Op SA-β-galactosidase gebaseerde screeningstest voor de identificatie van Senotherapeutische geneesmiddelen

We beschrijven hier voor het eerst een methode die het mogelijk maakt high-throughput drug screening voor senotherapeutische verbindingen die gunstig zijn gebleken bij veroudering-gerelateerde ziekten. In feite zijn verschillende klinische studies met geneesmiddelen getest in deze essentie momenteel aan de gang. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om onderscheid te maken tussen twee soorten senotherapeutische geneesmiddelen, senolytica en senomorphics, met behulp van de gevestigde detectie van SA-beta-Galactosidase in senescente cellen.

Deze techniek is een belangrijk screeningsinstrument voor nieuwe senotherapeutische verbindingen. In feite, verschillende verbindingen die zijn geïdentificeerd met behulp van dit scherm zijn opgenomen in verschillende high-profile publicaties, en zijn momenteel in klinische proef. Deze techniek is zeer veelzijdig en kan worden aangepast aan verschillende hoge doorvoerschermen.

In feite is het mogelijk om multiplex schermen, en het scherm voor verbindingen die senescentie onderdrukken via de activering of remming van een van de verschillende trajecten. Hak elk embryo in stukken van één millimeter en pijp het meerdere keren op en neer. Voeg vervolgens 10 milliliter groeimedium toe aan de weefsels van elk embryo.

Plaat ze in een 10 centimeter cultuur schotel, en uitbroeden bij 37 graden Celsius in 3%zuurstof en 5% kooldioxide voor twee tot drie dagen. En de rest van elk embryo inbroeden met 0,25% trypsine EDTA mengsel gedurende 10 minuten. Om cellen te trypsinize, eerst, verwijder voorzichtig het groeimedium en was de cellen met 10 milliliter 1X PBS tweemaal.

Voeg vervolgens twee milliliter van een 025 trypsine EDTA-oplossing toe aan de cellen en broed ze twee tot drie minuten uit bij 37 graden Celsius. Inspecteer vervolgens de cellen onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen van het oppervlak worden losgemaakt. Voeg dezelfde hoeveelheid groeimedium toe om de trypsinevertering te beëindigen en breng de cellen over naar een conische buis.

Dan, centrifugeren de cellen op 200 keer G gedurende drie minuten. Gooi de supernatant weg en voeg een vers groeimedium toe om de cellen opnieuw op te schorten. Tel vervolgens de cellen en zaad ze in nieuwe platen op de geprojecteerde celdichtheid.

Voor niet-senescente subteelt, ten eerste, splitconfluent cellen op een een-op-vier verhouding. Dan incubeercellen op 37 graden Celsius in 3%zuurstof en 5% kooldioxide uit te breiden voor een andere passage. Vervolgens, om cel senescentie induceren, zaad split samenvloeiing cellen uit passage een op een verhouding van een tot vier en broeden ze op 37 graden Celsius in 20% zuurstof en 5% kooldioxide milieu voor drie dagen.

Om cellulaire senescentie te monitoren, met een geavanceerd Coulter Cell Counter-systeem, meet u de geleidelijke toename van de celdiameter en het celvolume tijdens elke trypsinisatiestap. Om te beginnen bèta-Gal screening test, zaad 5,000 senescente cellen of 3, 000 niet-senescente cellen per goed in 96 goed platen. Voeg vervolgens 100 microliter groeimedium toe aan elke put en incubbate cellen bij 37 graden Celsius en 20% zuurstof en 5% kooldioxide gedurende zes uur.

Voeg vervolgens verdunningen toe aan MEF-cellen en broed de cellen in op 37 graden Celsius in 20% zuurstof en 5% kooldioxide gedurende 24 tot 48 uur. Na incubatie, verwijder de medicijnoplossing en was cellen met 100 microliters van 1X PBS. Om lysosomale alkalinisatie te induceren, pre-treat cellen met 90 microliters van bafilomycine A1 oplossing, verdund in verse celkweek medium met een uiteindelijke concentratie van 100 nanomolar.

Dan, incubeercellen op 37 graden Celsius in 20% zuurstof en 5% kooldioxide milieu voor een uur. Voor fluorescentieanalyse van SA-beta-Gal activiteit, maak een verse werkoplossing van C12FDG verdund in groeimedium, bij een uiteindelijke concentratie van 100 micromolar. Voeg vervolgens 10 microliter van de werkoplossing toe aan het kweekmedium bij een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar en incubeercellen bij 37 graden Celsius in 20% zuurstof en 5% kooldioxide gedurende twee uur.

Was cellen met 100 microliter van 1X PBS. Voeg vervolgens twee microliters van een 100 microgram-per-milliliter Hoechst 33342 kleurstof toe bij een uiteindelijke concentratie van twee microgram per milliliter. Incubeer de cellen op 37 graden Celsius, 20%zuurstof, en 5% kooldioxide gedurende 20 minuten.

Na incubatie, verwijder de media, voeg 100 microliters van vers groeimedium, en ga naar beeldvorming. In deze studie, een hoog-gehalte fluorescerende beeld verwerving en analyse platform toegestaan voor de identificatie van senolytische geneesmiddelen, zoals 17-DMAG, dat verminderde de totale SA-beta-Gal activiteiten in murine embryonale fibroblast celculturen met senescent cellen in passage vijf. De door software gegenereerde kwantitatieve analyses van mengsels van senescente en niet-senescente cellen zorgen voor een duidelijke demonstratie van senescente celspecifieke effecten, en de eliminatie van bèta-galactosidaseactiviteit op de achtergrond door bafilomycine A.Zorg ervoor dat alle noodzakelijke celcontroles zijn opgenomen, met name onbehandelde senscente cellen en senescente cellen die met een positieve controle worden behandeld.

Dit essay omvat het werken met primaire cellen onder oxidatieve stress, wat kan leiden tot variatie die moet worden gecontroleerd. Deze procedure is de eerste stap in de detectie van senotherapeutische geneesmiddelen. Extra cel levensvatbaarheid en cel senescent essays moeten worden uitgevoerd om de screening resultaten te bevestigen.

Verschillende nieuwe senolytische geneesmiddelen zijn gedetecteerd met behulp van dit essay, met inbegrip van de eerste senolytische drug combinatie dasatinib quercetine, hitteshock eiwit 90 remmers, Bcl-2 familie remmers, en de polyfenol fisetin.