kan zijn. Een versnelling van het IGH-gen is onproductief is dat stopcodons aanwezig zijn in het VDJ-gebied en/of als de herschikking buiten beeld is als gevolg van invoegingen/verwijderingen.

Het is belangrijk op te merken dat alleen productieve en dus functionele herschikkingen verder moeten worden geanalyseerd. Bij het gebruik van de standaard IMG TV Quest parameters worden invoegingen en verwijderingen niet automatisch gedetecteerd, maar sterke aanwijzingen dat een reeks dergelijke wijzigingen kan bevatten, worden door het gereedschap geleverd en verschijnt er een waarschuwing onder de overzichtstabel van het resultaat. Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de PCR-producten land op de gel lang genoeg, zodat de kloonband kan worden gediscrimineerd van de polyklonale achtergrond.

Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van chronische lymfatische leukemie immunogenetica om de prognostische impact van de somatische epimutatiestatus bij patiënten te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met ethyliumbromide zeer gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals te allen tijde onder de motorkap werken, moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.