Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van DNA-polymeren trouw en DNA-reparatie, zoals bewijsmethoden en analyse en bij het definiëren van de DNA-reparatiepatch. Het grote voordeel van deze techniek is dat het zeer specifiek, eenvoudig, snel en gemakkelijk uit te voeren is. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode het moeilijk vinden omdat ze nog steeds bezig zijn met DNA-replicatie en het reparatieveld mogelijk niet vertrouwd zijn met de massaspectrometrie-instrumentatie en de gegevensinterpretatie.

Ik denk dat het belangrijkste is dat de visuele demonstratie erg belangrijk is, omdat we kunnen laten zien hoe onze commercieel ontwikkelde massaspectrometrie voor klinische toepassingen zoals mutatie en deputatie gemakkelijk kan worden aangepast voor DNA-proofreading en de reparatiestudie. Het demonstreren van de procedure zal door Rong-Syuan en Kuei-Ching afgestudeerde studenten uit mijn lab. Begin deze procedure met primer- en sjabloonvoorbereiding zoals beschreven in het tekstprotocol.

Gebruik als voorbeeld een TG-mismatch van substraat P21 met T28 voor het proofreading. Verdun de P21-primer en de T28-sjabloon tot 12,5 picomol per microliter met water. Breng vervolgens 12 microliters van de verdunde primer en 12 microliters van de verdunde sjabloon over in een gesteriliseerde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.

Nadat de buis goed is gesloten, incubeer de buis gedurende 30 minuten in een gesloten waterbad van 65 graden Celsius. Vervolgens, incubeer gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius. En, plaats tenslotte de buis op ijs om een goede annealing te garanderen.

Voeg in een gesteriliseerde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter acht microliters primer en sjabloonmix toe, twee microliters van 10x proofreading-reactiebuffer, vier microliters van 4ddNTPs-mix en water tot 18 microliters. Klop de buis om te mengen. Verdun de DNA-polymerase in ijskoud 1x proofreading-reactiebuffer tot de gewenste concentratie.

Bewaar het verdunde enzym altijd op ijs. Verwarm de microcentrifugebuis met de substraatmix voor tot de gewenste reactietemperatuur. Breng vervolgens twee microliters van de verdunde DNA-polymerase over in het voorverwarmde substraatmengsel en klop de buis om de inhoud te mengen.

Centrifugeer de buizen met enzym en substraat gedurende enkele seconden bij 3200 keer zwaartekracht bij kamertemperatuur om de componenten van de reacties naar beneden te spinnen. Breng de reactie onmiddellijk over naar een verwarmingsblok of een waterbad op de gewenste incubatietemperatuur. Om de reactie te beëindigen, voegt u een gelijk volume aan gebufferd fenol toe en mengt u de reactie door enkele seconden te vortexen.

Centrifugeer vervolgens de reactie in een microcentrifuge bij 3200 keer zwaartekracht bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Breng de waterige fase over in een schone microcentrifugebuis en voeg een gelijk volume chloroform toe. Na het mengen door enkele seconden te vortexen, centrifugeer de monsters in een microcentrifuge bij 3200 keer zwaartekracht bij kamertemperatuur gedurende drie minuten.

Breng de waterige fase over in een schone microcentrifugebuis. Nadat de reactie gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius is geïncubeerd, plaats de buis op ijs. Voer vervolgens harstoevoeging uit om zoutverontreiniging te elimineren in een 384-wellplaat zoals beschreven in het tekstprotocol.

Plaats de monsterplaten in de nanoliterdispenser. Plaats de matrixchip en de voorbereide 384-wellplaat in de overeenkomstige lade. Gebruik de nano-dispenser om de reactieproducten op de chip te plaatsen.

Druk op de startknop op het touchscreen van de nano-dispenser om te beginnen. Controleer de geautomatiseerde opgenomen afbeelding van de monsterspotten met verzadigingsinformatie op het scherm om ervoor te zorgen dat het totale gespotvolume op de chip ongeveer vijf tot tien nanoliter is. Herhaal het monsterspotten als het volume onvoldoende is.

Maak een bestand in Excel-formaat met de verwachte signaalinformatie voor importeren. Maak en definieer een nieuwe test in het applicatieprogramma door met de rechtermuisknop op importeer testgroep in designerformaat te klikken en het Excel-bestand te selecteren. Maak de doeltestplaat aan via de klantprojectplaat optieboom aan de linkerkant van het scherm door met de rechtermuisknop op de bovenkant van de boom te klikken en het een bestandsnaam te geven.

Selecteer het 384-wellplate type en druk op OK. Er verschijnt een lege plaat. Selecteer de juiste test aan de linkerkant van het scherm. Wijs de geselecteerde test toe aan elke gespotte monsterspositie op de chip door de put te markeren en met de rechtermuisknop te klikken om toe te voegen plex te selecteren.

Bereid vervolgens een werklijst van alle tests op de chip in Excel-formaat voor zonder kop. Importeer de werklijst via de optie nieuwe monsterproject toevoegen. Wijs de test en de werklijst toe aan elke positie van de P21T28-test en kies door met de rechtermuisknop te klikken.

Verbind de massaspectrometer met de chip via het applicatieprogramma. Selecteer de standaardinstelling aan de rechterkant van het scherm. Vul de testnaam en de chip-ID in op de hoek van de chip.

Sla de instellingen op en start het MS-besturingsprogramma. Druk op de in/uit-knop en haal de scoutplaat eruit. Plaats de gespotte chip op de scoutplaat en druk op de in/uit-knop voor de gespotte chip om de massaspectrometer binnen te gaan.

Klik op de verwerven-knop van het applicatieprogramma om de massaspectrometrie te starten en de gegevens te verwerven. Open het programma voor de gegevensanalyse. Blader door de boom van de database in de linkerbovenhoek en selecteer de chip-ID. Open het gegevensbestand aan de rechterkant van het scherm.

Klik op het spectrumpictogram om het massaspectrum weer te geven. Om een specifiek bereik van massa over lading te bijsnijden, klikt u met de rechtermuisknop om het aanpassingsdialoogvenster te selecteren. Klik in het nieuwe venster op x-as en stel de gewenste boven- en ondergrens in en druk op OK om het opgegeven bereik van het spectrum weer te geven.