Name: Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Leer een snelle MALDI-TOF massaspectrometrie-methode voor DNA-proeflezen en reparatie-analyse. Deze techniek analyseert reparatie-patches korter dan 9 nucleotiden met hoge specificiteit en eenvoud.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de NCFPB geïntegreerde Core faciliteit voor functionele genomica (Taipei, Taiwan) en de NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door onderzoekssubsidies van de Taiwan Health Foundation (L-I.L.) en het ministerie van wetenschap en technologie, Taipei, Taiwan, ROC [meest 105-2320-B-002-047] voor Wei-Yao Hu, [meest 105-2628-B-002-051-MY3] voor Kang-Yi Su en [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] voor Liang-In Lin.

1. primer/sjabloon voorbereiding
<ol><li>Ontwerpsjablonen inleidingen/met een evenwichtige G + C gehalte tussen 40% en 60% in een volgorde of PCR primer ontwerp. Gebruik van inleidingen van 18 tot en met 21 nt voor een passende gloeien en betere MS signalen.</li>
	<li>De ontwerpsjabloon door 50 ° C als het minimum smelttemperatuur voor de duplex regio met ten minste 7 nt van 5'-overhang om te scheiden van de signalen tussen de primer en de sjabloon. Opmerking: bijvoorbeeld voor het substraat P21/T28 in tabel 1, de 21-nt primer is gekoppeld aan een 28-nt-sjabloon. Optie: het gebruik van alternatieve nucleic zuren zoals nuclease-resistente phosphorothioate obligaties ter vervanging van de laatste 4 phosphodiester banden aan de 3'-eind van de sjabloon kunt mogelijke storingen voorkomen door een aspecifieke 3' eind degradatie van de sjablonen ( bijvoorbeeld, T28S4 in tabel 1), hoewel dit sommige kosten voor de voorbereiding van de sjabloon toevoegen zal.</li>
	<li>Met behulp van standaard ontzout oligonucleotides zonder verdere zuivering is bevredigend voor deze studie. Oligonucleotide primers/sjablonen gebruiken bij een concentratie van 100 pmol/µL in H2O als een voorraad en opslaan bij-20 ° C. Controleer de kwaliteit en zuiverheid van de inleidingen en sjablonen door de oligonucleotides waarop MALDI-TOF MS (stappen 4-7) om unieke piek signalen en een goede signaal / ruisverhouding.</li>
	<li>Het bepalen van de relatieve MALDI-TOF MS signaal intensiteiten (stap 7) van de gelijke molaire inleidingen van de relevante reeksen in de reactie voor kalibratie en concentratie normalisatie (Figuur 2).</li>
</ol>2. proeflezen reacties
Opmerking: De dezelfde proeflezen reactie staat en het protocol is van toepassing op een DNA-herstel van A-I, G-I, C-I, en T-ik.
<ol><li>Met behulp van een T-G mismatch van substraat P21/T28 voor het proeflezen in tabel 1 als voorbeeld, Verdun primer P21 en sjabloon T28 12,5 pmol/µL met H2O; 12 µL van de verdunde primer en 12 µL van de verdunde sjabloon vervolgens overbrengen naar een 1.5-mL gesteriliseerde microcentrifuge buis. Nota: Het bedrag van de sjabloon/primer mix is voldoende voor 2 Reacties; proportioneel vergroten het volume van de reagentia dienovereenkomstig voor meerdere reacties.</li>
	<li>Sluit de buis strak. Incubeer het 30 min in een overdekte 65-° C waterbad, gevolgd door 30 minuten in een waterbad 37 ° C, en ten slotte op het ijs om een juiste gloeien.</li>
	<li>Tot een gesteriliseerde microcentrifuge 1.5-mL koker, voeg 8 µL primer en sjabloon mix (50 pmol), 2 µL van 10 x proeflezen reactie buffer, 4 µL van 4 ddNTPs mix (2 mM van elk 4 dNTPs) en H2O tot 18 µL. Flick de buis te mengen. Opmerking: 1 x proeflezen reactie buffer bevat 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, dithiothreitol van 1 mM en 10 mM Tris-HCl (pH 7,9 bij 25 ° C). Zie de Tabel van materialen voor de commerciële bron van 10 x proeflezen reactie buffer. De uiteindelijke concentratie van elke ddNTP in de reactie is 0.1 mM.</li>
	<li>Verdun de polymerase van DNA in ijskoude 1 x proeflezen reactie buffer tot de gewenste concentratie [bijvoorbeeldnaar een 1.5-mL microcentrifuge buis, Voeg 4 µL 1 x proeflezen reactie buffer en 1 µL van 5-U Klenow polymerase van een commerciële bron (tabel van Materials)]. De verdunde enzym op ijs te allen tijde opslaan. Opmerking: De hoeveelheid verdunde polymerase van DNA is voldoende voor 2 Reacties; proportioneel vergroten het volume van de enzymen dienovereenkomstig voor meerdere reacties. Een volume van 2.0 µL, met 2.0 eenheden van Klenow polymerase, kan meer dan de helft van de 50 pmol van T-G terminal niet-overeenkomende P21/T28 in 5 min proeflezen.</li>
	<li>Prewarm de microcentrifuge-buis met de mix van het substraat vanaf stap 2.3 tot de gewenste reactie temperatuur (b.v., meestal 37 ° C voor Klenow polymerase en 25 ° C voor T4 DNA-polymerase). Vervolgens breng 2.0 µL van de verdunde polymerase van DNA van stap 2.4 aan het substraat voorverwarmde mengsel en flick de buis te mengen van de inhoud ervan.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen met enzym en substraat voor een paar seconden bij 3200 x g bij omgevingstemperatuur te draaien naar beneden van de componenten van de reacties. Onmiddellijk overdracht de reactie op een blok van de verwarming of een waterbad op de gewenste incubatietemperatuur zoals in stap 2.5.</li>
	<li>
Beëindigen van de reactie
	<ol>
<li>Voeg een gelijk volume van gebufferde fenol, meng het door de vortexing voor een paar seconden en Centrifugeer het in een microcentrifuge bij 3200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.<ol>
<li>De waterfase overbrengen in een schone microcentrifuge buis en voeg een gelijke hoeveelheid chloroform toe, meng het door de vortexing voor een paar seconden en centrifuge in een microfuge bij 3200 x g bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten aan een schone microfuge buis en in de waterfase overbrengen cubate het bij 95 ° C gedurende 5 minuten; plaats het dan op ijs. Let op: Fenol en chloroform zijn gevaarlijke chemische stoffen. Behandeling en afval verwijdering moet institutionele regels volgen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>U kunt ook een zuur blussen protocol gebruiken Voor dit, voeg 2 µL van 1 M HCl zet de reactie stop op ijs voor 6 min, dan Voeg 0.64 µL van 1 M diethanolamine (DEA) te neutraliseren de pH van het reactiemengsel en na het bebroeden bij 95 ° C gedurende 5 minuten; plaats het dan op ijs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hars toevoeging aan het elimineren van zout besmetting
<ol><li>Met behulp van de lepel van de hars van de commerciële ontzouten kit (Zie de Tabel van materialen), neem voldoende hars ter dekking van de kuiltjes van de 384-kuiltje, 6-mg hars kuiltje plaat.</li>
	<li>De hars gelijkmatig verdelen over alle de kuiltjes (6 mg/kuiltje) door schrapen over de bovenkant van de plaat. Eventuele overtollige hars herstellen en vervangen in de fles.</li>
	<li>De uiteindelijke reactieproducten van stap 2.7 van de microfuge buizen naar een 384-well-plate overbrengen. Afzien 16 µL van H2O Verdun de uiteindelijke reactieproducten in elk putje afdichting van de plaat en centrifugeer te verwijderen alle bubbels.</li>
	<li>Verwijderen van de zegel, draai de 384-well plaat met de reactieproducten ondersteboven aan de hars gevulde kuiltje afdekplaat.</li>
	<li>Draai de goed-te-kuiltje platen sandwich en zorgvuldig laat de hars vallen de 384-well plaat (ben zeker de 384-well plaat is tegen de metalen pen op de plaat hars gevulde kuiltje).</li>
	<li>Verwijderen van de kuiltje plaat bovenop, verzegelen de 384-well plaat met de mengsels van de reactieproducten en hars, Centrifugeer het kort bij 3200 x g tot alle bubbels verwijderen en plaats deze op een rotator gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur voor het ontzouten van de inhoud ervan.</li>
	<li>Na het opruimen van hars, centrifugeer de 384-well plaat bij 3200 x g gedurende 5 min te comprimeren de hars naar de onderkant van de putten.</li>
</ol>4. reactieproducten overbrengen in een Matrix-Chip
<ol><li>Instellen van de monster-platen in de nanoliter dispenser (nanodispenser, zie de Tabel van de materialen).</li>
	<li>Zet de matrix chip (Zie de Tabel van materialen) en de plaat 384-well uit sectie 3.7 in de overeenkomstige lade.</li>
	<li>Bedienen van de nanodispenser om ter plaatse de reactieproducten naar de chip; Druk op de knop uitvoeren op het aanraakscherm van de nanodispenser om te beginnen.</li>
	<li>Check de automatische opname van de spots van de steekproef die verzadiging informatie op het scherm om het totale gevlekte volume op de chip rond is 5-10 nL. Herhaal de monster spotting als het volume onvoldoende is.</li>
</ol>5. setup de Assay informatieover de Spectrometrie van de massa
<ol><li>Een bestand in XLS-indeling met daarin de gegevens van de verwachte signaal voor het importeren van voorbereiden. Bijvoorbeeld, de instelling van "P21_T28.xls" (tabel 2) gebruikt voor het proeflezen reactie van P21/T28 in stap 2, 3 en 4.</li>
	<li>Maken en definiëren van een nieuwe bepaling in het toepassingsprogramma (Zie de Tabel van materialen) door met de rechtermuisknop op Assay-groep importeren in Designer-indeling en selecteer het xls-bestand (bijvoorbeeld"P21_T28.xls" uit stap 5.1).</li>
	<li>Stellen de doelgroep assay plaat via de boom optie Klant: Project: plaat aan de linkerkant van het scherm door met de rechtermuisknop op de top van de boom en geeft het een bestandsnaam (bijvoorbeeld, "CTT20171201" geeft de test code en datum).</li>
	<li>Selecteer het type 384-well plaat en druk op OK; Er verschijnt een leeg bord.</li>
	<li>Selecteer de juiste bepaling (bvP21_T28) aan de linkerkant van het scherm.</li>
	<li>Voor elk monster Monster positie op de chip gespot door te wijzen van de put en Schakel Plex toevoegenmet de rechtermuisknop op de geselecteerde assay (bvP21_T28) toewijzen</li>
	<li>Opstellen van een lijst van de werken van alle tests op de chip in de XLSX-indeling met geen header (b.v., 1201.xlsx van tabel 3). Importeer de werkende lijst via de Nieuwe voorbeeldproject toevoegen optie.</li>
	<li>De test in de lijst van werken (bijvoorbeeldvan 1201.xlsx) toewijzen aan elke positie van de bepaling van de P21_T28 en kies door rechts te klikken.</li>
</ol>6. MALDI-TOF MS operatie
<ol><li>De massaspectrometer koppelen aan de chip met behulp van het toepassingsprogramma (Zie de Tabel van de materialen).</li>
	<li>Selecteer de standaardinstelling aan de rechterkant van het scherm.</li>
	<li>Vul de naam van de bepaling uit stap 5.3 (bijvoorbeeldCTT20171201), chip-ID op de hoek van de chip, en sla de instellingen.</li>
	<li>Start het programma MS controle (Zie de Tabel van de materialen).</li>
	<li>Druk op de knop In/Out en neem uit de scout plaat. Plaats de gevlekte chip uit stap 4.4 op de scout plaat en druk op de knop In/Out voor de gevlekte chip te voeren de massaspectrometer.</li>
	<li>Klik op de knop van het verwerven van het toepassingsprogramma (Zie de Tabel van materialen) aan de start van de Spectrometrie van de massa en het verwerven van gegevens.</li>
</ol>7. de gegevensanalyse
<ol><li>Open het programma voor de data-analyse (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Bladeren van de boom van de database bij de hogere linkerhoek en selecteer de ID chip in stap 6.3. Open het gegevensbestand aan de rechterkant van het scherm.</li>
	<li>Klik op het pictogram van de spectrum om de massaspectrum weer te geven. Als u wilt bijsnijden van een bepaald paginabereik m/z, klik met de rechtermuisknop om te de Customization dialoogvenster selecteren en in het nieuwe venster klikt u op de x-as en instellen van de gewenste bovenste en onderste grenswaarden en druk op OK om de Toon van het opgegeven bereik van het spectrum.</li>
	<li>Exporteer het spectrum voor het bijhouden van een register door te rechtsklikken op exporteren. Opmerking: Met een kleurenschaal van 1.600 breedte/1.200 eenheid is een redelijke grootte voor inspectie van de gegevens op een computerscherm.<ol>
<li>Selecteert u het JPEG-bestandstype, klikt u op bestemming, selecteer Bladeren Disc (bijvoorbeeldflash schijf E:), typt u de bestandsnaam (bijvoorbeeld, 1201-1.jpg) en klik vervolgens op exporteren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor de kwantificatie van de gegevens, gebruik de cursor en klik op de piek te tonen de piekhoogte op de linker bovenhoek.<ol>
<li>U kunt ook uitprinten van een geëxporteerde JPEG-bestand en de piekhoogte meten met een liniaal handmatig.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Loeb, L. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fidelity+of+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fidelity of DNA synthesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).</li>
<li>Kornberg, A., Baker, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornberg%2C+A+%22DNA+replication%22">DNA replication</a>. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).</li>
<li>Carroll, S. S., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr00105a011">Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm.</a> Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).</li>
<li>Echols, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1883202">Fidelity Mechanisms in DNA Replication.</a> Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetic+and+chemical+mechanism+of+high-fidelity+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).</li>
<li>Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+proofreading%3A+Multiple+roles+maintain+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).</li>
<li>Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+proofreading%3A+active+site+switching+catalyzed+by+the+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).</li>
<li>Petruska, J., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+neighboring+bases+on+DNA+polymerase+insertion+and+proofreading+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).</li>
<li>Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+mispair+extension+kinetics.+Comparison+of+DNA+polymerase+%CE%B1+and+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).</li>
<li>Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10373598">An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases.</a> Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).</li>
<li>Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+2-aminopurine+fluorescence+to+measure+incorporation+of+incorrect+nucleotides+by+wild+type+and+mutant+bacteriophage+T4+DNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).</li>
<li>Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+analog+2-aminopurine+as+a+spectroscopic+probe+of+nucleotide+incorporation+by+the+Klenow+fragment+of+Escherichia+coli+polymerase+I+and+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).</li>
<li>Leung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+G-quadruplex-based+luminescent+switch-on+probe+for+the+detection+of+polymerase+3%27-5%27+proofreading+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity.</a> Methods. 64 (3), 224-228 (2013).</li>
<li>Song, C., Zhang, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+DNA+polymerase+fidelity+by+singly+labeled+smart+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes.</a> Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).</li>
<li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphism+identification+assays+using+a+thermostable+DNA+polymerase+and+delayed+extraction+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).</li>
<li>Haff, L. A., Smirnov, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genotyping+of+PCR+products+with+MassTag-labeled+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers.</a> Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).</li>
<li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+MALDI-TOF+based+methodology+for+genotyping+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Research. 31 (24), e155(2003).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+%28EGFR%29+T790M+mutation+predicts+shorter+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+response+duration+in+patients+with+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).</li>
<li>Lee, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+V-mediated+deoxyinosine+excision+repair+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro.</a> DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).</li>
<li>Lee, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+excision+of+3%27+penultimate+errors+by+DNA+polymerase+I+and+its+role+in+endonuclease+V-mediated+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair.</a> DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).</li>
<li>Kucera, R. B., Nichols, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Dependent+DNA+Polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA-Dependent DNA Polymerases.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li>
<li>Weiss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+deoxyinosine+from+the+Escherichia+coli+chromosome+as+studied+by+oligonucleotide+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation.</a> DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).</li>
<li>Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+V%3A+an+unusual+enzyme+for+repair+of+DNA+deamination%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+proofreading+and+DNA+repair+assay%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay.</a> DNA Repair. 61, 63-75 (2018).</li>
<li>Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proofreading+DNA%3A+recognition+of+aberrant+DNA+termini+by+the+Klenow+fragment+of+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).</li>
<li>Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermodynamics+of+DNA+structural+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">The thermodynamics of DNA structural motifs.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+I+proofreading+exonuclease+activity+is+required+for+endonuclease+V+repair+pathway+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo.</a> DNA Repair. 64, 59-67 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze studie beschreven een stapsgewijze proeflezen activiteit assay geanalyseerd door de gekozen commerciële instrument (Zie de Tabel van materialen) met behulp van MALDI-TOF MS. De grote voordelen zijn dat de primer en de sjabloon label gratis en eenvoudig uit te voeren zijn, meer flexibiliteit bij het ontwerpen van experimenten. Een stream-kalk volledige verwerking van 30 proeflezen proeven zou duren 4 h, met inbegrip van 3 h voor het handmatig uitvoeren van de proeflezen reacties en hun opruimen, terw...

De proeflezen functies van de polymerase van DNA tijdens de DNA-replicatie zijn van essentieel belang om ervoor te zorgen de hifi van genetische informatie die moet worden overgedragen aan nakomelingen1,2,3,4, 5,6,7. Zijnde kundig voor het beoordelen van de bijdragen van polymerase proeflezen van exonucleases zou het verduidelijken van de mechanismen om genetische stabiliteit te waarborgen.
Isotoop labeling en gel gebaseerde testen in combinatie met densitometric analyses van autoradiograms of fosfor imaging8,9,10 zijn traditioneel gebruikt voor het detecteren van proeflezen activiteit van DNA polymerase. Hoewel functioneel, zijn deze tests arbeidsintensief, duur en niet vatbaar voor high-throughput formaten. Daarnaast lijden de radio-isotopen veiligheidskwesties met inbegrip van de verwijdering van afval. Anderzijds hebben proeflezen activiteiten zijn geanalyseerd door fluorimetrische technieken. 2-aminopurine (2-AP) kan bijvoorbeeld worden opgenomen in extensie producten tijdens in vitro polymerase proeflezen testen om te produceren een fluorescent signaal11,12. Helaas, deze benaderingen lijden onder een lage specificiteit, aangezien 2-AP met zowel thymine en cytosine koppelen kunt. Meer recente benaderingen omvatten een gevoelige G quadruplex-gebaseerde verlichte schakelaar-op sonde voor een polymerase van 3' - 5' exonuclease assay13 , alsmede een afzonderlijk-label fluorescente sonde voor een polymerase van proeflezen assay overwint enkele van de bovengenoemde nadelen14. Enthousiasme voor deze fluorimetrische methoden is verminderd als gevolg van de noodzaak van de specifieke etikettering van DNA substraten.
In tegenstelling, een MALDI-TOF MS voor DNA-analyse is werkzaam in de PinPoint-assay, waar de primer extensie reacties met labelloze 4 ddNTPs kunnen worden gebruikt voor het identificeren van polymorfismen bij een bepaald locus15,16,17 en grote schaal is goedgekeurd in klinische toepassingen voor mutatie detecties en kanker diagnoses18. Met behulp van deze fundamentele beginselen, hebben we een label-gratis test voor de bepaling in vitro van DNA-polymerase activiteit benutting van de hoge resolutie, hoge specificiteit en high-throughput potentieel van MALDI-TOF MS. gebruiken de E. proeflezen coli polymerase van DNA ik Klenow als een model-enzym, dideoxyribonucleotide trifosfaat (ddNTPs fragment) als substraten een "momentopname nemen kunnen" van proeflezen producten na een single nucleotide uitbreiding via MALDI-TOF MS (Figuur 1).
Ook werd deze methode ook ontwikkeld voor een DNA repair assay waar inleidingen met 3' voorlaatste dI laesies zijn onderworpen aan een pol die ik herstellen assay welke nabootsers endo V gejat reparatie tussenproducten. Hoewel niet volledig begrepen, is de endo V reparatie traject het enige reparatie systeem bekend om de pol in dienst ik proeflezen exonucleaseactiviteit voor laesie excisie19,20. Met behulp van MALDI-TOF MS, laten we zien een duidelijk omschreven reparatie patch waar dI kan worden weggesneden door pol ik wanneer die zich voordoen in de laatste 2 nt van de primer voordat u toevoegt de juiste aangevuld nucleotide.
Voor de studie van proeflezen en DNA-herstel, deze methode is sneller en minder arbeidsintensief dan eerdere methoden en biedt extra informatie naar mechanisme en functie.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Mission Biotech (Taiwan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosforothioate gemodificeerde oligonucleotiden</td><td>Integrated DNA Technologies (Taiwan)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Klenow fragment (3'&rarr;5' exo-)</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1 (10X)</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddATP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4001</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddGTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4002</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddTTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4004</td><td></td></tr><tr><td>2', 3' ddCTP</td><td>Trilink Biotechnologies, CA</td><td>N4005</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dGTP, dCTP, dTTP set</td><td>Clubio, Taiwan</td><td>CB-R0315</td><td></td></tr><tr><td>SpectroCHIP array</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td>#01509</td><td></td></tr><tr><td>MassARRAY</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typer 4.0 software</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td>#10145</td><td></td></tr><tr><td>Clean Resin Tool Kit</td><td>Agena Bioscience, CA</td><td>#08040</td><td></td></tr></tbody></table>

proeflezen en dna repair assay met behulp van één nucleotide uitbreiding en maldi-tof massa spectrometrie analyse

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

De handhaving van het genoom en de trouwe replicatie is essentieel voor het behoud van de genetische informatie. Om te beoordelen HiFi replicatie, hebben we een eenvoudige niet-gelabeld en niet-radio-isotopische methode met behulp van een laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie met time-of-flight (MALDI-TOF) massa spectrometrie (MS) analyse voor een proeflezen studie. Hier, een polymerase van DNA [bijvoorbeeld het Klenow fragment (KF) van de polymerase van DNA van Escherichia coli ik (pol ik) in deze studie] in het bijzijn van alle vier dideoxyribonucleotide trifosfaat is gebruikt voor het verwerken van een niet-overeenkomende primer-template-duplex. De niet-overeenkomende primer is vervolgens proeflezen en verruimde en onderworpen aan de MALDI-TOF MS. De producten worden gekenmerkt door de massale verandering van de primer tot één nucleotide variaties. Nog belangrijker is, kan een proeflezen ook worden bepaald voor interne enkele problemen, zij het op verschillende efficiëntie. Gelegen op 2-4-nucleotiden (nt) van de 3'-eind incongruenties werden efficiënt Review door pol ik, en een mismatch op 5 nt van het eindstation van primer bleek slechts een gedeeltelijke correctie. Voor interne incongruenties gelegen op 6-9 nt vanaf de primer 3' einde plaatsvond geen proeflezen. Deze methode kan ook worden toegepast op DNA testen (bijvoorbeeld, beoordeling van de reparatie van een base-laesie van substraten voor de endo V reparatie pathway) reparatie. Inleidingen met 3' voorlaatste deoxyinosine (dI) laesies kunnen worden gecorrigeerd door pol ik. Inderdaad, voorlaatste T-ik, G-I, en A-ik substraten had hun laatste 2 dI-bevattende nucleotiden weggesneden door pol ik alvorens een juiste ddN 5'-monofosfaat (ddNMP) toe te voegen terwijl voorlaatste C-ik incongruenties werden getolereerd door pol I, waardoor de primer worden uitgebreid zonder herstellen, demonstreren dat de gevoeligheid en de resolutie van de MS assay voor het meten van de DNA-herstel.

Sjablonen en inleidingen:
Met behulp van de procedure voorgesteld hier, gelijke molaire synthetische oligonucleotide sjablonen en inleidingen van relevante sequenties die zijn verkregen uit commerciële bronnen werden gecontroleerd voor hun zuiverheid en kwaliteit (figuur 3A; opmerking dat de signalen gematched de aangewezen massa en de laag achtergrond) evenals voor de relatie tusse...

Een niet-label niet-radio-isotopische methode voor DNA-polymerase proeflezen en een DNA repair assay werd ontwikkeld met behulp van hoge-resolutie MALDI-TOF massa spectrometrie en een strategie voor de uitbreiding van één nucleotide. De test bleek te zijn van de zeer specifieke, eenvoudig, snel en gemakkelijk uit te voeren voor het proeflezen en reparatie patches korter dan 9-nucleotiden.

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van DNA-polymeren trouw en DNA-reparatie, zoals bewijsmethoden en analyse en bij het definiëren van de DNA-reparatiepatch. Het grote voordeel van deze techniek is dat het zeer specifiek, eenvoudig, snel en gemakkelijk uit te voeren is. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode het moeilijk vinden omdat ze nog steeds bezig zijn met DNA-replicatie en het reparatieveld mogelijk niet vertrouwd zijn met de massaspectrometrie-instrumentatie en de gegevensinterpretatie.Ik denk dat het belangrijkste is dat de visuele demonstratie erg belangrijk is, omdat we kunnen laten zien hoe onze commercieel ontwikkelde massaspectrometrie voor klinische toepassingen zoals mutatie en deputatie gemakkelijk kan worden aangepast voor DNA-proofreading en de reparatiestudie. Het demonstreren van de procedure zal door Rong-Syuan en Kuei-Ching afgestudeerde studenten uit mijn lab. Begin deze procedure met primer- en sjabloonvoorbereiding zoals beschreven in het tekstprotocol.Gebruik als voorbeeld een TG-mismatch van substraat P21 met T28 voor het proofreading. Verdun de P21-primer en de T28-sjabloon tot 12

proofreading-dna-repair-assay-using-single-nucleotide-extension-maldi

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in cel nucleaire lysaten. De test levert de tarieven van de DNA-reparatie-activiteit vatbaar zijn voor kinetische analyse en is aanpasbaar voor de kwantificering van DNA Repair activiteit in weefsel en tumor lysaten of met gezuiverde eiwitten.

Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Hier wordt de studie van verschillende DNA-letselsherkenningsbenaderingen via enkele molecuul AFM-beeldvorming gedemonstreerd met het nucleotide-excisiereparatiesysteem als voorbeeld. De procedures van DNA- en eiwitmonstervoorbereidingen en experimentele evenals analytische details voor de AFM-experimenten worden beschreven.

Atomic Force Microscopy Onderzoek naar DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

Een niet-gelabelde, niet-radio-isotopische methode om uracil-DNA glycosylase activiteit te testen werd ontwikkeld met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie voor directe apurine / apyrimidinische site-bevattende productanalyse. De test bleek vrij eenvoudig, specifiek, snel en gemakkelijk te gebruiken voor DNA-glycosylasemeting.

Uracil-DNA Glycosylase Assay door Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Hier beschrijven we twee modificaties van de DNA-vezeltest om enkelstrengs DNA-hiaten te onderzoeken bij het repliceren van DNA na laesie-inductie. De S1-vezeltest maakt de detectie van post-replicatieve hiaten mogelijk met behulp van het ssDNA-specifieke S1-endonuclease, terwijl de gap-filling assay visualisatie en kwantificering van gap repair mogelijk maakt.

Detectie van post-replicatieve hiaten accumulatie en reparatie in menselijke cellen met behulp van de DNA-vezeltest

MALDI-TOF werd gebruikt om fragmenten te karakteriseren die werden verkregen uit de reactiviteit tussen geoxideerd RNA en het exoribonuclease Xrn-1. Dit protocol beschrijft een methodiek die toepasbaar is op andere processen waarbij RNA en/of DNA betrokken is.

Identificatie van RNA-fragmenten als gevolg van enzymatische degradatie met behulp van MALDI-TOF-massaspectrometrie

Dit protocol beschrijft een extrachromosomale niet-homologe eindverbindingstest (NHEJ) en een homologe recombinatietest (HR) om de efficiëntie van NHEJ en HR in HEK-293T-cellen te kwantificeren.

Analyse van niet-homologe eindverbindingen en homologe recombinatie-efficiëntie in HEK-293T-cellen met behulp van op GFP gebaseerde reportersystemen

We presenteren protocollen voor de beoordeling van de vaardigheid van de dubbelstrengsbreukherstelroute in cellen met behulp van een reeks op luminescentie gebaseerde extrachromosomale reportersubstraten.

Beoordeling van de reparatieactiviteit van DNA-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Leer een snelle MALDI-TOF massaspectrometrie-methode voor DNA-proeflezen en reparatie-analyse. Deze techniek analyseert reparatie-patches korter dan 9 nucleotiden met hoge specificiteit en eenvoud.

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

Meer video's verkennen