Isometrische Contractility meting van de muis mesenterische slagader met behulp van draad Myography

Ons lab gebruikt de draadmyograph-methode al vele jaren om de contractiliteit van vasculair glad spierweefsel te meten. We gebruiken deze techniek om het mechanisme van glad spiercontractie te bestuderen. We gebruiken deze methode om nieuwe medicijnen voor hypertensietherapie te verkennen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het vaatsegment ten minste vier uur na montage overleeft en de contractiliteit geïnduceerd door hoge kalium gedurende vele keren behoudt. Het meerkanaalssysteem biedt de mogelijkheid voor hoge screeningstherapie van nieuwe medicijnen. Prik het lichaam van de geëuthanasieerde muis met de buik omhoog en bevochtig de buik met 70% ethanol.

Snijd vervolgens met een schaar de huid langs de ventrale middenlijn vanaf de lies en maak insnijdingen langs elk been vanaf het begin van de eerste insnijding. Trek de huid aan beide zijden terug en maak vervolgens soortgelijke insnijdingen om het peritoneum te openen. Gebruik vervolgens een schaar om de slokdarm, colon en andere bindweefsels te snijden om de gastro-intestinale tractus met voedingsvaten volledig te isoleren van het lichaam.

Nadat het bloed uit het maagdarmkanaal is gespoeld met HEPES-Tyrode of H-T oplossing, brengt u het geïsoleerde segment over in een gecoate petrischaal voor dissectie van de mesenteriale ader bij kamertemperatuur. Strijk het maagdarmkanaal, jejunum, ileum en cecum in wijzerzin glad en prik de maag en cecum respectievelijk aan de linker- en rechterkant vast. Schakel de transmissielichtbron van een stereoscopische microscoop in en fixeer de darm met pinnen om de gedissecteerde mesenteriale aders bloot te leggen.

Klem vervolgens de vetweefsels rond de aders met een pincet en isoleer de aders voorzichtig door alle bindweefsels af te snijden met dissectiescharen. Pak een overtollige ader met een pincet en breng en dompel de mesenteriale aderboom in koud calcium-ion-vrije H-T oplossing. Snijd een 1,4 millimetergedeelte van de ader af dat dichterbij de darmwand van een mesenteriale boog ligt en gebruik twee pincetten om beide kanten van dit aardeldaadwerktuig voorzichtig open te maken.

Bereid twee segmenten van roestvrij staaldraad van 2,5 centimeter lengte en plaats ze in dezelfde schaal. Gebruik een pincet om een van de uiteinden van de ader voorzichtig vast te klemmen. Gebruik vervolgens een ander pincet om voorzichtig twee draden een voor een in het lumen van de ader te steken.

Zorg ervoor dat de draden recht zijn en niet het endotheel raken. Klem beide draden buiten het gedraaide vat tegelijkertijd vast met twee pincetten en breng het vat voorzichtig van de petrischaal over naar een myographkamer gevuld met H-T oplossing. Schroef de kaken van de kamer uit elkaar om ruimte te maken voor montage, pak vervolgens beide kanten van een van de twee ingebrachte draden vast met twee pincetten en plaats het vat in de kakengaat.

Wikel beide kanten van de geklemde draad rond de schroeven van de kaak die verbonden is met de micrometer. Fixeer de linkse schroef door draaiend met de klok mee vast te zetten. Gebruik vervolgens een pincet om de draad recht te trekken.

Bevestig vervolgens de rechte schroef door draaiend met de klok mee vast te zetten. Zorg ervoor dat het vat altijd binnen de kakengaat is, maar de kaak niet raakt om beschadiging te voorkomen. Sluit de twee kaken met behulp van de micrometer.

Zorg ervoor dat de twee kaken dicht genoeg bij elkaar staan, maar dat ze elkaar niet raken, en dat de ongefixeerde draad zich boven de gefixeerde draad bevindt. Vouw de ontgrendelde draad voorzichtig op de hoek van de kaak verbonden met de krachtsensor en wikkel deze met de klok mee rond de rechte schroef. Fixeer vervolgens de schroef.

Herhaal het ontvouwen en wikkelen van de linkerkant van de draad en fixeer de linker schroef. Beweeg vervolgens de kaken iets uit elkaar zonder het vat te strekken door de micrometer voorzichtig te draaien, zodat de opening tussen de twee kaken net de twee draden kan herbergen. Gebruik vervolgens een pincet om de draad aan de micrometerkant naar het horizontale vlak van de draad aan de zijde van de krachtsensor te verplaatsen.

Na montage van aders in de andere kamers, verbindt u alle kamers met de apparatuur en dekt de kamers af. Sluit de 100% zuurstoftoevoer en een temperatuursonde aan en begin met verwarmen tot 37 graden Celsius. Open de kaartsoftware.

Druk op de 'Start'-knop om te beginnen met opnemen. Selecteer het gewenste kanaal vanuit het DMT-menu om het DMT-normalisatie venster voor het overeenkomstige kanaal te openen. Voer de volgende constante waarden in het venster in: Weefsel eindpunten a1, 0,1; Weefsel eindpunten a2, 4; Draaddiameter, 40.

Het venster geeft vervolgens de berekende vaatlengte weer als 1,40 millimeter. Lees de micrometer van de juiste weefselkamer. Voer de waarde in het micrometer leesvak in en klik op de knop 'Punt toevoegen'.

Deze waarde is de beginwaarde van X. Na een vertraging van 60 seconden, geeft het venster de kracht en de effectieve druk weer die overeenkomt met deze micrometerwaarde. Tegelijkertijd wordt het micrometer leesvak actief. Trek aan het vat dat wordt genormaliseerd door de micrometer tegen de klok in te draaien.

Voer de micrometerwaarde in het micrometer leesvak in en klik op de knop 'Punt toevoegen'. Wacht opnieuw 60 seconden. Blijf het vat strekken en voeg micrometerwaarden toe totdat het venster de waarde van micrometer X-een weergeeft, dat is de berekende micrometerinstelling die vereist is om het vat tot zijn IC-een te strekken.

Stel de micrometer in op de X-een waarde. Na normalisatie, brengt u het vat in de kamer in evenwicht gedurende 15 tot 20 minuten. Eenmaal in evenwicht, daagt u het vat uit met een hoge kaliumoplossing door de H-T oplossing te vervangen door 5 milliliter hoge kaliumoplossing om contractie gedurende 10 minute