Name: Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Leer stereotactische adoptieve overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertestmodellen van orthotopische menselijke glioblastoma multiforme xenografts. Deze methode toont de haalbaarheid en antitumorwerking van intracerebraal toegediende cellulaire immunotherapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken het personeel van het universitair ziekenhuis dier faciliteit (UTE) van Nantes voor veeteelt en zorg, de cellulaire en tissular imaging core faciliteit van de Universiteit van Nantes (MicroPICell) voor de beeldvorming en de Cytometry faciliteit (Cytocell) vanuit Nantes voor hun deskundige technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO interregionale 2017) en het Europese ERA-Net Transcan2-consortium (Immunoglio). Het team wordt gefinancierd door de Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Dit werk werd gerealiseerd in het kader van de LabEX IGO en de IHU-Cesti programma's, ondersteund door de nationale onderzoek bureau Investissements d'Avenir via de programma's ANR-11-LABX-0016-01 en ANR-10-IBHU-005, respectievelijk. Het IHU-Cesti project wordt ook ondersteund door Nantes Metropole en de regio Pays de la Loire. De auteurs bedanken Chirine Rafia voor het verstrekken van hulp bij het corrigeren van het manuscript.

De volgende procedure waarbij dierlijke onderwerpen werd uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen (overeenkomst #00186.02; regionale ethische commissie van de Pays de la Loire [Frankrijk]). Menselijke PBMCs werden geïsoleerd uit het bloed verkregen van geïnformeerde gezonde donoren (Etablissement Français du Sang Nantes, Frankrijk). Alle stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.
1. aspecifieke expansie van cytotoxische Effector T lymfocyten
<ol><li>Bereiden en bestralen feeder cellen op 35 Gy. Voor de stimulatie van 2 x 105 - 4 x 10,5 effector cellen, 10 x 106 PBMCs en 1 x 106 BLCLs uit drie verschillende, gezonde donoren te bereiden.</li>
	<li>Resuspendeer zowel feeder cellen als effector in 15 mL RPMI aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd FCS, 2 mM L-glutamine, penicilline (100 IU/mL), streptomycine (0,1 µg/mL) en 300 IU/mL recombinante IL-2 cellen.</li>
	<li>PHA-L toevoegen om een eindconcentratie van 1 µg/mL, meng zorgvuldig en distribueren van 150 µL van de celsuspensie per putje in 96-wells-platen voor U-bodem.</li>
	<li>Incubeer bij 37 ° C en met 5% CO2 in een bevochtigde sfeer.</li>
	<li>Dagelijks controleren de plaat tot grote cel samengeklonterd vorm in de cultuur-putten (~ dag 7).</li>
	<li>Spoel de cellen in een maatkolf van de cultuur bij 1 x 106 cellen/mL verse kweekmedium.</li>
	<li>De cel Totaal aantal bepalen door het tellen van (2 x per week) en handhaven op 1 x 106 cellen/mL verse kweekmedium. Opmerking: Effector immuuncellen klaar moeten zijn voor de therapeutische administratie in een rusttoestand (meestal 3 weken na de eerste amplificatie prikkel). De zuiverheid en de reactiviteit van deze effector cellen moeten worden gecontroleerd vóór de in vivo injecties (b.v.met in vitro testen).</li>
</ol>2. pre-operatieve Effector cellen voorbereiding
<ol><li>Na controle van de telling van de cel effector, verzamelen de effector cellen in een 50 mL-buis door middel van centrifugeren (300 x g gedurende 5 minuten). Opmerking: Ter compensatie voor enig verlies, bereiden een overmaat van cellen (b.v., 50 x 106).</li>
	<li>Zorgvuldig Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 15 mL steriele PBS en Centrifugeer gedurende 5 min op 300 x g uit te voeren van het wassen.</li>
	<li>Zorgvuldig en volledig Verwijder het supernatant en resuspendeer vervolgens de cel pellet in 1 mL steriele PBS.</li>
	<li>Overdracht van de geresuspendeerde cellen in een 1.5-mL microtube voor centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant door pipetteren langzaam zorgvuldig en volledig.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet cel in 8 µL van steriele PBS per muis. Opmerking: Dit is een cruciale stap.</li>
	<li>Het volume van de celsuspensie meten met behulp van een micropipet. Indien nodig, voeg steriel PBS (20 x 106 cellen in 15 µL van PBS per dosis) en meng zorgvuldig.</li>
	<li>Controleren, met behulp van een micropipet, die het eindvolume per muis tussen 15 en 20 μL (absoluut < 20 µL ligt).</li>
	<li>Houd de cellen op het ijs tot stereotactische injectie. Opmerking: meer dan 3-h timepoints werden niet getest.</li>
</ol>3. stereotactische injectie
<ol><li>
Apparatuur set-up
	<ol>
<li>Monteren en kalibreren van een klein dier stereotactische frame volgens de instructies van de fabrikant om de juistheid van intracraniële injecties (b.v., spuit de grootte, gewenste volume en snelheid van injectie). Opmerking: Een langzame infusiesnelheid wordt aanbevolen (dat wil zeggen, 2-3 µL/min).</li>
		<li>Installeer het materiaal onder een microbiële veiligheidskast (MSC) te behouden de steriliteit van de instrumenten en ter bescherming van de muizen van infecties. Opmerking: plaats "isothermische blokken" in een waterbad bij 37 ° C. Dit systeem beperkt de onderkoeling van muizen tijdens de operatie. Verwarming pads, die nodig voor post procedurele zorg zijn, moet worden gebruikt tijdens de voortdurende temperatuurbewaking.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pre-operatieve dierlijke voorbereiding
	<ol>
<li>Anesthetize een muis met een intraperitoneale injectie van ketamine (10 mg/mL) en xylazine (0,1 mg/mL), bij 10 µL/g van het lichaamsgewicht van de muis.</li>
		<li>Het uitvoeren van een teen snuifje test om ervoor te zorgen de volledige narcose en analgesie van het dier. Opmerking: Elke beweging is een indicatie van de niet-diep analgesie en, als dit het geval is, een paar minuten voordat de bewerking herhaald zijn verplicht.</li>
		<li>Zodra de muis is goed verdoofd, gebruik schaar om de vacht van de chirurgische site (tussen de twee oren, tot de neus).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pre-operatieve cel voorbereiding
	<ol>
<li>Zorgvuldig resuspendeer de cellen met een pipet (meerdere malen) vóór elke injectie om te voorkomen dat een willekeurige cel samendoen.</li>
		<li>Zorgvuldig trekken het vereiste cel schorsing volume (15-20 µL) in de 22-G-microsyringe om te voorkomen dat het streven van bubbels. Opmerking: Deze stap van de cel-laden in de microsyringe is belangrijk om te minimaliseren van de verschillen in ingespoten volumes. Herlaad cellen voor elke individuele injectie tussen procedures ter voorkoming van een willekeurige cel samendoen en om een even aantal effector cellen administratie in de cohort.</li>
		<li>Dan, plaats de injectiespuit in het aangepast-spuitpomp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedurele zorg
	<ol>
<li>Desinfecteren van de chirurgische site met swabs gedrenkt in Povidon-jodium 5% oplossing ten minste 3 x.</li>
		<li>Plaats een smerende ophthalmic zalf in de ogen van de muis om te voorkomen dat eventuele drogen van het hoornvlies.</li>
		<li>Standpunt de narcose muis op het stereotactische frame, op een warme isothermische blok bedekt met een steriele plastic wrap ter handhaving van de muis temperaturen tijdens de operatie en beperking van de sterfte. Opmerking: De neus en de tanden van de muis moeten worden op de juiste manier gepositioneerd boven de balk, tand, zodat adequate respiratoire stroom tijdens de procedure.</li>
		<li>Zodra de muis wordt geplaatst boven de bar van de tand, draai de oor bars stevig onder van de muis oren te immobiliseren van het hoofd. Opmerking: Wees voorzichtig om geen schade toebrengen aan de trommelvliezen of tot compromissen van de ademhaling.</li>
		<li>Maak een 1-2 cm middellijn Sagittaal huid incisie met een steriele schaar langs het bovenste deel van de schedel van anterior to posterior bloot van de schedel.</li>
		<li>Identificeren van het snijpunt van de Sagittaal en coronale hechtingen (Bregma) om te dienen als monumenten voor stereotactische lokalisatie vóór de injectie (afgebeeld in Figuur 1).</li>
		<li>Plaats de microsyringe boven dit punt.</li>
		<li>Verplaats de microsyringe 2 mm rechts laterale en 0,5 mm anterior van de Bregma.</li>
		<li>Maak een microdrill met een klein gaatje in de schedel met een steriele boor op vooraf bepaalde coördinaten. Wees voorzichtig blijven oppervlakkige teneinde eventuele traumatische letsel van de hersenen. Opmerking: In dit protocol, immune cellen werden ingespoten binnen een gevestigde tumor (een week na tumor cel injectie). De huid moet heropende (litteken) en de injectie wordt uitgevoerd met dezelfde coördinaten gebruikt voor de tumor cel implantatie (het gat is meestal nog aanwezig omhoog tot 2 weken na de injectie). Coördinaten werden geselecteerd voor het injecteren van de cellen van de tumor en effector in de hersenen parenchym13,14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Injectie van immuun effector cellen
	<ol>
<li>Zorgvuldig plaatst u de microsyringe in het geboorde gat en langzaam, de naald 3 mm naar beneden in de dura en vervolgens achterwaarts 0.5 mm tot een definitieve diepte van 2,5 mm vóór het injecteren van de effector cellen toekomen.</li>
		<li>De injectie van de cel effector op 2-3 µL/min uitvoeren en controleren van de muizen langs de injectie tijd.</li>
		<li>Zodra de injectie voltooid is, trekken de naald voor slechts 1 mm en bewaar de microsyringe op plaats voor één extra minuut langzaam intrekking volledig de microsyringe, ter voorkoming van lekkages van de infusie-site. Opmerking: Na het verwijderen van het dier van de stereotactische apparaat, schone onmiddellijk de injectie apparatuur voor aankomende experimenten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Post-operatieve zorg en opvolging van muis
	<ol>
<li>Het dier uit het stereotactische frame verwijderen en onmiddellijk Povidon-jodium 5% oplossing van toepassing op de site van de incisie en sluit de huid met een passende chirurgische hechtdraad.</li>
		<li>Toepassing van 2% lidocaïne gel direct op de wond en 0,15 µg/g van buprenorfine beheren door een subcutane injectie voor post procedurele analgesie.</li>
		<li>Plaats terug de narcose muis naar de kooi boven een verwarming pad ingesteld op 37 ° C te handhaven van de lichaamstemperatuur van een passende muis en om te voorkomen dat eventuele onderkoeling. Opmerking: Aparte behuizing is niet nodig.</li>
		<li>Volgen van de muis totdat het is volledig hersteld van anesthesie en overbrengen naar een kamer behuizing. Opmerking: Tot op heden, dit protocol wordt ook ondersteund als paar onvoorziene complicaties zijn opgetreden (< 5% van de geïnjecteerde muizen).</li>
		<li>Dagelijks volgen van de muizen en euthanaseren hen wanneer afnemende gezondheid symptomen worden waargenomen (b.v., gebogen houding, verminderde mobiliteit, prostration of significante lichaam gewichtsverlies [≥ 15%]).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Stupp, R., Roila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+glioma%3A+ESMO+clinical+recommendations+for+diagnosis%2C+treatment+and+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).</li>
<li>Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standards+of+care+for+treatment+of+recurrent+glioblastoma--are+we+there+yet%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet?</a> Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).</li>
<li>Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+brain+tumors%3A+regression+of+experimental+gliomas+by+adenovirus-mediated+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).</li>
<li>Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Cellular+Therapies+for+Glioblastoma+Multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme.</a> Cureus. 10 (3), e2305(2018).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+Therapy+of+Glioblastoma+in+a+Mouse+Model+Using+Exosomes+Derived+From+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells.</a> Frontiers in Immunology. 9, 824(2018).</li>
<li>Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+hope+in+immunotherapy+for+malignant+gliomas%3A+adoptive+T+cell+transfer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy.</a> Journal of Immunology Research. 2014, 326545(2014).</li>
<li>Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+cellular+immunotherapy+for+patients+with+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Developmental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma.</a> Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+of+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li>
<li>Jarry, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+administrations+of+allogeneic+human+Vgamma9Vdelta2+T+cells+efficiently+control+the+development+of+human+glioblastoma+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors.</a> Oncoimmunology. 5 (6), e1168554(2016).</li>
<li>Dutoit, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+glioblastoma+peptidome+to+discover+novel+tumour-associated+antigens+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy.</a> Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).</li>
<li>Joalland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+Increases+the+Reactivity+of+Allogeneic+Human+Vgamma9Vdelta2+T+Cells+Against+Primary+Glioblastoma+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors.</a> Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).</li>
<li>Clemenceau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+memory+alphabeta+T+lymphocytes+can+express+FcgammaRIIIa+and+mediate+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).</li>
<li>Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+implantation+with+subsequent+3D+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+murine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3403(2011).</li>
<li>Jarry, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treg+depletion+followed+by+intracerebral+CpG-ODN+injection+induce+brain+tumor+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection.</a> Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).</li>
<li>June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cell+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CAR T cell immunotherapy for human cancer.</a> Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).</li>
<li>Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T+cell+therapy%3A+An+overview+of+obstacles+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities.</a> Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).</li>
<li>Bryant, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+immunotherapeutic+potential+of+gammadelta+T-cells+in+patients+with+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).</li>
<li>Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+safety+of+allogeneic+innate+lymphocyte+therapy+for+glioma+patients+with+prior+cranial+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).</li>
<li>Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+responses+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune responses of the central nervous system.</a> Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).</li>
<li>Louveau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+of+central+nervous+system+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels.</a> Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).</li>
<li>Menei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+sustained+delivery+of+5-fluorouracil+from+biodegradable+microspheres+for+the+radiosensitization+of+glioblastoma%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study.</a> Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).</li>
<li>Menei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+implantation+of+5-fluorouracil-releasing+microspheres+in+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma.</a> Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).</li>
<li>Salot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+expansion+of+gamma+9+delta+2+T+lymphocytes%3A+Innacell+gamma+delta+cell+therapy+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product.</a> Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).</li>
<li>Bennouna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase-I+study+of+Innacell+gammadelta%2C+an+autologous+cell-therapy+product+highly+enriched+in+gamma9delta2+T+lymphocytes%2C+in+combination+with+IL-2%2C+in+patients+with+metastatic+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een adoptief overdracht van geselecteerde native of gemanipuleerde immuun effector cellen vertegenwoordigt een veelbelovende aanpak om efficiënt het behandelen van tumoren, zoals infiltratieve hersenen kanker, het verzorgen van de beperking van de reactivities tegen niet-getransformeerd cellen15, 16,17,18. Het centrale zenuwstelsel, die bestaat uit de hersenen, heeft echter een bijzondere immu...

GBM (die graad IV astrocytoom), is de meest frequente en agressieve primaire hersenenkanker bij volwassenen. GBM blijft ondanks agressieve behandelingen die een combinatie van chirurgie en radio-chemotherapie, gekoppeld aan een zeer slechte prognose (mediane overleving van 14,6 maanden en een 2-jaar-sterfte > 73%)1. Dit bewijzen dat gedurende de laatste tien jaar2paar efficiënte vooruitgang op therapeutische gebied zijn gevalideerd. Onder de kandidaten voor het ontwerp van meer effectieve therapeutische strategieën3,-4,5, worden immuuntherapie6 momenteel onderzocht om te volgen en te elimineren zeer invasieve en radio/chemo-resistant tumor cellen, verdacht voor hun belangrijke bijdrage aan de snelle en dodelijke tumor herval7. Diverse immunologische doelwit werden geïdentificeerd en voorgestelde voor immuuntherapie, waarbij natuurlijke of gewijzigde αβ of ϒδ T lymfocyten zoals GBM-specifieke tumor-antigenen of stress-geïnduceerde moleculen8,9, 10. De mogelijkheid tot het beheren van geselecteerde GBM-reactieve immuun cel effectoren vertegenwoordigt een unieke gelegenheid om verhoogde hoeveelheid effector lymfocyten leveren rechtstreeks op de site van residuele maligniteit. Ter ondersteuning van deze strategie, hebben wij onlangs aangetoond dat modellen op basis van immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic primaire menselijke GBM xenografts getrouw de ontwikkeling van hersentumoren in GBM-patiënten9,11 recapituleren. Deze modellen werden bovendien gebruikt om aan te tonen van de sterke antitumorale efficiëntie van adoptively overgedragen allogene menselijke Vϒ9Vδ2T lymfocyten.
Dit protocol beschrijft de kritische experimentele stappen voor het bereiken van stereotactische immuuntherapie van hersentumoren, zoals GBM, gebaseerd op de adoptieve overdracht van allogene T-lymfocyten. Het artikel toont: (i) de amplificatie van therapeutische allogene immuun effector T lymfocyten, zoals menselijke Vϒ9Vδ2T lymfocyten; (ii) de opstelling van deze effector T-lymfocyten voor injectie; (iii) de procedure voor de stereotactische administratie binnen de hersenen, in de buurt van de tumor. Dit artikel bevat ook inzicht in het gedrag van deze cellulaire effectoren na stereotactische injectie.
De hier gepresenteerde therapeutische benadering is gebaseerd op de injectie van 20 x 106 effector cellen per dosis voor elke brain tumor-dragende immunodeficiëntie muis. Een eerste in vitro uitbreiding stap is vereist voor de productie van grote hoeveelheden van immuuncellen. Dus, niet-specifieke cel uitbreidingen zijn uitgevoerd met behulp van phytohemagglutinin (PHA-L) en bestraalde cellen van allogene feeder: perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) van gezonde donoren en Epstein Barr Virus EBV-getransformeerd B-lymphoblastoid cel lijnen (BLCLs), door in vitro infectie met EBV-bevattende cultuur supernatant van de cellijn Hapalomys B95-8, in aanwezigheid van 1 µg/mL cyclosporin-A. PBMCs afgeleid
GBM-reactieve effector immuuncellen worden vergeleken en geselecteerd uit in vitro testen9. Deze effector cellen worden geactiveerd en gebruikt standaard protocollen, volgens hun aard (bijvoorbeeld, menselijke Vγ9Vδ2 T-lymfocyten9 of menselijke anti-herpes virus αβ T lymfocyten12) met een minimale zuiverheidsgraad van > 80%, als routinematig versterkt gecontroleerd door analyse van de cytometrische. De cel expansie procedure hieronder geldt voor de diverse menselijke lymfocyt deelverzamelingen.

<table><tbody><tr><td>PBMCs</td><td></td><td></td><td>van 3 verschillende gezonde donoren</td></tr><tr><td>BLCLs</td><td></td><td></td><td>van 3 verschillende donoren</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>penicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>proleukin</td><td></td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>Sigma</td><td>L4144</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxisch frame</td><td>Stoelting Co.</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Muisadapter voor stereotaxisch frame&nbsp;&nbsp;</td><td>Stoelting Co.</td><td>51624</td><td></td></tr><tr><td>microsyringe pomp injector&nbsp;</td><td>WPI</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil Spuit</td><td>WPI</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>NSG muizen</td><td>Charles River</td><td>NSGSSFE07S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Merial</td><td>Imalg&egrave;ne 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td>Rompur 2%</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>WPI</td><td>201758</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>WPI</td><td>501215</td><td></td></tr><tr><td>OmniDrill 115/230V</td><td>WPI</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP397H</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine</td><td>Astrazeneca</td><td>3634461</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van orthotopic mens glioblastoma multiforme xenografts

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), de meest frequente en agressieve primaire hersenenkanker in volwassenen, is over het algemeen geassocieerd met een slechte prognose en schaarse efficiënte therapieën zijn voorgesteld in het afgelopen decennium. Onder de veelbelovende kandidaten voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische strategieën, cellulaire immuuntherapie zijn doelwit geweest om te elimineren zeer invasieve en chemo-radioresistant tumorcellen, waarschijnlijk betrokken in een snelle en dodelijke terugval van deze vorm van kanker. Dus, haveninterfaces van allogene GBM-reactieve immuun cel effectoren, zoals menselijke Vϒ9Vδ2 T-lymfocyten, in de nabijheid van de tumor zou Hiermee geeft u een unieke kans om het leveren van efficiënte en hooggeconcentreerde therapeutische agenten rechtstreeks in de site van hersenen maligniteiten. Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een preklinisch bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van deze cellulaire immuuntherapie die afhankelijk zijn van stereotactische injecties van allogene menselijke lymfocyten binnen intrabrain tumor bedden.

Deze studie beschrijft de strategie voor de adoptieve overdracht van cellulaire immuun effector cellen binnen de hersenen van tumor-uitvoering muizen, op basis van stereotactische injecties uitgevoerd rechtstreeks in het bed van de tumor.
Om elk risico van hersenletsel die is gekoppeld aan een grote geïnjecteerde volume, moet de effector celsuspensie worden geconcentreerd (20 x 106 cellen in 15-20 µL van PBS). Om te c...

Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding en het stereotaxic beheer van allogene menselijke lymfocyten in immunodeficiëntie muizen uitvoering orthotopic menselijke primaire hersentumoren. Deze studie biedt een bewijs-van-concept voor zowel de haalbaarheid en antitumorale werkzaamheid van cellulaire immuuntherapie intrabrain-geleverd.

Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

Glioblastoma multiforme blijft de meest voorkomende en agressieve primaire hersentumor bij volwassenen. Ondanks agressieve behandelingen op basis van chirurgie gevolgd door radio- en chemotherapie, wordt GBM geassocieerd met een extreem slechte prognose en een mediane overlevingstijd van minder dan 15 maanden. Aangezien er in het afgelopen decennium weinig therapeutische vooruitgang is geboekt, worden momenteel cellulaire immunotherapieën onderzocht om hoog-invasieve en resistente GBM-cellen te elimineren die waarschijnlijk betrokken zijn bij snelle tumorrecidieven.Toediening van geselecteerde GBM-reactieve cytotoxische immunofactoren in de nabijheid van de tumor zou een unieke kans kunnen zijn om geconcentreerde cellulaire immunotherapie rechtstreeks in het gebied van resterende maligniteit af te geven. Onze groep toonde onlangs aan dat immunodeficiënte NSG-muizen die orthotopisch primaire humane GBM-xenograft dragen, GBM herhalen tot meer ontwikkeling bij patiënten. Deze GBM-modellen werden gebruikt om de werkzaamheid van cytotoxische immuuneffectoren bij intratumorale injecties te evalueren.Dit protocol beschrijft ons therapeutisch proces op basis van eerst de isolatie en amplificatie van GBM-reactieve immuuneffectorcellen. Ten tweede, de propagatie van deze effectorcellen voor intracraniële injectie. En ten derde, hun stereotactische injectie op de tumorlocatie in de muizenhersenen.Het gedrag van de immuuneffector na orthotopische injectie werd ook onderzocht. Drie weken na PHA foetusstimulatie zouden effectorcellen, die celklonten vormen op de bodem van de fles, zijn teruggekeerd naar de rusttoestand en zijn klaar om te worden gebruikt. Na controle van het aantal effectorcellen, resuspendeer en verzamel cellen in een 115 milliliter buis en centrifugeer ze.Verwijder voorzichtig en volledig een supernatant. En resuspendeer cellen in steriele PBS en centrifugeer om ze te wassen. Verwijder voorzichtig en volledig het supernatant.En resuspendeer cellen vervolgens in één milliliter steriele PBS. Breng cellen over in een microbuis voor centrifugatie. Neem weer voorzichtig en volledig het supernatant door middel van pipetteren langzaam af.De volgende stap is kritiek, resuspendeer cellen in de helft van het uiteindelijke volume steriele PBS en homogeniseer zachtjes en voorzichtig. Controleer het uiteindelijke volume met een micropipet, het uiteindelijke volume per muis moet tussen de 15 en 20 microliter zijn voor 20 miljoen cellen. Zorg ervoor dat het niet meer dan 20 microliter per muis zal overschrijden.Houd cellen op ijs tot injectie. Zorg ervoor dat het dier voldoende is geanesthetiseerd door een teenprik en verwijder vervolgens het haar van de operatielocatie, tussen de twee oren en tot aan de neus. Resuspendeer cellen langzaam om celklontering te voorkomen en laad de celsuspensie voorzichtig in de spuit op om de aanwezigheid van luchtbellen te vermijden.Plaats vervolgens de spuit in de aangepaste spuitpomp. Desinfecteer de operatielocatie met zout en povidone jodium 5% oplossing en plaats een smerende oftalmische zalf in de ogen van de muis om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Plaats vervolgens de geanesthetiseerde muis op het stereotactische frame op een warm blok.Positioneer de neus en tanden van de muis op de juiste plaats boven de tandenbalk. Trek de oorbeugels stevig vast in de oren van de muis om het hoofd te immobiliseren. Wees voorzichtig om de trommelvliezen niet te beschadigen, de ademhaling niet te compromitteren en zorg ervoor dat het hoofd goed geïmmobiliseerd is.Maak een middenlijn sagittale huidsnede met steriele schaar langs het bovenste deel van de schedel om de schedel bloot te leggen. Identificeer de kruising van de sagittale en coronale structuren om als oriëntatiepunten voor stereotactische lokalisatie te dienen, en plaats de spuit boven dit punt. Beweeg de spuit naar vooraf bepaalde coördinaten.Twee millimeter rechts lateraal en 0,5 millimeter anterior van de Gebruik een microboor om een klein gaatje in de schedel te maken met een steriele boortje. Wees voorzichtig om oppervlakkig te blijven om hersenletsel te voorkomen. Steek de spuit voorzichtig in het geboorde gat.Beweeg de naald langzaam drie millimeter naar voren in de duur en vervolgens 0,5 millimeter naar achteren tot een einddiepte van 2,5 millimeter voor celinjectie. Laat de celinjectie gedurende twee of drie microliter per minuut lopen en controleer de muizen gedurende de hele injectietijd. Zodra de injectie voltooid is, trek de naald slechts één millimeter terug en houd de spuit nog een minuut op zijn plaats voordat u de spuit langzaam volledig terugtrekt om lekkage uit de infusieplaats te voorkomen.Verwijder het dier voorzichtig uit het stereotactische frame. Sluit de huid met een geschikte chirurgische hechting en breng 2% Lidocaine-gel direct op de wond aan. Breng de geanesthetiseerde muis over naar zijn respectieve kooi boven een verwarmingskussen ingesteld op 37 graden Celsius om de juiste lichaamstemperatuur van de muis te handhaven tot volledige herstel van de anesthesie.Aangezien de suspensie zeer geconcentreerd is, werden de celviabiliteit en reactiviteit gecontroleerd. Effectorcellen werden geladen in de spuit om injectie in vivo te simuleren. Cellen werden onmiddellijk of 10 minuten later verzameld en werden geanalyseerd door middel van flowcytometrie voor propidiumjodidekleuring.Zoals u kunt zien, hebben de voorbereiding en het laden de levensvatbaarheid van effectorcellen na 24 uur niet beïnvloed. De reactiviteit tegen Glioblastoma-tumorcellen werd ook gecontroleerd met behulp van onbereidde cellen of effectors die drie uur op de ogen waren gebleven. Reactiviteit wordt gecontroleerd door positieve kleuring van de activeringsmarker CD107A.Deze resultaten laten zien dat de reactiviteit van effectorcellen niet werd beïnvloed door de voorbereiding. Zeven dagen na injectie van effectorcellen werden de hersenen van de muizen verzameld, gesneden en gekleurd voor hematologische kleuring om de identificatie van de tumorstructuur mogelijk te maken. Vervolgens maakte anti-menselijke CD3-kleuring de lokalisatie van effectorcellen mogelijk.Interessant genoeg werden effectorcellen gevonden rond de tumor en in het tumorkern, maar ook in het

stereotactic-adoptive-transfer-cytotoxic-immune-cells-murine-models

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een geïntegreerde methode voor de exacte, stereotactische implantatie van menselijke glioblastoma multiforme cellen in de hersenen van muizen en vervolgens naakt...

Stereotactische Intracraniale Implantatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging van tumorxenograften in een Muis Model Systeem van glioblastoma multiforme

This video demonstrates a stereotaxic injection technique for administering human effector T lymphocytes into a murine model carrying a human brain tumor. Upon positioning a tumor-bearing anesthetized mouse on a stereotactic frame and creating a burr hole at the injection location on the skull, effector T lymphocytes are injected at the tumor site.

Delivering Effector T Lymphocytes into Mice Carrying Human Brain Tumors

Kwaadaardige gliomen vormen een heterogene groep van zeer infiltratieve gliane neoplasmata met duidelijke klinische en moleculaire kenmerken. Primaire orthotopische xenograften heroveren de histopathologische en moleculaire kenmerken van kwaadaardige glioomsubtypes in preklinische diermodellen.

Primaire orthotopische glioom xenograften recapituleren infiltratieve groei en isocitraat dehydrogenase I mutatie

Fenotypisch wild-type astrocyten en neurale stamcellen die zijn geoogst uit muizen die zijn gemodificeerd met gefloxte, conditionele oncogeen allelen en getransformeerd via virale Cre-gemedieerde recombinatie, kunnen worden gebruikt om de pathogenese van astrocytomen in vitro en in vivo te modelleren door orthotopische injectie van getransformeerde cellen in hersenen van syngene, immuuncompetente nestgenoten.

Modeling Astrocytoom Pathogenese In Vitro En In Vivo Met behulp van corticale Astrocyten of neurale stamcellen uit Conditional, genetisch gemanipuleerde muizen

De hersenen is een unieke site met eigenschappen die niet goed weergegeven door in vitro of ectopische analyses. Orthotopische muismodellen met reproduceerbare ligging en groei-eigenschappen op betrouwbare wijze kan worden gemaakt met intracraniële injecties met een stereotaxisch fixatie instrument en een lage druk spuit pomp.

Creëren Anatomisch nauwkeurige en reproduceerbare Intracranial Xenograften van Human hersentumoren

De lymfodeletieve en immunomodulerende effecten van chemotherapie en stralingsstandaardzorg kunnen worden benut om de antitumor-effectiviteit van T-celimmunotherapie te verbeteren. We schetsen een methode voor het genereren van EGFRvIII-specifieke chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen en het toedienen ervan in de context van glioblastoma standaardzorg.

Generatie van de CAR T-cellen voor adoptieve Therapie in de context van glioblastoma Standard of Care

Tumor-zoekende therapeutische mesenchymale stamcellen (MSCs) tonen belofte als een behandeling voor invasieve glioblastoma. Optimale transplantatie gaat om levering van MSCs in de holte van de resectie tumor op steigers. Hier, preklinische technieken om te studeren MSC behandeling van glioblastoma zijn geleverd inclusief: afbeelding-geleide tumor resectie; implantatie van MSC-geplaatste steigers; en postoperatieve therapie volgen.

Image-Guided resectie van Glioblastoma en intracraniële implantatie van therapeutische stamcel-geplaatste steigers

Hier beschrijven we een preklinisch orthotopisch muismodel voor GBM, vastgesteld door intracraniële injectie van cellen afgeleid van genetisch gemanipuleerde muismodeltumoren. Dit model toont de ziektekenmerken van menselijke GBM. Voor translationele studies wordt de hersentumor van de muis gevolgd door in vivo MRI en histopathologie.

Translationele orthotopische modellen van glioblastoom multiforme

De ontwikkeling van orthotope pediatrische hersentumormodellen vereist nauwgezette precisie, waarbij een stereotactisch apparaat wordt gebruikt om kankercellen nauwkeurig te implanteren. De hier gepresenteerde methodologie schetst de stappen die betrokken zijn bij het voorbereiden van hersentumorcellen, het uitvoeren van intracraniële injecties en het implementeren van een postoperatief monitoringsysteem om implantatie van hersentumoren te beoordelen.

Opstelling van orthotope patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen voor hersentumoren met behulp van een stereotactisch apparaat

Glioblastoom is een verwoestende vorm van primaire hersenkanker en interstitiële thermische lasertherapie is in opkomst als een veelbelovend alternatief voor conventionele chirurgische resectie voor inoperabel glioblastoom. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerd preklinisch muismodel dat kan worden gebruikt om behandelingseffecten of adjuvante en combinatorische behandelingen te bestuderen.

Een immunocompetent muizenmodel voor laser interstitiële thermische therapie van glioblastoom

Het doel van dit protocol is om onderzoekers een zeer reproduceerbare techniek te bieden voor intracraniële implantaties.

Stereotactische intracraniële implantatie van door de patiënt afgeleide xenograftcellijnen van de glioblastoom bij muizen

Leer stereotactische adoptieve overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertestmodellen van orthotopische menselijke glioblastoma multiforme xenografts. Deze methode toont de haalbaarheid en antitumorwerking van intracerebraal toegediende cellulaire immunotherapieën.

Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts (Video) | JoVE Journal

Stereotactische adoptief overdracht van cytotoxische immuuncellen in lymfkliertest modellen van Orthotopic mens Glioblastoma Multiforme Xenografts

Meer video's verkennen