Name: Op SA-β-galactosidase gebaseerde screeningstest voor de identificatie van Senotherapeutische geneesmiddelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Leer een high-throughput screeningsmethode voor senotherapeutische geneesmiddelen die senolytica en senomorfica onderscheidt via SA-beta-Galactosidase-detectie in senescente cellen. Deze techniek identificeert veelbelovende verbindingen voor ouderdomsgerelateerde ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NIH grants AG043376 (project 2 en Core A, PDR; Project 1 en Core B, LJN) en AG056278 (project 3 en Core A, PDR; en project 2, LJN) en een subsidie van de Glenn Foundation (LJN).

Het gebruik van dieren werd goedgekeurd door de Commissie voor institutionele dierenverzorging en-gebruik in de Scripps Florida.
1. generatie van senescentie-embryonale fibroblast (MEF) – 12-15 dagen
<ol><li>Isoleer wild type en Ercc1-/- mefs van zwangere vrouwelijke muizen op embryonale dag 13 (E13) zoals eerder beschreven33. Opmerking: alle volgende stappen worden uitgevoerd in een weefselkweek kap onder aseptische omstandigheden en met behulp van steriele instrumenten.</li>
	<li>Sla het embryo hoofd boven de ogen.</li>
	<li>Verwijder het rode weefsel (hart en lever) en gebruik ze indien nodig voor genotypering.</li>
	<li>Bereid 500 mL van een 1:1 mengsel van Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) en ham F10 met 10% foetaal runderserum, 1x niet-essentiële aminozuren, penicillaire, en streptomycine als groei medium en verwarm het tot 37 °C gedurende ongeveer 15 minuten voor elk gebruik. Bewaar het groeimedium bij 4 °C.</li>
	<li>Incuberen de rest van het embryo met 0,25% trypsine/EDTA gedurende 10 min.</li>
	<li>Gehakt het embryo in stukjes van 1 mm en Pipetteer het weefsel meerdere malen op en neer.</li>
	<li>Voeg 10 mL groeimedium en plaat weefsels toe van één embryo per 10 cm diameter celkweek plaat (passage 0).</li>
	<li>Cultiveer cellen bij 37 °C, 3% O2,5% co2. Opmerking: alleen MEF-cellen worden onder deze omstandigheden aan niet-gecoate weefsel cultuurplaten gehecht.</li>
	<li>Verander het medium elke dag in passage 0 om niet-bijgevoegde weefsel-en celfragmenten te verwijderen. Let op: afhankelijk van de grootte van het embryo en de kwaliteit van de isolatie, bereiken cellen meestal confluentie na 2 tot 3 dagen.</li>
	<li>Trypsinoisatie<ol>
<li>Verwijder het groeimedium voorzichtig en spoel de cellen tweemaal met 10 mL 1x PBS.</li>
		<li>Voeg 2 mL van een 0,025% trypsine/EDTA-oplossing toe aan de cellen in platen met een diameter van 10 cm en inincuberen bij 37 °C gedurende 2-3 min.</li>
		<li>Zorg ervoor dat cellen worden losgekoppeld van het oppervlak door de cellen onder de Microscoop te inspecteren.</li>
		<li>Beëindig trypsine-spijsvertering door dezelfde hoeveelheid groeimedium toe te voegen.</li>
		<li>Breng de cellen naar een conische buis en centrifugeer cellen gedurende 3 minuten bij 200 x g en gooi het supernatant weg.</li>
		<li>Respendeer cellen zorgvuldig in vers groeimedium, Tel cellen en zaai ze in nieuwe platen bij de geprojecteerde celdichtheid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor niet-senescentie-subteelt gesplitste confluente cellen 1:4 en verleng voor een andere passage bij 3% O2, 37 °c om meer cellen te leveren (passage 1). Opmerking: op dit punt kunnen de cellen ofwel worden gehandhaafd in cultuur of opgeslagen voor later gebruik in vloeibare stikstof, in cryoflesjes bevattende ongeveer 1.000.000 cellen. Deze stap biedt ook de mogelijkheid om een gemengde partij cellen van verschillende dieren te genereren om de variabiliteit te verminderen die afkomstig is van individuele dier analyses.</li>
	<li>Voor het opwekken van celsenescentie, zaad splitsen confluente cellen uit passage 1 in een verhouding van 1:4 en inbroed ze bij 20% O2, 37 °c, 5% Co2 voor 3 dagen; Deze cultuuromstandigheden zijn atmosferisch voor zuurstof. Opmerking: de teelt van cellen en blastocysten onder omgevings zuurstofconcentraties kan markers van cellulaire senescentie specifiek verheffen wanneer DNA-schade herstel is aangetast34,35,36.</li>
	<li>Herhaal deze procedure voor nog 2 passages.</li>
	<li>Om cellulaire senescentie te bewaken, meet u de geleidelijke toename van de celdiameter en het celvolume tijdens elke trypsinisatie stap met behulp van een geavanceerd Coulter-celtellingssysteem.</li>
	<li>Beoordeling van de vermindering van de celproliferatie door bepaling van de populatieverdubbeling (PD) met behulp van de vergelijking PDT = (t2-t1)/3,32 x (log n2 – log n1) Opmerking: de verdubbelingstijd van de populatie werd alleen gebruikt voor niet-senescentie cellen.</li>
	<li>Gebruik vroege passage wild-type of Ercc1-/- MEF cellen die werden gehouden op 3% O2, 37 ° c, 5% Co2 als niet-senescentie controle cellen.</li>
</ol>2. senescentie geassocieerde β-gal screening assay – 2-3 dagen
<ol><li>Bereid 10 mM stockoplossingen in DMSO van alle geneesmiddelen te testen en op te slaan aliquots bij-80 °C. Niet bevriezen-ontdooien stockoplossingen omdat dit de activiteit van drugs kan verminderen. Opmerking: hier werd de HSP90 inhibitor 17DMAG gebruikt als een senolytisch medicijn dat specifiek de senescentie cellen17kan doden.
</li>
	<li>Op de dag van het experiment de aliquot ontdooien, de geneesmiddelen in vers kweekmedium verdunnen en toevoegen aan de cellen met geconditioneerd medium bij een verhouding van 1:1 om de uiteindelijke concentratie in het groeimedium te leveren.</li>
	<li>Gebruik 96-goed voorverdunnings platen voor seriële verdunningen en combinaties van geneesmiddelen. Opmerking: voor MEF cellen, het was empirisch bepaald dat DMSO concentraties niet meer dan 2% en controle cellen behandeld met de hoogste DMSO concentraties gebruikt moeten worden opgenomen in elke run.</li>
	<li>Zaad 5 x 103 senescentie cellen of 3 x 103 niet-senescentie cellen per put in 96 goed platen ten minste 6 uur vóór de behandeling in 100 μL groeimedium en incuberen bij 20% O2, 37 °c, 5% Co2. Opmerking: cellen moeten ongeveer 80% Confluent Health zijn vóór de behandeling.
</li>
	<li>Gebruik zwarte muur/Clear bottom weefselcultuur, behandelde 96 goed platen te minimaliseren fluorescerende signaal overspraak en achtergrond. Opmerking: echter, duidelijke platen zijn ook met succes getest.</li>
	<li>Voeg geneesmiddelen verdunningen toe aan de MEF-cellen en incuberen gedurende 24 uur tot 48 uur onder 20% O2, 37 °c, 5% Co2 -condities.</li>
	<li>Houd niet-senescentie cellen onder 3% O2, 37 °c, 5% Co2 voorwaarden.</li>
	<li>Voor lysosomale alkalisatie, bereid een 10 mM bafilomycine a1 oplossing, aliquot en bewaren bevroren bij-20 °C.</li>
	<li>Voor de fluorescentie analyse van de SA-β-gal activiteit, bereid een 2 mM C12FDG stamoplossing, bewaren bij-20 °c, en beschermen tegen licht.</li>
	<li>Voor de werkoplossing, bereid 100 μM C12FDG in groeimedium op de dag van het experiment. Opmerking: alle (incubatie) stappen met betrekking tot C12FDG moeten in het donker worden uitgevoerd.</li>
	<li>Verwijder de geneesmiddel oplossing en spoel de cellen 1 keer met 100 μL van 1x PBS.</li>
	<li>Induceren lysosomale alkalisch door het voorbehandelen van cellen met 90 μL van een 100 nM bafilomycine a1 oplossing bereid in verse celkweekmedium gedurende 1 uur bij 20% O2, 37 °c, 5% Co2.</li>
	<li>Voeg 10 μL 100 μM C12FDG-werkoplossing toe aan het kweekmedium (eindconcentratie 10 μM).</li>
	<li>Incuberen cellen gedurende 2 uur.</li>
	<li>Voeg 2 μL van een 100 μg/mL Hoechst 33342 (eindconcentratie 2 μg/mL) toe aan de kweek en inincubatie gedurende 20 min.</li>
	<li>Verwijder de media en voeg 100 μL vers groeimedium toe.</li>
</ol>3. kwantitatieve High-content fluorescerende beeldanalyse
<ol><li>Gebruik een high content fluorescerende beeld acquisitie-en analyseplatform om fluorescerende beelden van de cellen in de twee kanalen te verkrijgen die geschikt zijn voor het vangen van Hoechst en C12FDG fluorescentie (bijvoorbeeld DAPI-en FITC-kanaal voorinstellingen). Opmerking: acquisitie protocollen vereisen de definitie van verschillende variabelen die specifiek zijn voor de assay. Het doel van een acquisitie protocol is het vastleggen van een toereikend aantal in-focus fluorescerende afbeeldingen van voldoende aantallen cellen voor downstreamkwantitatieve analyse.</li>
	<li>Een geschikt analyse protocol ontwikkelen door elk kanaal te selecteren en door een of meer selectieve criteria aan te passen, wat wordt aangemerkt als een functie van belang in elk kanaal.<ol>
<li>Voor de Nucleus, gebruik zo segmentatie pre-sets (bijv. nucleaire segmentatie, blaasje segmentatie, cytoplasma segmentatie) dat zal de identificatie van cellulaire organellen op basis van meerdere criteria, met inbegrip van morfologie, grootte, en signaal Intensiteit. Pas deze criteria aan om kernen op te nemen, met uitzondering van kern fragmenten en puin die een signaal kunnen hebben, maar die bijvoorbeeld te groot of te klein zijn om kernen te zijn.</li>
		<li>Controleer het signaal in het FITC-kanaal dat fluorescentie is van gesplitst C12FDG en vertegenwoordigt de hoeveelheid senescentie-geassocieerde β-galactosidase-activiteit in de cellen. Opmerking: de senescentie cellen hebben een hogere, met senescence geassocieerde, β-galactosidase-activiteit dan niet-zenucerende cellen; C12FDG fluorescentie zal echter niet-discrete en ononderbroken zijn, waardoor een drempel moet worden vastgesteld tussen wat wordt beschouwd als een c12FDG-positief en een c12FDG-negatieve cel.</li>
		<li>Met behulp van commercieel verkrijgbare analytische software, het genereren van een aantal exemplaren waarin een gedefinieerd gebied rond de Nucleus (een veronderstelde cel) heeft overlappende ten minste één keer met een bovendrempel C12FDG. Opmerking: de analytische software genereert automatisch een telling met behulp van target Linking. Dit is de praktische definitie van de bepaling van een senescentie-, C12-FDG-positieve cel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyseer alle monsters in drievlaat met 3-5 velden per put en gemiddelde waarden en standaarddeviaties die dienovereenkomstig worden berekend.</li>
	<li>Bereken het percentage van de senescentie cellen met de volgende formule: Senescentie cellen (%) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58133/58133eq1.jpg"> = x 100</li>
</ol>4. validatieparameters voor assay
<ol><li>Voor alle monsters werden de intra-en inter-assay coëfficiënt van variaties (% CVs) berekend aan de hand van de volgende formule: Intra-assay CV (n = 10 herhalingen gemeten in één experiment) = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58133/58133eq2.jpg"> x 100 (%) Inter-assay CV (n = 5 onafhankelijke experimenten) = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58133/58133eq2.jpg"> x 100 (%)</li>
	<li>Voor screeningdoeleinden, bepaal de Z ' waarde, een statistische parameter om de kwaliteit van een test te evalueren, uit cellen behandeld met 200 nM rapamycine gedurende 24 uur bij 20% O2, 37 °c, 5% Co2 (een positieve controle op senotherapeutische geneesmiddelen) en onbehandeld senescentie cellen (negatieve controle). NB: de Z ' waarde werd berekend volgens Zhang et al.37. Z ' waarden tussen 0,5 en 1 geven aan dat een test kan worden gebruikt voor de screening van geneesmiddelen.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

SA-β-Gal is een goed gedefinieerde biomarker voor cellulaire senescentie die oorspronkelijk werd ontdekt door Dimri et al. (1995) waaruit blijkt dat senescentie menselijke fibroblasten de activiteit van SA-β-gal hebben verhoogd bij een aanval op pH 623 in vergelijking met prolifererende cellen. Ondertussen zijn in vitro en in vivo analyse voor sa-β-gal vastgesteld voor verschillende celtypen en weefsels25,39,<sup class=...

Cellulaire senescentie werd voor het eerst beschreven door Leonard Hayflick en Paul Moorhead, die liet zien dat normale cellen een beperkt vermogen hadden om te vermenigvuldigen in cultuur1. Senescentie cellen niet te vermenigvuldigen ondanks de aanwezigheid van voedingsstoffen, groeifactoren en gebrek aan contact remming, maar blijven metabosch actief2. Dit fenomeen staat bekend als replicatief senescentie en werd voornamelijk toegeschreven aan de telomeer verkorting, althans in menselijke cellen3. Verdere studies hebben aangetoond dat cellen ook kunnen worden geïnduceerd om senescentie te ondergaan in reactie op andere stimuli, zoals oncogene stress (oncogene geïnduceerde senescentie, OIS), DNA-beschadiging, cytotoxische geneesmiddelen of bestraling (stress geïnduceerde senescentie, SIS)4 , 5 , 6. als reactie op DNA schade, met inbegrip van telomeer erosie, cellen ofwel senesce, start ongecontroleerde celgroei, of ondergaan apoptosis als de schade niet kan worden hersteld. In dit geval, cel senescentie lijkt te zijn gunstig als het werkt in een tumor suppressieve manier2. In tegenstelling, senescentie wordt verhoogd met veroudering als gevolg van de accumulatie van cellulaire schade met inbegrip van DNA-schade. Aangezien senescentie cellen cytokines kunnen afscheiden, matrixmetalloproteïnases en groeifactoren, aangeduid als de senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (sasp), deze leeftijd afhankelijke toename van cellulaire senescentie en sasp draagt bij aan verminderde weefselhomeostase en vervolgens veroudert. Ook is deze leeftijdsafhankelijke toename van de senescentie last bekend voor het opwekken van metabole ziekten, stress gevoeligheid, Progeria syndromen en verstoorde genezing7,8 en is, deels, verantwoordelijk voor de talrijke leeftijdsgebonden ziekten, zoals atherosclerose, artrose, gespierde degeneratie, zweervorming, en de ziekte van Alzheimer9, 10,11,12,13. Het elimineren van senescentie cellen kan helpen om weefsel disfunctie te voorkomen of vertragen en healthspan14uit te breiden. Dit is aangetoond in transgene muismodellen14,15,16 en door gebruik te maken van senolytische geneesmiddelen en combinaties van geneesmiddelen die werden ontdekt door zowel de screening van de drug en bioinformatische analyse van trajecten specifiek geïnduceerd in de senescentie cellen17,18,19,20,21,22. Het identificeren van meer optimale senotherapeutische geneesmiddelen, in staat om de senescentie-celbelasting effectiever te verminderen, is een belangrijke volgende stap in de ontwikkeling van therapeutische benaderingen voor gezonde veroudering.
De senescentie cellen vertonen karakteristieke fenotypische en moleculaire kenmerken, zowel in de cultuur als in vivo. Deze senescentie markers kunnen ofwel de oorzaak of het resultaat zijn van senescentie inductie of een bijproduct van moleculaire veranderingen in deze cellen. Er wordt echter geen enkele marker specifiek gevonden in de senescentie cellen. Op dit moment, senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) detectie is een van de meest gekarakteriseerde en gevestigde eencellige methoden voor het meten van senescentie in vitro en in vivo. SA-β-Gal is een lysosomale hydrolase met een optimale enzymatische activiteit bij pH 4. Het meten van zijn activiteit bij pH 6 is mogelijk, omdat de senescentie cellen een verhoogde lysosomale activiteit vertonen23,24. Voor levende cellen wordt een verhoogde lysosomale pH verkregen door lysosomale alkalisatie met de vacuole H+-ATPase-remmer bafilomycine a1 of de endosomale verzuring remmer chloroquine25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) wordt gebruikt als substraat in levende cellen als het behoudt het gecleaved product in de cellen als gevolg van de 12 Carbon lipofiele stof25. Belangrijk is dat de SA-β-gal-activiteit zelf niet rechtstreeks verbonden is met een in de senescentie cellen geïdentificeerd traject en niet noodzakelijk is voor het induceren van senescence. Met deze test kunnen senescentie cellen worden geïdentificeerd, zelfs in heterogene celpopulaties en verouderings weefsels, zoals huid biopsieën van oudere individuen. Het is ook gebruikt om een correlatie tussen cel senescentie en veroudering van23 te laten zien, omdat het een betrouwbare marker is voor het detecteren van sencentie cellen in verschillende organismen en voorwaarden27,28,29, 30. Hier wordt een hoge doorvoer van de SA-β-gal-screeningtest op basis van het fluorescerende substraat C12FDG met behulp van primaire muis embryonale fibroblasten (mef's) met robuuste oxidatieve stress geïnduceerde celsenescentie beschreven en de voor-en nadelen ervan worden besproken. Hoewel deze test kan worden uitgevoerd met verschillende celtypen, het gebruik van Ercc1-deficiënte, DNA-herstel verminderde mefs zorgt voor een snellere inductie van senescentie onder omstandigheden van oxidatieve stress. Bij muizen, verminderde expressie van de DNA-reparatie endonuclease ERCC1-XPF veroorzaakt verminderde DNA-herstel, versnelde accumulatie van endogene DNA-schade, verhoogde ROS, mitochondriale disfunctie, verhoogde senescentie celbelasting, verlies van stamcel functie en vroegtijdige veroudering, vergelijkbaar met natuurlijke veroudering31,32. Evenzo ondergaan Ercc1-deficiënte mef's sneller senescentie in cultuur17. Een belangrijk kenmerk van de senescentie-MEF-test is dat elk goed een mengsel van senescentie-en niet-senescentie cellen heeft, waardoor een duidelijke demonstratie van senescentie-celspecifieke effecten mogelijk is. Hoewel we geloven dat het gebruik van oxidatieve stress in primaire cellen voor het opwekken van senescentie meer fysiologisch is, kan deze test ook worden gebruikt met cellijnen waar senescentie wordt geïnduceerd met DNA-schadelijke agentia zoals Etoposide of bestraling.

<table><tbody><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>medium</td></tr><tr><td>Ham's F10</td><td>Gibco</td><td>12390-035</td><td>medium</td></tr><tr><td>foetaal bovien serum</td><td>Tissue Culture Biologics</td><td>101</td><td>serum</td></tr><tr><td>1x niet-essentiële aminozuren</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td>aminozuren</td></tr><tr><td>bafilomycine A1&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B1793</td><td>lysosomaal remmer</td></tr><tr><td>C12FDG</td><td>Setareh Biotech</td><td>7188</td><td>b-Gal substraat</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>DNA intercalatie agens</td></tr><tr><td>17DMAG</td><td>Selleck Chemical LLC</td><td>50843</td><td>HSP90 remmer</td></tr><tr><td>InCell6000 Cell Imaging System</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>High Content Imaging System</td></tr></tbody></table>

op sa-β-galactosidase gebaseerde screeningstest voor de identificatie van senotherapeutische geneesmiddelen

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescentie is een van de kenmerken van veroudering bekend om een negatieve invloed op een gezonde levensduur. Geneesmiddelen die in staat zijn om de senescentie cellen te doden, specifiek in de celcultuur, de zogenaamde senolytica, kunnen de senescentie-celbelasting in vivo verminderen en de healthspan verlengen. Er zijn tot nu toe meerdere klassen van senolytica geïdentificeerd, waaronder HSP90 remmers, bcl-2 familie remmers, piperlongumine, een FOXO4 remmende peptide en de combinatie van Dasatinib/quercetine. Detectie van SA-β-gal bij een verhoogde lysosomale pH is een van de best gekenmerkte markers voor de detectie van senescentie cellen. Levende celmetingen van senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) activiteit met behulp van het fluorescerende substraat C12FDG in combinatie met de bepaling van het totale aantal cellen met behulp van een DNA intercalating Hoechst Dye opent de mogelijkheid om scherm voor senotherapeutische geneesmiddelen die ofwel de algehele SA-β-gal-activiteit verminderen door het doden van senescentie cellen (senolytica) of door het onderdrukken van SA-β-gal en andere fenotypes van senescentie cellen (senomorfen). Het gebruik van een high-content fluorescerende beeld acquisitie-en analyseplatform zorgt voor de snelle screening van medicijn bibliotheken met een hoge doorvoer voor effecten op SA-β-gal, celmorfologie en celnummer.

SA-β-gal activiteit kan worden gedetecteerd in cellen die worden geïnduceerd aan senesce door verschillende manieren van replicatieve uitputting, genotoxische en oxidatieve stress, naar oncogen activering23,25,38. In het huidige model met behulp van Ercc1-deficiënte muis embryonale fibroblast cellen, normoxic groei voorwaarden (20% O2) waren voldoende om te induceren cel senes...

Cellulaire senescentie is de belangrijkste factor in de ontwikkeling van chronische leeftijdsgebonden pathologieën. Identificatie van therapeutische middelen die gericht zijn op senescentie cellen tonen belofte voor het verlengen van gezonde veroudering. Hier presenteren we een nieuwe assay voor de identificatie van senotherapeutica op basis van meting van senescentie geassocieerde β-galactosidase activiteit in enkelvoudige cellen.

Op SA-β-galactosidase gebaseerde screeningstest voor de identificatie van Senotherapeutische geneesmiddelen

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

We beschrijven hier voor het eerst een methode die het mogelijk maakt high-throughput drug screening voor senotherapeutische verbindingen die gunstig zijn gebleken bij veroudering-gerelateerde ziekten. In feite zijn verschillende klinische studies met geneesmiddelen getest in deze essentie momenteel aan de gang. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om onderscheid te maken tussen twee soorten senotherapeutische geneesmiddelen, senolytica en senomorphics, met behulp van de gevestigde detectie van SA-beta-Galactosidase in senescente cellen.Deze techniek is een belangrijk screeningsinstrument voor nieuwe senotherapeutische verbindingen. In feite, verschillende verbindingen die zijn geïdentificeerd met behulp van dit scherm zijn opgenomen in verschillende high-profile publicaties, en zijn momenteel in klinische proef. Deze techniek is zeer veelzijdig en kan worden aangepast aan verschillende hoge doorvoerschermen.In feite is het mogelijk om multiplex schermen, en het scherm voor verbindingen die senescentie onderdrukken via de activering of remming van een van de verschillende trajecten. Hak elk embryo in stukken van één millimeter en pijp het meerdere keren op en neer. Voeg

sa-galactosidase-based-screening-assay-for-identification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes the high throughput colorimetric screening assay, sulforhodamine B assay, to measure drug-induced cytotoxicity in cancer cells. The assay determines the drug resistance by measuring the cell density based on the cellular protein content.

Sulforhodamine B Assay: A Sensitive Assay to Measure Drug Resistance Via Determination of Cellular Protein Content in Cancer Cells

In this video, we describe a simple and robust method to determine the cytotoxic potential of a trypanocidal drug against a parasite, Trypanosoma cruzi, expressing the β-galactosidase enzyme. β-galactosidase serves as a cell lysis indicator, and its activity can be used to assess the effects of the drug.

&beta;-Galactosidase Assay to Evaluate Drug-Induced Cytotoxicity in Parasites

This video illustrates a flow cytometry-based assay for quantifying therapy-induced senescent cancer cells with dual senescence markers. The detection and quantification of senescent cells involve using a β-galactosidase substrate. The substrate is cleaved by active lysosomal β-galactosidase within the senescent cells, producing a fluorescent product that, in conjunction with autofluorescent lipofuscin granules, marks the senescent cancer cells.

Flow Cytometry-Based Quantification of Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

This video demonstrates an in vitro assay utilizing β-glucans to activate microglial cells for the production of superoxide radicals, a reactive oxygen species. In brain cancer cells, the generated reactive oxidants actively suppress tumor cell proliferation and induce cell death.

An Assay for Analyzing Test &beta;-Glucan as an Immunotherapy Strategy against Brain Cancer Cells

Of veroudering voorkomt of bevordert het ontstaan ​​van tumoren blijft controversieel. Sinds chemotherapeutische drugs kankercellen ertoe kunnen bewegen senesce, studeren veroudering is essentieel voor het voorstellen van nieuwe therapieën. De standaard en breed gebruikt β-galactosidase test geeft belangrijke nadelen. We stellen hier een snelle en gevoelige flowcytometrie gebaseerde bepaling senescentie kwantificeren.

Een gevoelige methode om Senescent kankercellen kwantificeren

Hier presenteren we een kosteneffectieve methode voor het definiëren van chemisch-genetische interacties in knopgistende gist. De benadering is gebaseerd op fundamentele technieken in moleculaire biologie van gist en is zeer geschikt voor het mechanistische onderzoek van kleine tot middelgrote collecties chemicaliën en andere media-omgevingen.

Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Een efficiënte screening-protocol wordt gepresenteerd voor de identificatie van kleine moleculen ter bevordering van astroglial differentiatie in glioblastoma stamcellen (GSCs). De bepaling is gebaseerd op een stamcel differentiatie verslaggever waarbij de expressie van de verbeterde GFP (eGFP) wordt gedreven door de menselijke promotor van het algemeen kaderakkoord voor vrede.

Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen

De glioomstamcellen (GSC's) zijn een klein deel van de kankercellen die een essentiële rol spelen bij tumorinitiatie, angiogenese en medicijnresistentie bij glioblastoom (GBM), de meest voorkomende en verwoestende primaire hersentumor. De aanwezigheid van GSC's maakt de GBM zeer refractair voor de meeste individuele gerichte middelen, dus screeningmethoden met hoge doorvoer zijn vereist om potentiële effectieve combinatietherapieën te identificeren. Het protocol beschrijft een eenvoudige...

Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen

Een protocol voor fluorescerende, flowcytometrische kwantificering van senescente kankercellen geïnduceerd door chemotherapiegeneesmiddelen in celkweek of in muizentumormodellen wordt gepresenteerd. Optionele procedures omvatten co-immunostaining, monsterfixatie om grote batch- of tijdpuntanalyse te vergemakkelijken en de verrijking van levensvatbare senescente cellen door flowcytometrische sortering.

Verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie

Hier beschrijven we een gistsysteem dat menselijke γ-secretase reconstrueert. Dit systeem maakt het mogelijk om mutaties die de activiteit beïnvloeden te identificeren en te bestuderen en om γ-secretaseremmers (GSI's) te screenen. Door gebruik te maken van het functieverlies van familiale mutanten voor de ziekte van Alzheimer, is het mogelijk om te screenen op γ-secretasemodulatoren (GSM's).

Saccharomyces cerevisiae Modellen van de ziekte van Alzheimer om genen, mutaties en chemicaliën te screenen die de productie van amyloïde bèta beïnvloeden door γ-secretase

Dit protocol biedt gereflecteerd licht confocale microscopie voor objectieve, enkelceldetectie van senescence-geassocieerde bèta-galactosidase (SA-β-gal) activiteit in de stromale vasculaire fractie die is geïsoleerd uit menselijk vetweefsel. De methode is compatibel met immunocytochemie, bevat pH-controles voor kwantitatieve beoordeling en biedt bovendien een gevoeliger en minder subjectief alternatief voor conventionele SA-β-gal kleuring.

Senescentiedetectie met behulp van gereflecteerd licht in de vetachtige stromale vaatfractie

Leer een high-throughput screeningsmethode voor senotherapeutische geneesmiddelen die senolytica en senomorfica onderscheidt via SA-beta-Galactosidase-detectie in senescente cellen. Deze techniek identificeert veelbelovende verbindingen voor ouderdomsgerelateerde ziekten.

Op SA-β-galactosidase gebaseerde screeningstest voor de identificatie van Senotherapeutische geneesmiddelen

Meer video's verkennen